Name: 병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 배우세요 병아리 배아에서 감각 뉴런을 분리하고 배양하는 신경과학 연구 방법을. 면역세포화학을 통해 뉴런 표지자를 확인하고 축삭 성장을 연구할 수 있습니다.

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우리는이 논문에 대한 통찰력있는 의견을 앨리슨 Philbrook, 벨린다 Barbagallo 마이클 프랜시스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 책에서보고 된 연구는 MLL에게 수여 R15 AREA 상 1R15NS070172-01A1에 의해 지원되었다.

1 커버 슬립 준비 : 산 세척 및 구워 <ol><li> 최소 2 일 전에 해부 (2 단계)로 된 커버를 준비하려면 다음 단계를 시작합니다. 오일과 철저하게 청소 된 커버를 제거 할 수있는 산 세척 단계를 수행합니다. </li><li> 수직으로 된 커버를 배치하고 서로 닿지에서 그들을 방지 도자기 홀더에로드 된 커버. 2 M 염산 (HCL)로 채워진 유리 조직 학적 용기에 홀더와 커버 슬립을 담근다. 도자기 홀더를 사용할 수없는 경우 또는, 100mm 유리 페트리 접시의 바닥을 커버하고 2 M 염산에 커버 슬립 잠수함 20 커버 슬립 수평 ~ 퍼졌다. </li><li> 흄 후드에서 로커 테이블 (산에 침수 된 커버와 함께) 유리 용기를 놓고 실온에서 적어도 5 시간 동안 락을 부드러운 수 있습니다. 또한, 산 세척 하룻밤 동일한 조건으로 된 커버. </li><li> 도자기 홀더로드 전송하여 증류수 H 2 O DH (2 O)로 된 커버를 세척dH보다 2 O. 가득 깨끗한 유리 조직학 컨테이너에 2 M 염산에서 커버 슬립과 함께 또한, 커버 슬립 유리 페트리 접시에서 2 M 염산을 가만히 따르다 및 dH보다 2 O.로 리필 </li><li> 다시 dH보다 2 O 경사 분리와 신선한 dH보다 2 O. 유리 용기를 리필하여 세척 3 빠른 세척 총 반복합니다. </li><li> 로커에 (커버 슬립와 dH보다 2 O) 유리 용기를 반환하여 더 이상 세척 요법을 시작합니다. 실온에서 10 ~ 30 분 동안 교반과에 대한 허용합니다. 그런 다음, dH보다 2 O를 가만히 따르다 신선한 dH보다 2 O. 추가 적어도 10 세척 총 반복합니다. 또한, 하룻밤 세척을 계속합니다. </li><li> 350 °의 C로 예열로에 세척 된 커버를 놓습니다. 도자기 홀더를 사용하는 경우, dH보다에서 2 O 채워진 유리 용기를 홀더를 제거하고 직접 용광로로 된 커버와 홀더를 배치합니다. 유리 페트리 접시를 사용하는 경우, dH보다 2 O를 가만히 따르다 및 furnac로 된 커버와 유리 접시를 배치전자. </li><li> 적어도 다섯 시간 밤새 350 ° C에 대한 커버 슬립 굽는다. </li><li> 굽​​기가 완료되면, 미세 집게로 도자기 홀더에서 커버 슬립을 제거하고 멸균 100mm 유리 페트리 접시에 놓습니다. 원래 유리 페트리 접시에서 도자기 홀더에 배치되지 않은 커버 슬립을 둡니다. </li></ol> 2 병아리 해부 및 DRGs의 분리 <ol><li> 비옥 제거 (부드러운 락으로 37-38.5 ° C에서 개최) 인큐베이터에서 화이트 레그혼 종 병아리 달걀을 벌였다. 참고 : 이전의 연구는 DRGs 2,8,11-13,16의 분리를 위해 배아 일 7-10 사용했다. </li><li> 층류 후드에서 선택한 계란을 넣습니다. 멸균 솔루션과 악기 층류 후드에서 무균 조건 아래 모든 절차를 실시한다. 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 모든 솔루션을 제공합니다. </li><li> 플라스틱 100mm 페트리 접시에 계란과 장소 내용을 균열. 또 다른 100mm 페트리 접시에 배아를 전송하는 표준 집게를 사용합니다. </li><l난&gt; 파스퇴르 피펫을 사용하여, 젖은 조직을 유지하기 위해 페트리 접시에 1X PBS를 따뜻하게 추가합니다. 