Name: 키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 배우세요 키나제 억제제에 대한 내성 돌연변이를 식별하고 검증하는 방법입니다. 무작위 돌연변이 라이브러리를 생성하여 암 치료의 유전적 내성 메커니즘을 이해하고 향후 약물 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) 및 백혈병 연구 재단의 석사 장학금으로 지원되었습니다. 석사는 V-재단으로부터 V-Scholar 상을 수상했습니다. 저자들은 편집을 해준 Sara Rohrabaugh 박사에게 감사하고 있습니다.

참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 동물의 윤리적 인 치료 및 관리를위한 건강 지침 국립 연구소에 따라 수행하고, 승인 된 IACUC 동물 사용 프로토콜에 따라되었다. 1. 세포주 유지 보수 <ol><li> RPMI-1640 배지에서 배양 BAF3 세포는 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 단위 / ㎖ 및 100 ㎍ / ml) 및 WEHI 세포의 소비 배지를 보충. 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 DMEM에서 HEK293T 세포 성장 (100 단위 / ㎖ 및 100 ㎍ / ㎖). 5 % CO2를 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 세포를 유지한다. </li></ol> 2. 플라스미드 건설 <ol><li> 마우스 JAK2과 LR에 의해 pMSCV - 퓨로-GW에서의 발암 성 이성체 JAK2-V617F 표준 재조합 복제 절차를 사용하여 clonase을 복제. </li><li> 루시 페라 제 발현 벡터 (pMSCV 뤽 - 체리-GW)의 건설에-VI를에 사용VO 이미징, 사용 pENTR 뤽를 생성 pENTR-SD-TOPO의 복제와 다음 프라이머 (FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC가 LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG 및 LUC-SD를 /)를 사용하여 PCR에 의해 pLVX - 구정-ON 벡터에서 루시 페라 제를 증폭 LR의 clonase를 사용하여 재조합 매개 복제에 의해 레트로 바이러스 벡터, pMSCV - 체리-GW에서 루시 페라 제 유전자를 전송합니다. </li></ol> 무작위 돌연변이 라이브러리 3. 준비, 돌연변이를 검사 및 확인 3.1) 무작위 돌연변이 유발 <ol><li> JAK2 야생형 및 상업 재조합 복제 기술을 사용하여 pMSCV - 퓨로-GW의 레트로 바이러스 벡터에 V617F 돌연변이의 클론 전체 길이. </li><li> , 변형 JAK2-V617F 플라스미드 DNA 1 μg의 사용 XL-1 레드, E. 따라서이를 복제 중에 랜덤 돌연변이를 도입 할 수 있도록 DNA 복구 메카니즘에서의 결함이 콜라이 세포. 보다 구체적으로는, 50 혼합 - DNA 100 NG를 10 (DNA의 100 개 이상의 NG는 변환 효율을 감소)0 사전 냉장 폴리 프로필렌 튜브에서 적격 세포의 μL 부드럽게 매 5 분 소용돌이, 30 분 동안 얼음 위에서 배양 하였다. 좋은 라이브러리 커버리지를 들어, 유능한 세포의 4-6 튜브를 사용합니다. 참고 : DNA의 100 개 이상의 NG는 변환 효율을 감소 </li><li> 45 초의 열 쇼크를 위해 42 ℃에서 수조에 담금 튜브를 2 분 동안 얼음 위에서 배양한다. 이어서, SOC 배지 1 ㎖ (2.0 % 트립 톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.05 %의 NaCl, 10 mM의 MgCl2를, 10 mM의 황산, 0.4 % D- 글루코스)를 추가한다. 90 분 동안 225-250 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 인큐베이션 튜브. </li><li> 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린을 포함하는 4 개의 10cm LB 한천 플레이트에 각 튜브에서 플레이트 세포. 37 ° C에서 24 시간 - 16 접시를 품어. </li><li> 눈에 보이는 식민지 다음, 멸균 판 스크레이퍼로 판을 긁어를 수집합니다. 상업용 플라스미드 추출 키트를 이용하여 각 플레이트로부터 분리 된 플라스미드 DNA 풀 셀. 일반적으로 식민지가 작고로 18 ~ 24 시간이 걸릴 : 주볼이 느린 성장 균주이기 때문이다. 