키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 약물 내성 돌연변이를 식별하고 검증하는 것입니다. 이는 먼저 표적 종양유전자의 무작위 돌연변이 라이브러리를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 내성 클론의 출현에 대한 체외 스크리닝을 수행하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 내성 클론을 시퀀싱하여 내성 돌연변이를 식별하는 것입니다. 마지막 단계는 부위 유도 돌연변이 유발을 사용하여 돌연변이를 재현한 다음 in vitro 및 in vivo assay를 사용하여 내성 돌연변이를 검증하는 것입니다. 궁극적으로 주어진 약물 표적 쌍에 대해 임상적으로 관련된 약물 내성 돌연변이를 확인할 수 있습니다.

ENU 또는 PCR 기반 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 편향되지 않고 PCR 기반 METAGENE ssis와 달리 이 기술은 종양 유전자의 크기나 유전자의 GC 함량에 국한되지 않는다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 분자 및 세포 생물학에 대한 지식이 부족하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다.

신생아 발생 및 스크리닝 단계는 배우기 어렵습니다. 많은 사람들이 바이러스 생산, 세포 배양 및 반세포 배지에 대한 경험이 부족하기 때문입니다. 이 절차는 XL 1 적색 대장균 세포를 JAK 2 V 617 f 발암성 동형인 JAK 2 XL 1 적색 대장균 세포의 플라스미드 함유 플라스미드로 형질전환시키는 것으로 시작되며, 따라서 DNA 복구 메커니즘에 결함이 있어 복제 중에 무작위 돌연변이를 통합할 수 있습니다.

50-100 나노그램의 플라스미드 DNA와 100 마이크로리터의 수용 세포를 사전 냉각된 폴리프로필렌 튜브에 혼합합니다. 100나노그램 이상의 DNA를 사용하면 형질전환 효율이 떨어지므로 사용하지 마십시오. 얼음 위에서 30분 동안 배양하고 5분마다 부드럽게 소용돌이치며 도서관을 잘 커버합니다.

4-6개의 competent cell 튜브를 사용하십시오. 폴리프로필렌 튜브를 섭씨 42도의 수조에 45초 동안 담근 다음 얼음에서 2분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 튜브에 1ml의 SOC 배지를 추가합니다.

섭씨 37도에서 225-250RPM으로 90분 동안 흔들면서 튜브를 배양합니다. 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램을 포함하는 4개의 10cm LB 오거 플레이트에 있는 플레이트 셀. 플레이트를 섭씨 37도에서 16-24시간 동안 배양합니다.

군락이 보이면 멸균 플레이트 스크레이퍼로 플레이트를 긁어 수집합니다. 각 플레이트에서 세포를 풀링합니다. 그 후, 상용 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하고, 라이브러리 내 돌연변이의 이질성을 10%FCS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 2밀리몰 L-글루타민을 함유하는 DM EM의 100mm 접시에 형질주입 플레이트(transfection plate) 하루 전, 10배에서 6번째 HEK 2 93 T 세포의 4배로 염기서열분석을 통해 평가합니다.

다음 날, 각 100mm 접시에 대해 transfection 시약을 준비합니다. 5마이크로그램의 플라스미드 라이브러리, 5마이크로그램의 레트로바이러스 패키징 플라스미드 및 40마이크로리터의 FU 유전자를 무혈청 DM E EM 배지를 사용하여 총 400마이크로리터의 부피에 혼합합니다. DNA와 지질 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다.

다음으로, HEK 2 93 T 세포의 배지를 새로운 배지로 교체하고 세포 위에 DNA 지질 복합체를 적가합니다. 섭씨 37도에서 6시간 동안 배양합니다. 6시간 후, transfection 배지를 새로운 배지로 교체하고 바이러스 생산당 섭씨 37도에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다.

48시간의 배양 후, 0.45마이크로미터 아크로 디스크 필터를 통해 여과된 바이러스 상층액을 수집하여 약물 내성 JAK 2 V 607 F 돌연변이가 레트로바이러스 상등액과 함께 BAF 3개 세포를 형질도입하는 스크리닝 및 식별 절차를 시작합니다. 10% 혈청과 폴리브레인을 함유한 RPMI 배지를 사용하여 1억 BAF 3세포와 100mL의 바이러스 상등액을 총 300ml의 부피로 혼합합니다. 이 세포와 바이러스의 상층 혼합물을 여러 개의 6웰 플레이트에 분배하고 각 웰을 4-5밀리리터로 채웁니다.

섭씨 37도에서 90분 동안 1, 250GS에서 플레이트를 원심분리합니다. 원심분리 후 다음 날 24시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하고 각 약물 농도에 대해 형질도입된 세포를 풀링합니다. 50ml 튜브에 10ml의 세포와 ruxolitinib을 혼합합니다.