미세 집게로 목을 집어 배아 목을 벨. 또 다른 깨끗한 100mm 페트리 접시에 몸을 전송합니다. </li><li> 따뜻한 F12HS10 추가 (햄 F12, 10 mM의 HEPES, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % 소 태아 혈청 0.1 mg)을 웨트 티슈를 유지 파스퇴르 피펫 가진 접시한다. 그 몸 윗면 (그림 1A)에 배아를 위치 집게를 사용합니다. </li><li> 층류 후드에서 양안 입체의 해부 현미경에 배아 조직을 포함 100mm 플라스틱 페트리 접시를 놓습니다. 심장, 폐 등의 장기를 노출하는 현상 진피를 집어 목 꼬리에서 수직 중간 선 절개를하여 미세 집게를 사용합니다. 대안 적으로, 내부 기관을 노출 작은 눈물 일련의 확인. </li><li> 부드럽게 멸균 미세 집게 2 세트 사용) 목을 잡고 b)는 꼬리를 향해 심장에 바로 위에있는 대동맥 또는 기타 조직을 잡고 끌어가,동물 eviscerating. </li><li> 조직에 파스퇴르 피펫 따뜻한 F12HS10을 적용합니다. 개발 갈비뼈, 척추 및 DRGs (그림 1B-1D)를 노출 남아있는 심장 혈관, 호흡기 나 소화 기관을 제거하는 집게를 사용하십시오. </li><li> 해부 현미경, 상기 리브 열등 요추 척추의 양쪽을 따라 DRGs를 장기를 제거하고 수집하는 미세 집게를 사용합니다. 배아에서 그대로 DRGs를 따 버릴에 의해 DRGs를 수집합니다. 핀치와 척수를 향해 DRG에서 도달하고 주변 또는 그 반대 방향으로 DRG에서 도달 개발 신경을 잡고 뿌리를 절단. </li><li> 따뜻한 F12HS10 가득 35mm 배양 접시에 그대로 DRGs를 놓습니다. 미세 집게로 집어 35mm 접시에 그대로 DRGs에서, 같은 DRGs에 부착했을 수 지느러미 또는 복부 뿌리로, 초과 조직을 제거합니다. </li><li> 요추 우수 DRGs를 얻으려면, 흉부 및 cervi의 복부의 절반을 제거칼 척추. 이것은 상부 경추 영역에서 척수 축과 상부 요추의 다른 절단 직교 현상 척주에서 절단함으로써 행해진 다. 그 후, 상처가 오른쪽 및 척주의 왼쪽 측면을 따라 척수 축에 평행하게. 드러내는에게 척수 (그림 1E-1 층) 노출 배아에서 척추의 복부 절반을 올립니다. </li><li> DRGs에 쉽게 액세스 할 수 있도록하려면, 미세 집게로 척수를 잡고 흉추 및 경추 척수를 제거합니다. 척추에서 척수를 들어 올릴 집게를 사용합니다. 근사화로서, 흉추 척수 리브의 수준이며 치경부는 리브 우수하다. </li><li> 미세 집게로 그대로 흉부와 경부 DRGs를 수집하고 다른 DRGs 따뜻한 F12HS10에 배치합니다. DRGs을 준수 할 수 초과 조직을 제거합니다. </li><li> 도움 F12HS10와 새로운 유리 파스퇴르 피펫의 내부를 씻어피펫의 벽에 달라 붙는 것을 DRGs를 방지 할 수 있습니다. 멸균 15 ML 원뿔 관에 작은 배양 접시에서 모든 DRGs 및 F12HS10를 전송하고 바로 3 단계로 진행하기 위해 세척 피펫을 사용합니다. NOTE : 추가 배아 DRGs의 수를 증가시키기 위해 해부된다. DRGs는 3 단계에 대한 준비가 될 때까지 37 ° C에서 F12HS10에 보관해야합니다. </li></ol> 3 해리, 풍성하게하고, 배양 DRG 뉴런 - 1 부 <ol><li> 그대로 DRGs 원심 분리기에 부드럽게와 장소 원뿔 관은 2 ~ 3 분 (200 XG)를 회전. DRGs 튜브의 바닥에 침몰 한 것을 확인합니다. 그렇지 않다면, 다시 스핀. </li><li> 피펫을 사용하여 부드럽게 방해받지 DRG 펠렛을 떠나 F12HS10를 제거합니다. DRGs의 펠렛을 빠지 1 배 칼슘과 마그네슘 무료 (CMF) PBS의 2 ML을 추가합니다. 다시 스핀 그대로 DRG 펠렛을 유지하면서 CMF PBS를 제거합니다. 다음 단계에서 트립신 소화 방해하는 F12HS10의 소 태아 혈청을 제거하기 위해 세척 세의 총이 세척 과정을 반복. </li><li> 2 ml의 CMF PBS와 DRGs를 포함하는 15 ML 튜브로 가온 트립신 2 ㎖를 추가합니다. 