이 단계에서, 예를 Sau 3A1 또는 Taq1 또는 순서로 자주 커터 제한 효소에 의해 라이브러리의 돌연변이의 이질성을 평가. </li></ol> 레트로 바이러스 상층 액과 형질 3.2) 생산 <ol><li> 하루 트랜 플레이트 10 % FCS, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민을 함유하는 DMEM에서 100cm 접시 상 4 × 106 HEK 293T 세포의 전. </li><li> 다음 날, 매체를 교체하고 돌연변이 pMSCV-JAK2-V617F 라이브러리와 세포를 형질. 각 10cm 접시를 들어, 무 혈청 DMEM 미디어를 사용하여 400 μL의 총 부피에 트랜 스펙 션을 위하여 Fugene의 40 μL와 DNA의 10 μg의 (플라스미드 라이브러리의 5 μg의 및 레트로 바이러스 포장 플라스미드의 5 μg의, pCLEco)를 섞는다. 실온에서 20 분 동안 혼합 지질과 DNA를 부화. 20 분 후 HEK293T 세포의 상단에 현명한 DNA 지질 복잡한 드롭을 추가합니다. </li><li> 여섯 시간 후, 형질 감염 매체 w 변경i 번째 신선한 미디어는 바이러스 생산을 위해 37 ° C에서 48 시간 동안 접시를 품어. 배양 48 시간 후, 0.45 μm의 acrodisc 필터로 여과 바이러스 상층 액을 모은다. </li></ol> 체외에서 저항하는 클론의 3.3) 선택 <ol><li> 약제 내성 JAK2-V617F 돌연변이를 들어, 0.5-1 X10 (6)의 바이러스 역가를 갖는 바이러스 상층 액을 100㎖로 100,000,000 BAF3 세포를 형질 도입. 보다 구체적으로, 10 %의 혈청을 함유하는 RPMI 매체를 사용하여 300 ㎖의 전체 부피로 바이러스 상등액 100 ㎖, 및 polyberene에 24 ㎍ / ㎖ (ployberene의 최종 농도가 8 ㎍ / ㎖의 경우)로 108 세포를 혼합한다. 여러 여섯 잘 접시 (4-5 ml의 웰 당)이 셀 믹서를 배포합니다. </li><li> 25 ° C에서 90 분 동안 1,250 XG에서 접시를 원심 분리기. 원심 분리 후, 24 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양한다. </li><li> 다음 날, 함께 세포 수영장과 Ruxolitinib과 매체가 부드러운 한천을 함유하는 혼합시에 도금X 잘 접시. 각각의 약물 농도를 들어, 50 ㎖ 튜브에서 Ruxolitinib 적당량 BAF3 형질 세포 (10-20000000 세포) 10 ㎖를 혼합한다. RPMI 20 % 혈청을 포함하여 40 ml의에 볼륨을 확인합니다. 여섯 잘 접시에 mixcarefully, 셀에 1.2 % 한천의 10 ML을 추가하고 판. </li><li> 2 주 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 0.2 ml의 피펫 팁 및 하위 문화들을 3 ~ 4 일 동안 개별적으로 24 웰 플레이트를 사용하여 저항하는 식민지를 선택합니다. </li><li> 실온에서 450 분 동안 다섯 XG에서 원심 분리하여 세포 내성 BAF3 수확. 상업용 게놈 DNA 분리 키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리. PCR은 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG 및 mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG)과 고 충실도 PCR 시스템을 확장 긴 템플릿의 100 NG에서 전체 길이 JAK2의 cDNA를 증폭. </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분리. JAK2 부호화 프레임을 나타내는 DNA 밴드의 3.4 kb의 절제 및 DNA를 분리상업용 겔 추출 키트를 사용. 시퀀스 8 내부 프라이머 (P1 - P8)을 사용하여 cDNA를 전 길이 상용 소프트웨어를 사용하여 암호화 서열에 걸친 서열 분석. </li></ol> 내성 돌연변이 4. 체외 검증 많은 세포 클론은, 저항의 각 변이 표현형의 기여를 주형으로 테스트 pMSCV-JAK2V-617F 플라스미드를 사용하여 부위 특이 적 변이에 의해 선택된 변이체를 생성하기 위해, 하나 이상의 돌연변이를 운반. <ol><li> 상용 돌연변이 유발 키트와 점 돌연변이를 만들 수 있도록 설계 올리고 뉴클레오티드를 사용 pMSCV-JAK2-V617F 플라스미드에 사이트 돌연변이 유발을 수행합니다. 염기 서열 돌연변이 클론의 ID를 확인합니다. </li><li> 레트로 바이러스와 BAF3 세포를 형질 도입은 선택이 1μg / ㎖에서 퓨로 마이신을 사용하여 다음 돌연변이 플라스미드를 사용했다. </li><li> 플레이트 (10) 4-BAF3 JAK2-V617F 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 (10 % FCS와 RPMI 50 μL). 