이 예에서 테스트된 룩소리티닙의 농도는 1, 5, 2, 0.5 및 10마이크로몰입니다. 20% 혈청이 함유된 RPMI를 사용하여 40ml로 볼륨을 구성합니다. 세포에 1.2%auger의 10 밀리리터를 추가하고 6개의 웰 플레이트에 조심스럽게 도금합니다.

웰당 4밀리리터를 디스펜싱합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 2주 동안 배양합니다. 저항성 집락이 보이면 0.2ml 피펫 팁을 사용하여 집락을 선택하고 개별적으로 계대배양합니다.

24개의 웰 플레이트에서 3-4일 동안 실온에서 5분 동안 450GS의 원심분리를 통해 저항성 BAF 3개의 세포를 수확합니다. 상용 유전체, DNA 추출 키트를 사용하여 유전체 DNA를 분리한 후, PCR에 의해 유전체 DNA로부터 전장 JAK 2 CDNA를 증폭한다. 그런 다음 PCR 산물은 Agar Rose의 겔 전기영동과 3.4 KILOBASE DNA 밴드에 의해 분리됩니다.

JAK를 대표하는 2 코팅 프레임은 상용 젤 추출 키트를 사용하여 분리되어 있습니다. 마지막으로, 코딩 염기서열에 걸쳐 있는 8개의 내부 프라이머를 사용하여 전체 길이 CDNA의 염기서열을 분석하고, 약물 내성 돌연변이를 검증하기 위해 상용 소프트웨어를 사용하여 염기서열을 분석합니다. 시험관내(In vitro)에서 선택된 변이체는 JAK 2개의 V 617 F 서열의 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 생성되고 BAF 3개의 세포로 재도입됩니다.

다양한 농도의 룩소리티닙을 함유한 50마이크로리터의 배지를 플레이트를 가로지르는 웰에 별도로 추가하고, 플레이트 10에서 4번째 BAF 3개의 JAK 2개 V 617 F 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 60시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 세포 생존력을 평가하기 위해 각 웰에 10마이크로리터의 WST 시약 1개를 추가하고 섭씨 37도에서 2-4시간 동안 배양합니다. 플레이트 리더를 사용하여 450에서 흡광도를 기록합니다. 모든 분석을 3회에 걸쳐 수행하고 룩소리티닙 농도에 대한 평균 흡광도를 표시합니다.

비선형 곡선 피팅 알고리즘 점수를 사용하여 최적 맞춤 시그모이드 곡선을 수행합니다. 세포 IC 50으로 세포 생존율이 50%인 약물 농도는 내성 돌연변이의 생체 내 검증이 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수행됩니다. 무작위 돌연변이 유발에 의해 생성된 내성 세포 클론은 하나 이상의 돌연변이를 보유할 수 있기 때문에 이러한 돌연변이는 in vitro 및 in vivo 분석 모두에 의해 단독으로 검증되어야 합니다.

시험관 내 분석법에서, 선택된 변이체는 JAK two V 607 F 염기서열의 부위 지시 돌연변이 유발에 의해 생성되고 BAF 3 세포에 재도입된 후, IC 50 값을 평가하기 위해 다양한 용량의 룩소리티닙에서 세포 증식 능력을 측정했습니다. 또한, phosphotyrosine 또는 phospho STAT five에 대한 면역 블로팅은 off-target 매개 내성을 배제하기 위해 ruxolitinib의 용량을 증가시켜 배양한 BF three 세포의 단백질 용해물에 대해 수행되었습니다. 따라서 향상된 IC 50 값과 더 높은 ruxolitinib 농도에서 지속적인 자동 인산화를 나타내는 돌연변이는 in vivo 내성을 검증하기 위한 약물 내성 변이체로 확인되었습니다.

JAK 2개, V 6개, 17F 변이체 및 루시페라제 체리를 발현하도록 조작된 BF 3개의 세포를 마우스에 주입한 후 2주 동안 룩소리티닙을 주입했습니다. 2주 후. 마우스는 루시페라아제 촉매 생물 발광, 골수 및 말초 혈류의 BAF 3 키메라에 대해 이미지화하여 체리 양성 세포의 형광을 측정하여 평가했습니다.

그 결과, JAK two V 607 F를 발현하는 마우스는 룩소리티닙을 사용하는 반면, 내성 변이체는 치료 기간 동안 생물 발광이 점진적으로 증가하는 것으로 나타났습니다. 일단 숙달되면, 무작위 신생은 제대로 수행된다면 4-5일 안에 수행될 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 모든 약물 표적 쌍에 대한 체외 스크리닝을 위한 무작위 플라스미드, DNA 라이브러리를 개발하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

레트로바이러스로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 합니다.