10 ~ 15 분 해리 세포로 DRGs를 소화하는 37 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브. </li><li> 배양하는 동안, F12H + 보충 함유 미디어를 만들 (햄의 F12, 10 mM의 HEPES 100 단위 / ml의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 NG / ㎖ NT3, 10 NG / ML NGF, 200 MM의 L-글루타민 및 N2)와 따뜻한 37 ° C의 물을 욕조에. 일반적으로, 전체 미디어의 10 ml의 기본 감각 뉴런의 4-5 35mm 요리에 충분하다. 또한 해동 라미닌 한 코팅 된 커버 (4 단계)에 대한을 시작합니다. </li><li> 시각적으로 부드럽게 씹다 P1000 피펫 트립신 용액 DRGs하고 그대로 DRGs의 부재에 대한 검사. 그대로 DRGs가 더 이상 눈으로 볼 때까지 분쇄를 계속 및 / 또는 그대로 DRGs가 해리 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 이상 트립신 배양을 위해 할 수 있습니다. , 손상 DRG 신경 세포를 보호 분쇄하는 동안 공기 방울을 방지하고 &lt;30 분에 트립신 소화를 제한합니다. </li><li> Centrifug해리 DRGs를 함유 펠렛을 형성하기 위해 3 ~ 5 분 동안 200 XG에서 트립신 E 튜브. 펠릿이 형성 될 때까지 필요한 경우 더 이상 봐. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 트립신을 대기음. 펠렛 F12HS10 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 P1000 피펫 팁 DRGs를 씹다. </li><li> 100mm 배양 접시에 15 ML 원뿔 관에서 모든 내용을 전송합니다. 10 ㎖의 총 시간에, 2 ml의 8 ML의 F12HS10 함께 튜브를 세척하여 배양 접시에 옮긴다. 이러한 세정 단계는 튜브의 벽에 부착 남아있는 세포를 수집 할 수 있습니다. </li><li> 100mm 배양 접시에 놓습니다 (10 ml의 F12HS10와 및 DRG 세포를 해리) 3 시간 동안 가습 37 ° C 배양기에. NOTE : HEPES는 CO 2의 부재 매체의 pH를 완충하기 때문에 CO 2 인큐베이터에 필요한 것은 아니다. 배양 중에 신경 교세포 느슨하게 폐해 침대에 부착하는 경향이 조직 배양 플라스틱 및 신경 세포의 표면에 결합한다. </li></ol> 4 코팅 산 세척라미닌-1와 구운 Coverslips는 <ol><li> 얼음에 냉동 라미닌-1의 멸균 분주 해동. </li><li> 멸균 조건 하에서, 라미닌 (1)의 50 μL 분취를 멸균 1X PBS 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 280 nm에서 라미닌 1의 흡광도 값을 획득하는 분광 광도계를 사용한다. 라미닌 (1)의 농도를 결정하기 위해 다음의 수학 식에이 값을 사용한다. </li></ol> ABS 280 = (농도 ㎎ / ㎖) * (단백질의 흡광 계수) 라미닌 1의 흡광 계수는 0.86이다. <ol start="4"><li> 멸균 조건 하에서, 1 ㎎ / ㎖, 20 ㎎ / ㎖의 농도를 얻었다 1X PBS로 라미닌 1 희석. 라미닌-1 배양 7,8,10 후 커버 슬립 (30 NG / cm 2 및 300 NG / 각각 cm 2)에 결합의 10 배의 차이를 달성하기 위해 라미닌-1이 두 적용 농도를 사용합니다. </li><li> 층류 후드에서, 하나의 산 세정하고, 구운 C를 배치 미세 겸자를 사용한 35mm 배양 접시의 바닥에 overslip. 필요한 접시의 수를 얻기 위해 필요한만큼 반복한다. </li><li> 추가 살균을 위해 20-30 분 동안 UV 광에 커버 슬립 대상. 이 단계에서 접시 뚜껑을 유지합니다. </li><li> 각각의 유리 커버 슬립을 준비 라미닌-1의 400 μl를 추가합니다. 