별도37 ° C에서 60 시간 동안 플레이트를 (0, 1, 3, 5, 10 및 20 μM 최종 농도) 및 LY는 부화 플레이트 웰에 걸쳐 ruxolitinib 함유 배지의 50 μL를 추가한다. </li><li> 2-4 시간 동안 37 ℃에서 배양하여 각 웰을 다음에 WST-1 시약 10 μl를 첨가하여 세포 생존율을 평가. 플레이트 판독기를 사용하여 A450 흡광도로 기록. 세중 플롯의 모든 분석을 수행는 INCB018424 농도에 대한 흡광도를 평균. 비선형 커브 피팅 알고리즘을 사용하여 최적의 S 자형 곡선을 수행합니다. 셀룰러 IC50 50 %의 세포 생존율에 얻어진 약물 농도 점수. </li><li> 다음에, ruxolitinib의 농도를 증가시키고, 37 ℃에서 4-6 시간 동안 배양하여 10 %의 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 여섯 웰 플레이트에서 JAK2 변이체를 발현하는 BAF3 플레이트 육백 만 세포. </li><li> 4 ° C에서 다섯 분 동안 450 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 20 mM 트리스 - CL의 셀을 한 PBS와 시간,로 용해 워시 (PH 7.5), (50)mM의 염화나트륨, 1 % NP-40, 0.1 % SDS, 5mM의 EDTA, 1mM의 EGTA, 1 mM의 불소화 나트륨, 2 mM의 나트륨 바나 데이트, 5 % 글리세롤 프로테아제 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제가 보충. 5X 겔 로딩 완충액 (첨가하여 1 분간 세포 현탁액을 초음파 처리 350 mM의 트리스 -HCl [하여 pH 6.8], 500 mM의 DTT, 15 % SDS, 10 mM의 벤즈 아미 딘, 5 mM의 EDTA 5 mM의 EGTA, 5 mM의 나트륨 바나 데이트 , 단백질 분해 효소 칵테일, 50 % 글리세롤, 5 ~ 10 분 동안 70 ° C에서 0.001 % 브로 모 페놀 블루)과 변성. </li><li> 변성 조건에서 8 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에서 단백질을 해결합니다. 마우스 단일 클론 항 phopsho의 STAT5와 면역 블 수행합니다. 말을 벗기고 토끼 다 클론 항 SATA5 항체 reprobed. 공급 업체의 권고에 따라 ECL 시약을 사용하여 밴드를 시각화. </li></ol> 생체 검증 5. <ol><li> 루시 페라 제와 체리를 표현 BAF3 세포를 형질 도입 (pMSCV 뤽 - 쉐어 만든 레트로 바이러스 형질 도입JAK2-V617F 및 내성 변종을 표현하는 바이러스와 공예 GW). JAK2와 저항 변이의 발현에 대한 퓨로 마이신 선택 살아남 셀을 선택합니다. </li><li> 꼬리 정맥 주사를 통해 6을 Balb / C 마우스에 PBS 200 μL에 JAK2-V617F 및 내성 변종을 들고 이백만 적극적으로 성장 BAF3 룩 / 체리 세포를 주입한다. </li><li> 세포 이식의 삼일 후, 2 주 동안 하루에 두 번 Ruxolitinib (100 ㎎ / ㎏)와 마우스를 주입. </li><li> 촬상 시스템으로 루시 페라 제의 생물 발광 계 촬상을 수행한다. . <ol><li> 요컨대, 멸균 증류수 300 mg을 25 ㎖, 작은 볼륨 및 저장소 분취 루시페린을 용해시켜 용액을 제조. 참고 : -80 ° C에서 저장 루시페린과 사용할 때까지 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 각 마우스에서 125 ㎎ / ㎏을 달성하기 위해 IP에 의해 각 마우스에 250 μl를 주입한다. 함께 실드 박스에서 흡입 이소 플루 란 (1.5 % -2.0 %)을 사용하여 동일한 그룹에서 쥐를 마취. 일에 수의사 연고를 적용즉 안구 건조를 방지한다. 참고 : 마우스 걸리는 시간은 잠 (10 ~ 15 분) 피크에 루시페린 활동을 허용했다. 변화를 피하기 위해 그룹 간 일관된 시간을 유지합니다. </li></ol></li><li> 영상 실 단계로 즉시 마우스 이동 및 이미징 과정에서 1.5 % 이소 플루오 란에서 마취를 유지합니다. 순차 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60, 및 300 초의 노출 이미지 쥐. 이미지를 캡처하고 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하여 생물 발광 강도를 정량. 이미지가 케이지에 다시 마우스를 반환 다음. </li><li> , 생체 키메라 수확 총 bonemarrow 세포하십시오. 경추 탈구 다음 5 분 동안 CO 2와 쥐를 안락사. 수확 뼈 골수를 수집하는 차가운 PBS 4 mL에 호감. 형광 현미경 하에서 퍼센트 체리 양성 세포를 FACS 분석을 이용하여 정량화. 각 샘플에서 이만 이벤트를 수집합니다. </li></ol>