커버 슬립의 전체 범위를 보장하기 위해 라미닌-1을 확산 피펫 팁을 사용합니다. 표면 장력은 라미닌-1은 커버 슬립에 남아 필요 배양 접시의 바닥에 전염되지 수 있습니다. </li><li> 접시에 뚜껑을 놓고 라미닌-1은 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 배양 할 수 있도록 (3 시간 최적입니다). </li><li> 라미닌 인큐베이션 한 후, 층류 후드에서 멸균 PBS로 무균 기술을 이용하여 커버 슬립을 헹군다. 커버 슬립에 솔루션을 제거하고 PBS 400 μl를 추가합니다. 5 ~ 10 분을 기다립니다. 세 린스의 총 반복합니다. </li><li> 마지막 헹굼 후 커버 슬립에 PBS를 남겨주세요. 세척시 표면 장력을 아프게하지 마십시오 된 커버가 건조 할 수 없습니다. 르준비가 될 때까지의 집결지 뚜껑 coverlip에 신경을 해리 판에. </li></ol> 5 해리, 풍성하게하고, 배양 DRG 뉴런 - 2 부 <ol><li> 배양 후, 부드럽게 해리 DRG 세포를 함유 100mm 접시의 바닥 린스 10 ㎖의 멸균 피펫을 사용한다. 부드럽게 약 3 분의 접시에 7 ㎖의 추방 ~ 피펫 도움으로 F12HS10의 7 ML을 당겨, 45 ° 각도 ~에서 요리를 잡습니다. 부드럽게 신경을 빠지, 배를 반복합니다. </li><li> 접시를 돌려 요리의 또 다른 3 분에, 또 다른 여섯 린스를 들어, 절차를 세척 반복합니다. 접시의 3 분의 나머지에 대해 다시 절차를 반복. 이러한 방식으로, 신경 세포를 부드럽게 제거 F12HS10로 접시의 전체 바닥을 헹군다. </li><li> 같은 피펫을 사용하여 15 원뿔 튜브에 100mm 접시에서 F12HS10 포함하는 신경 세포를 전송합니다. 세포 펠렛 200g에 5 ~ 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 방해받지 펠렛을 떠나 F12HS10를 제거합니다. 따뜻하게 F12H + 보충 2 ㎖로 재현 탁 펠렛. </li><l난&gt; 세포 밀도를 결정하는데 사용 혈구. </li><li> 원하는 도금 농도 (20 μg / ml의 라미닌 1 8,16으로 코팅 된 커버 1 μg / ml의 라미닌 1 40,000 세포 / ml로 코팅 된 커버 120,000 세포 / ml)를 수득 F12H + 보조제와 같은 필요한 세포를 희석. </li><li> 라미닌 - 코팅 된 커버에서 PBS를 제거하고 즉시 커버 슬립에 세포를 400 μl를 배치합니다. 조심스럽게 가습, 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에 접시를 전송합니다. 뉴런은 라미닌-1을 준수 할 수 있도록 3 시간에 적어도 1 시간까지 배양 할 수 있습니다. </li><li> 무균 조건에서 부드럽게 F12H + 보충 1.6 ml의 신경 세포를 포함하는 35mm 요리를 홍수. 참고 :이 때, 커버 슬립에 장력이 나눌 수 있습니다 표면. 신경 세포는 적절하게 커버 슬립에 라미닌-1에 부착했다. </li><li> 보육 밤새 배양 세포를 돌려줍니다. 다음과 같은 일 면역 세포와 같은 실험을 수행합니다. </li></ol> (6) Immunocytochemistry <ol><li> 면역 세포에 앞서, 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 정착 용액 (4 % 파라 포름 알데히드, 30 % 자당 2 배 PBS). 참고 : 세포를 고정하기 전에, 같은 netrin-1, 미네소타 2 +, 소닉 고슴도치, semaphorin 및 ephrin 16,29-31 등 다양한 시약으로 처리합니다. </li><li> 천천히 배양 접시에서 F12H + 보충의 2 ML 1 ㎖를 제거합니다. 부드럽게 따뜻하게 정착 용액 1 ㎖를 추가합니다. 10 ~ 15 분 동안 실온에서 배양 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 정착 솔루션을 제거하고 2 ㎖의 PBS를 추가합니다. PBS의 응용 프로그램으로 인해 고정 된 세포의 수 빠지을 피하고, 접시의 가장자리를 향해 솔루션을 적용합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 5 세척 총 PBS 세척을 반복합니다. 세포가 면역 세포의 단계에서 건조 할 수 없습니다. </li><li> PBS를 제거합니다. 솔루션 차단 1 ㎖ 적용 (0.1 % 트리톤-X를, 1X PBS, 5 % 정상 염소 혈청). 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 다르게는, 표면 분자 얼룩이용액 팔을 차단 트리톤-X를 사용하지 마십시오. </li><li> 제조의 추천되고 차단 솔루션에 기본 항체를 희석. NCAM에 대한 항체 (500)와 β1 인테그린 (16)을 활성화 : 1 사용합니다. 차단 솔루션을 제거 차 항체 용액 1 ㎖를 추가하고 실온에서 또는 하룻​​밤 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 차 항체 용액을 제거하고 1X PBS 2 ㎖를 추가합니다. 실온에서 5 ~ 10 분 동안 품어. 4 PBS 세척의 총 반복합니다. 필요한 경우 세척은 확장 할 수 있습니다. </li><li> 1 차 항체를 희석 : 1000을 차단 솔루션에. , PBS를 1 ㎖의 제거보기 차 항체 용액을 추가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 : 2 차 항체 광 감응성. 이 시점에서 최대한 어두운 용액과 세포를 유지. </li><li> 차 항체 용액을 제거하고 이전에 수행으로, 1X PBS로 5 배를 씻어. </li><li> Fluoromount의 ~ 60 ~ 80 μl를 적용현미경 슬라이드 위에 G. 미세 집게를 사용하여 부드럽게 현미경 슬라이드에 Fluoromount G에 접시와 하부 커버 슬립에서 커버 슬립을 들어 올립니다. 공기 방울을 피하십시오. </li><li> 스토어는 어둠 속에서 4 ° C에서 수평으로 슬라이드. 12 ~ 24 시간 후, Fluormount G는 중합하고 coverslip에 단단히 현미경 슬라이드에 첨부됩니다. 이 중합 단계 이후에 이미지의 세포가 완료됩니다. </li></ol>

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<li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li>
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<li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li>
</ol>

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여기에서 우리는 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시하고 배양은 병아리 배아에서 감각 신경 해리. 이 절차는 시험 관내 7,8,10,16의 고성장 신경 세포의 풍부한 인구를 생성합니다. 다수의 세포 및 분자 기술들은 여기에 설명 된 면역 세포를 포함하여 이들 배양 된 신경에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 최근 정량적 감각 성장 콘 8,16에서 immunolabeled 인테그린 활성화의 강도를 평가하기 위해 사용되었다. 이러한 선행 연구에서, 소프트웨어 프로그램이 정확하게 성장 원추의 원위 단부 20 미크론의 윤곽을 생성하기 위해 사용되었다. 개요는 NCAM 염색을 기반으로 만들어졌다. 뉴런의 NCAM 유비쿼터스 표현은 전체 성장 원추보다는 성장 원추의 제한된 부분을 식별하기 위해 소프트웨어 프로그램을 사용 가능. 이러한 성장 원뿔 윤곽이어서 관심 영역과 그 REGI 내 인테그린 염색 강도로 확인되었다관심에 소프트웨어에 의해 평가되었다. 이러한 방식으로, 목적 단백질의 강도...