<ol><li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+plasticity+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li>
<li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li>
<li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li>
<li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+inhibitors%3A+insights+into+drug+design+from+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li>
<li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+%28STI571%29+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li>
<li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR%2FABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+%28STI571%29+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li>
<li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571%2Fimatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li>
<li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR%2FABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li>
<li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li>
<li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li>
<li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+research%22%5BJournal%5D)">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li>
<li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li>
<li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li>
<li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437(2012).</li>
<li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+cancer+journal%22%5BJournal%5D)">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138(2013).</li>
</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

임상 적 재발과 표적 유전자의 약제 내성 돌연변이의 출현 : CML 치료에 글리벡의 임상 성공은 작은 분자 억제제에 의해 루즈 키나제를 표적으로의 가능성 만 대상으로 치료도 발견 제한뿐만 아니라 보여 주었다. 저항 돌연변이의 식별 더 나은 임상 관리 및 차세대 억제제의 개발에 도움이됩니다. 이 프로토콜은 표적 유전자에 약제 내성 돌연변이를 확인하는 방법을 설명한다. 이 방법은 E. 내장 무작위 돌연변이 플라스미드 라이브러리를 사용하여 대장균, 돌연변이 단백질을 표현. 이어서 BAF3 라이브러리 세포 (종양 유전자에 의해 변환에 민감)에 도입되어, 화학 요법 제의 존재하에 세포 클론의 선택에 따라. 내성 클론에서 대상 유전자의 염기 서열은 저항을 부여하는 돌연변이를 식별합니다. 마지막으로, 사이트에서 재현 확인 된 돌연변이에 대한 유효성을 검증하는 돌연변이 지시약물 내성. 이 전략을 사용하여 우리는 각각 Ruxolitinib과 글리벡에 대한 내성...

단백질 키나제 겉보기 모든 세포 기능을 조절하는 세포 내 신호 전달 경로의 중요한 조절 효소이다. 키나제 매개 신호의 적절한 제어는 대부분 UPS에 의해 인산화 효소, 포스 및 성능 저하의 적절한 규제 (유비퀴틴 프로 테아 좀 시스템)에 의존 항상성 및 개발에 매우​​ 중요하다. 탈 조절 키나아제는 다양한 암의 중심 단계에있는 인간 숙주 질환 (1)의 연루. 인간 게놈은 직접 또는 간접적으로 결합 된 500 개 이상의 단백질 키나제, ~ 400에 인간이 질병을 인코딩한다. 이러한 관찰은 작은 분자 억제제 3-5로 키나아제의 치료 표적에 대한 개념을 지원했다. 만성 골수성 백혈병 (CML)의 치료에 이러한 글리벡과 같은 ABL 키나제 억제제의 데모는,이 방법 6,7에 대한 개념의 증거를 제공했다. 이러한 관찰뿐만 아니라 개미 혁명I-키나제 치료하지만 또한 골수 증식 성 신 생물 (MPN)과 진성 적혈구 베라 (PV) 환자에서 JAK2에서 발암 돌연변이의 발견으로 이어질 치료 타겟팅 다른 양성 질환의 유전 적 병변을 확인하기 위해 아이디어를 적용. 이 발견은 작은 분자 키나제 억제제 JAK2을 대상으로 MPNs 치료에 큰 관심을 생성합니다. 이제, JAK2 억제제 십여 임상 시험에 있고 그 중 하나는 골수 섬유증의 치료를 위해 최근에 승인되었다. 암의 작은 분자 억제제에 의한 발암 키나제의 표적화는 유망한 결과를 가지고 있지만, 또한 치료에 대한 내성을 발전에서 겪고있다. 사실, 지금까지, 환자는 대부분 약물 8-10을 대상으로 할 키나제 도메인에 돌연변이를 획득함으로써 이러한 글리벡, 게 피티 니브, 플라세보과 스 프라이 셀과 같은 키나제 억제제와 저항 돌연변이를 개발 한 처리. 유전자 돌연변이의 결과로서 저항 O 제한 강조F는 종양 키나제에 대한 단독 요법을 목표로하고, 더욱 성공적인 암 화학 요법의 개발에 다음 도전을 나타냅니다. 약물 내성의 기계적 및 기능적 결과는 선택과 약물 개발을위한 무료 화합물의 설계를위한 이론적 근거를 제공해야한다. 시험 관내 스크린을 통해 확인 된 돌연변이는 환자에서 발견되는 것들과 높은 상관 관계를 보여 주었다. 따라서, 임상 재발을 일으킬 가능성이 저항 패턴을 식별 전임상 또는 임상 개발 어시스트 주어진 약물 표적 쌍에 대한 약물 내성을 부여 돌연변이 시험 관내 스크리닝. 이러한 돌연변이 형태의 식별뿐만 아니라 약물 반응과 재발하지만보다 강력한 차세대 억제제의 설계를위한 필수적의 환자 모니터링에 도움이됩니다. 예, 다음 세대 BCR / ABL 억제제, 닐 로티 닙과 Ponatinib의 개발을위한 때문에 더 멕의 가능하게되었다hanistic 이해는 돌연변이 유발, 구조 및 기능 연구로부터 얻었다. 앞서 우리는 글리벡 11, 12, PD166326 (12), 및 AP24163 (13) 억제제에 대한 내성을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 공개 BCR / ABL의 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 우리의 화면의 결과를보고했다. 결과뿐만 저항 및 임상 질환 재발을 부여하는 돌연변이를 식별 할뿐만 아니라 약제 내성 및 키나제 기능을 관장 11,14 원리 기전 이해를 제공 하였다. 여기에서 우리는이 심사 전략의 광범위한 응용 프로그램을 사용하려면, 약물 표적 쌍으로 Ruxolitinib과 JAK2를 사용하여, 추가 방법 론적 세부 사항을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>세포 및 조직 배양&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3 세포</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C의 선물. GW</td><td>사내</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F. GW</td><td>사내</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/P58A. GW</td><td>메이드 인 하우스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>메이드 인 하우스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인 하우스 pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>메이드</td> 인 하우스 <td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>메이드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biological</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>프로타민 설페이트</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml 스톡</td></tr><tr><td>in water Trypan Blue 용액 (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinib)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 미크론 디스크 필터</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 미크론 나일론 세포 여과기</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>박테리아 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 빨간색 E. coli 세포</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml 스톡 솔루션&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>대단한 국물</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>키트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 혈액 및 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>긴 템플릿 PCR 시스템 확장</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 겔 및 PCR 세척 시스템</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>순수 수율 플라스미드 미니 준비 시스템</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>PCR 클로닝 시스템 pDONR 221 및 게이트웨이 기술을 사용한 시스템 OmniMAX 2 컴피턴트 셀</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&nbsp; LR 클로나제 효소 믹스&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>마우스 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferin 생체 내 등급</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 인슐린 주사기 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 및 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>기기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, NAPCO 시리즈 8000 WJ CO2 인큐베이터</td><td>, Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 스윙 버킷, 로터, 원심분리기, 5810R</td>, <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10, 자동 세포 카운터</td>, <td>Bio-RAD</td><td></td><td>이것은 필요하지 않으며 세포 계수를 위해 표준 혈구 유도체를 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>