뉴런은 감각, 비전, 모터 운동, 학습 및 메모리를 포함하는 다양한 기능에 필수적인 정보를 전달 복잡한 세포입니다. 다른 세포 유형에서 독특한는 뉴런 통신에 필수적인 신경 도로를 형성하도록, 아암 형상 프로세스라는 축삭을 연장. 성장 축삭의 끝에있는 개발 전문 구획 동안의 적절한 대상으로 축삭을 이끌 세포 외 신호의 콘서트를 탐색, 성장 콘을했다. 성장 콘 탐색의 기초가 복잡한 분자 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 더 나은 이러한 메커니즘을 이해하기 위해, 연구자들은 정의의 단순화 된 체외 환경에서 뉴런을 연구하기 위해 세포 배양 모델을 사용하고 있습니다. 신경 세포의 분화 2, 세포 골격 역학, 엔도 시토 시스와 인신 매매, 덴 드라이트 (dendrite) : 문화 1에서 공부 뉴런을 포함, 신경 세포 생물학에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 주도하고있다규제 3,4, 축삭 재생 5, 및 신경 병증 6 임상 조건. 또한, 배양 된 신경 세포는 면역 세포, 세포 표면 공동 - 면역 침전, 웨스턴 블롯, 형질 감염, RNAi에, 이러한 성장 콘 운동성 인터벌 분석과 같은 라이브 영상을 포함한 연구 기법의 넓은 범위에 높은 의무이다. 따라서, 차 뉴런을 배양하여 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 규명 할 수있는 강력한 방법이다. 세포 배양 모델은 환경 조건 및 변수를 세부적으로 제어 수사관을 제공합니다. 예를 들어, 신경 도금 (시 및 성장)이되는 하층이 쉽게 조작 할 수있다. 여기서 우리는 두 가지 하층 낮은 라미닌-1 농도가 하나 라미닌-1의 농도를 포화와 다른 생성에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 놀랍게도, 동일한 분자의 다른 농도 극적인 효과를 가질 수있다뉴런의 내부 상태뿐만 아니라 세포 표면에 조성물. 예를 들어, 인테그린의 캠프 및 표면 수준의 세포 내 수준이 두 하층 7,8에 도금 뉴런에서 크게 다르다. 추가 연구는 피브로넥틴 및 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, 충격 세포 표면 분자의 발현 및 신경 운동성 7-11을 포함하는 다른 분자를 보여 주었다. 또한, 예컨대도 세포막 조성물 및 신경 운동성 12-16 영향 용이하고 정확하게 세포 배양 모델에서 조작 할 수 neurotrophins 및 neurotropins 수용성 분자. 여기에, 우리는 방법을 분리 및 문화 병아리 배아에서 감각 신경 해리에 대해 설명합니다. 이 절차는 축삭의 파생물 5,7,8,10,11,16-21을 포함하여 신경 생물학에서 중요한 돌파구를 만들기 위해 사용되었으며, 신경절 세포 (22)을 분리하도록 설계 절차에서 수정되었습니다. 이 있습니다이 방법의 몇 가지 이점. 먼저, 병아리 후근 신경절 (DRG) 개발 많은 기능도 탄생 축삭 연장을위한 시간 프레임을 포함한 것을 특징으로하며, 단백질 발현, 따라서 관내 실험에서 유익한 구축 할시에 유익한 기초를 제공 2,23-28 프로필. 둘째, 연결을 문화가 조사가보다 직접적으로 해리 신경 세포와 비 신경 세포를 모두 포함 (신경 세포와 비 신경 세포를 포함) 그대로 DRG 외식 및 / 또는 혼합 문화를 사용하는 다른 방법에 비해 신경 세포를 연구 할 수 있도록 해리. 셋째, 여기에 설명 된 절차는 간단 저렴하고 학부생 의무가 있습니다. 따라서,이 기술은 연구뿐만 아니라 교육 목적으로 사용될 수있다. 또한,이 프로토콜의 사소한 변화는 DRGs 이외의 소스에서 신경 세포의 빠르고 높은 수율 정화를 허용해야합니다. 예를 들어,이 과정은 ENR neuronally 제공하도록 변형 될 수있다전뇌 배아 또는 척수 등의 다른 조직으로부터 배양 iched. 면역 세포 화학 프로토콜이 해리 신경 배양을 위해 최적화되어 있고 여기에 상세하게 설명된다. 신경 세포 부착 분자 (NCAM) 및 β1 인테그린 대한 이중 면역 세포 화학을위한 절차가 제공된다. 이러한 면역 조직 화학적 방법에서 생성 된 데이터는 배양 된 신경 세포에서 8,16 공간적 패터닝 여러 분자의 강도를 검사하는데 사용되어왔다.