키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

만성 골수성 백혈병 (CML)의 구동 암에서 BCR / ABL의 발견 사실 효과적으로 CML 환자의 치료에 의해 암에서 키나제를 표적의 가능성을 보여, 글리벡의 개발 결과. 이러한 결과는 EGFR, B-RAF, KIT 및 PDGFRs 같은 다양한 다른 악성 종양에 연루 종양 키나제를 표적으로하는 약물 개발에 혁명을. 그러나, 항 - 키나아제 요법 하나의 주요 단점은 타겟 렌더링 약제 내성 돌연변이의 출현을 감소 또는 약물에 대한 친 화성을 잃어버린 것이다. 차세대 억제제를 개발하는 데 도움이뿐만 아니라 개인화 된 약을 사용 임상 관리에 자극을 제공뿐만 아니라 내성 변종에 의해 사용되는 메커니즘을 이해. 우리는 차세대 BCR / ABL 억제제 개발 도왔다 BCR / ABL에 저항을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 확인하는 레트로 바이러스 벡터 기반 스크리닝 전략을보고했다. Ruxoli 사용약물 표적 쌍으로 tinib과 JAK2, 우리가 JAK2 키나제의 무작위 돌연변이 라이브러리를 발현하는 마우스 BAF3 세포를 이용하여 체외 검사 방법에 대해 설명합니다.

유전 적 돌연변이의 출현 대상 방지 키나제 치료에 큰 도전을 포즈. 돌연변이 연구는 선택과 차세대 신약 개발의 디자인에서 쓸모있는 기계적인 기능적인 통찰력을 제공하는 외에, 또한 더 나은 임상 관리를 할 수 있으며 미래에 맞춤 치료에 더 도움이 될 수 있습니다. 이 실험에서, 우리는 JAK2-V617F 키나제에 ruxolitinib 저항 돌연변이 (그림 1)에 대한 검사를 표시합니다. 우리는 pMSCV - 체리-GW로 전체 길이 마우스 JAK2-V617FcDNA을 도입하여 pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway 벡터를 구축 하였다. 그것은 인해 시퀀스 바이어스 큰 유전자 조각과 관련된 제한 증폭하기 어려운로, PCR 인 방법의 가장 인기있는 선택을 통해 무작위 돌연변이를 개발하는 박테리아 숙주 (대장균 XL-1 빨간색 변형)을 사용하는 것이 좋습니다 . 무작위 돌연변이 DNA 라이브러리는 레트로 바이러스 생산 HEK293T 세포에 형질 감염시켰다. 이러한 돌연변이...

키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다.

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

이 절차의 전반적인 목표는 약물 내성 돌연변이를 식별하고 검증하는 것입니다. 이는 먼저 표적 종양유전자의 무작위 돌연변이 라이브러리를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 내성 클론의 출현에 대한 체외 스크리닝을 수행하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 내성 클론을 시퀀싱하여 내성 돌연변이를 식별하는 것입니다. 마지막 단계는 부위 유도 돌연변이 유발을 사용하여 돌연변이를 재현한 다음 in vitro 및 in vivo assay를 사용하여 내성 돌연변이를 검증하는 것입니다. 궁극적으로 주어진 약물 표적 쌍에 대해 임상적으로 관련된 약물 내성 돌연변이를 확인할 수 있습니다.ENU 또는 PCR 기반 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 편향되지 않고 PCR 기반 METAGENE ssis와 달리 이 기술은 종양 유전자의 크기나 유전자의 GC 함량에 국한되지 않는다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 분자 및 세포 생물학에 대한 지식이 부족하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다.신생아 발생 및 스크리닝 단계는 배우기 어렵습니다. 많은 사람들이 바이러스 생산, 세포 배양 및 반세포 배지에 대한 경험이 부족하기 때문입니다. 이 절차는 XL 1 적색 대장균 세포를 JAK 2 V 617 f 발암성 동형인 JAK 2 XL 1 적색 대장균 세포의 플라스미드 함유 플라스미드로 형질전환시키는 것으로 시작되며, 따라서 DNA 복구 메커니즘에 결함이 있어 복제 중에 무작위 돌연변이를 통합할 수 있습니다.50-100 나노그램의 플라스미드 DNA와 100 마이크로리터의 수용 세포를 사전 냉각된 폴리프로필렌 튜브에 혼합합니다. 100나노그램 이상의 DNA를 사용하면 형질전환 효율이 떨어지므로 사용하지 마십시오. 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 5분마다 부드럽게 소용돌이치며 도서관을 잘 커버합니다.4-6개의 competent cell 튜브를 사용하십시오. 폴리프로필렌 튜브를 섭씨 42도의 수조에 45초 동안 담근 다음 얼음에서 2분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 튜브에 1ml의 SOC 배지를 추가합니다.섭씨 37도에서 225-250RPM으로 90분 동안 흔들면서 튜브를 배양합니다. 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램을 포함하는 4개의 10cm LB 오거 플레이트에 있는 플레이트 셀. 플레이트를 섭씨 37도에서 16-24시간 동안 배양합니다.군락이 보이면 멸

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본...

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

여기, 우리는 다양 한 세포 모델에서 신호 경로 변경을 식별 하기 위해 항 체 배열에 대 한 프로토콜을 제시. 마약/산소/초 violet 빛/방사선, 또는 overexpression/downregulation/녹아웃, 한 이러한 변경 사항을 다양 한 질병 모델에 대 한 중요 하 고 치료 효과가 있을 것입니다 또는 약물의 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 여부를 나타낼 수 있습니다. 저항입니다.

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

여기서는 용량 증가 방식을 이용한 항암저항성 세포 생성 프로토콜을 제시하고, 이어서 후생유전학적 조절자를 표적으로 하는 집중된 sgRNA 라이브러리를 이용한 CRISPR/Cas9 기반 스크리닝을 통해 획득된 화학저항성 조절자를 규명합니다. 프로토콜은 또한 항암저항성 세포 모델에 맞춘 여러 최적화 포인트를 제공하여 내성 메커니즘을 연구하는 연구자들에게 견고한 틀을 제공합니다.

화학저항성 세포에 대한 후생유전체 전체 CRISPR-Cas9 기반 녹아웃 스크리닝

배우세요 키나제 억제제에 대한 내성 돌연변이를 식별하고 검증하는 방법입니다. 무작위 돌연변이 라이브러리를 생성하여 암 치료의 유전적 내성 메커니즘을 이해하고 향후 약물 개발에 활용할 수 있습니다.

키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법

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