<table><tbody><tr><td>멸균 소형 배양 접시 (35mm)</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>멸균 대형 배양 접시 (100mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>멸균 대형 페트리 접시 (100mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시 (100mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>파인 파이치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>표준 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립(22 x 22mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0.13-0.17mm 두께는 현미경 검사에 최적</td></tr><tr><td>포셀린 커버슬립 홀더</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td> Ham's F12 매체 HCl VW3204-1 <td>500ml당 50ml 분취액 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>2M에서 사용,</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td>을 버리기 전에 두 번 사용할 수 있습니다 <td>Laminin-1 재고 용액</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td>에 5M NaCl 용액을 <td>사용하십시오. 72 &micro를 추가하십시오. 멸균 5 M NaCl의 l과 50 &micro로 분취량; l</td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>세포 치료</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>1x에서 사용, 멸균 Millipore 여과수</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td>으로 희석<td>, 멸균 Millipore 여과수로 희석</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>10 %</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td>에서 <td>F12HS20 사용하여 증류수에 멸균 1M 용액을 만들고 F12 매체에 희석하여 10 mM</td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토 마이오신</td><td>시그마</td><td>P0781</td>의 최종 농도를 얻기 위해 <td>500 ml의 F12 매체</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>에 5ml를 사용합니다.멸균 Millipore 물 1ml를 추가하고, 멸균 조건에서 분취액을 넣고 -20°C에서 보관하십시오. C, F12H 매체에서 10 ng / ml의 최종 농도에서 사용, -20 °C로 유지; C 비제상 냉동고</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD 시스템</td><td>256-GF</td><td>0.1% BSA가 함유된 멸균 1x PBS 1ml를 추가하고 멸균 조건에서 분취액을 넣고 -20°C에서 보관합니다. 멸균 조건에서 F12H 배지</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마</td><td>G7513</td> 부분 표본에서 최종 농도 10ng/ml로 사용되는 C<td>는 -20°C에서 보관합니다. C, 멸균 조건 하에서 F12H 매체</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td> 부분 표본에서 200 mM의 최종 농도에서 사용<td>, -20 °C에서 보관; C</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">기타 필요한 품목: 유리 파스퇴르 피펫, 비옥한 흰 다리뿔 닭 달걀, 체크 알 부화기(가습, 37 &deg; C), 세포 배양 챔버 (가습, 37 &deg; C), 층류 후드, 양안 입체 비전 해부 범위</td></tr><tr><td colspan="4">Immunocytochemistry 시약 표</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>(4% 파라포름알데hye, 30% 자당, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>고정액에 사용 (4% 파라포름알데히, 30% 자당, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Life technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primary 항체 Table</td></tr><tr><td>항체 against NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>polyclonal</td></tr><tr><td>항체 활성화됨 & 베타; 1 ingegrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td colspan="4">Secondary 항체 Table</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-rabbit IgG Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

뉴런은 감각, 운동 모터, 학습 및 메모리를 포함하는 다양한 기능을위한 필수적인 정보를 전달 다각적 세포이다. 생체 내에서 뉴런을 공부하는 것은 그들의 복잡성, 그들의 다양하고 역동적 인 환경 및 기술적 한계에 도전 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 시험 관내에서 신경 세포를 연구하는 신경 세포의 복잡한 신비를 푸는 유익한 증명할 수 있습니다. 세포 배양 모델의 잘 정의 된 자연 환경 조건과 변수를 통해보다 정밀하게 제어 할 수 있습니다. 여기에서 우리는, 분리 해리, 그리고 병아리 배아에서 배양 주 뉴런하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 급속 저렴하고 견고 감각 신경 성장 생성한다. 절차는 지속적으로 높은 신경 세포에 충실 문화를 생산하고 거의 비 신경 세포 (5 % 미만)이 있습니다. 차 뉴런 따라서 자세한 절차는이 디스탱을 만들, 치료 유리 또는 조직 배양 플라스틱에 잘 고착되지 않습니다CT, 신경 도금 잘 정의 된 라미닌 함유 하층 설명한다. 배양 된 신경 세포 공동 면역 침전, 라이브 셀 상상, RNAi를하고, 면역 세포 등 다양한 세포 및 분자 기술에 매우 의무가 있습니다. 이 배양 된 신경 세포를 두 번 면역 세포 화학에 대한 절차 최적화 여기에 설명되어있다.

여기에 설명 된 프로토콜은 문화에 거의 (예를 들어, &lt;5 %) 비 신경 세포 7,8,10,16와 해리 배아 감각 뉴런의 풍부한 인구를 수사 할 수 있습니다. 수많은 DRGs는 요천 추부, 흉부 및 경부 지역에서 얻을 수 있습니다. 연구자의 필요에 따라 이러한 독특한 해부학 적 영역에서 DRGs를 쉽게 분리 할 수​​있다. 예를 들어, 그림 1은도 1C 및 1D 및도 1E와 1 층에서 흉부 DRGs 강조 요추 DRGs와 절개의 다양한 단계를 통해 병아리 배아의 이미지를 보여줍니다. 배양 된 세포는 쉽게 면역 세포에 의해 표시된다. 여기에서, 배양 된 세포는 β1 인테그린 및 NCAM (그림 2)에 대한 항체와 면역 염색된다. 놀랍게도, 우리는이 후 최대 일년에 형광 염색을 시각화 할 수있었습니다ICC 절차, 슬라이드는 4 ° C에서와 어둠 속에서...

세포 배양 모델은 환경 조건 위에 상세한 제어를 제공하고, 따라서 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 명료하게 강력한 플랫폼을 제공한다. 우리는 병아리 배아에서 감각 신경을 분리 해리, 문화 할 수있는 신속하고 저렴하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 하층 준비 및 면역 세포의 세부 사항도 제공됩니다.

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

이 절차의 전반적인 목표는 닭 배아에서 해리된 1차 감각 뉴런의 풍부한 집단을 배양하는 것입니다. 이것은 배아 날부터 손상되지 않은 등쪽 뿌리 신경절, 7-10개의 닭 배아를 원뿔형 튜브에 모은 다음 해리된 세포 현탁액으로 분해함으로써 이루어집니다. 해리된 두 번째 단계로, DRG 세포는 배양을 위해 배양 접시에 도금됩니다.그 후, 배양 접시를 부드럽게 헹구어 뉴런을 우선적으로 제거합니다. 마지막 단계는 고농도 또는 저농도의 라미닌으로 미리 코딩된 산성 세척 및 베이크드 커버 슬립과 같이 잘 정의된 하위층에 해리된 감각 뉴런을 도금하는 것입니다. 하나의 면역 세포 화학은 해리된 배양 병아리 감각 뉴런의 세포체, 신경돌기 및 성장 원뿔에서 NCA 및 활성화된 베타 원 인테그린의 존재를 보여주는 데 사용됩니다.이 방법은 축삭돌기 유도 메커니즘, 성장 원뿔, 세포골격 역학, 세포 표면 구성 및 조절을 포함하여 신경 생물학의 다양한 측면을 설명할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 신경교세포가 거의 없는 해리된 감각 뉴런이 고도로 농축된 배양물을 빠르게 얻을 수 있습니다. 이것은 뉴런과 비뉴런 세포를 모두 포함하는 온전한 등쪽 뿌리 갱글링 배양과 구별됩니다.더욱이, 이 프로토콜의 사소한 변형은 배아 전뇌를 포함하여 등쪽 뿌리 신경절 이외의 출처에서 높은 수율의 신경 배양을 허용해야 합니다. 층류 후드에서 단계적 인 비옥 한 흰색 다리 뿔 병아리 알을 깨고 내용물을 100mm 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 배아를 다른 100mm 페트리 접시로 옮깁니다.티슈가 젖지 않도록 페트리 접시에 데운 XPBS 하나를 추가합니다. 배아의 목이 잘리고 시신은 다른 깨끗한 페트리 접시로 옮겨집니다. 워워진 F 12 HS 10이 조직에 추가됩니다.배아 조직이 있는 페트리 접시를 층류 후드의 해부 현미경 아래에 놓습니다. 그 후 발달 중인 진피를 꼬집어 꼬리에서 목까지 수직 정중선을 절개하여 심장, 폐 및 기타 장기를 노출시킵니다. 가는 집게로 목과 대동맥 또는 심장 바로 위에 있는 다른 조직을 부드럽게 잡고 꼬리 쪽으로 당겨 동물의 내장을 뜯어냅니다.다음으로, 따뜻한 F 12 HS 10을 조직에 도포하여 제제를 추가로 세척하고 조직을 촉촉하게 유지하고 필요에 따라 해부 전반에 걸쳐 F 12 HS 10의 적용을 반복합니다. 그런 다음 남아 있는 심혈관, 호흡기 또는 소화 기관을 제거하여 발달 중인 갈비뼈 척추와 DRG를 노출시켜 갈비뼈보다 아래쪽인 요추 기둥 양쪽을 따라 DRG를 수집하고 배아에서 DRG를 뽑습니다. 이것은 Dr.G에서 척수 쪽으로 뻗어 있는 뿌리를 꼬집고 절단하고 DRG에서 말초 방향으로 또는 그 반대로 발달 중인 신경을 움켜쥐는 방식으로 수행됩니다.그런 다음 온전한 F 12 HS 10으로 채워진 35mm 배양 접시에 손상되지 않은 DRG를 놓습니다. DRG에 부착될 수 있는 등쪽 또는 배쪽 뿌리와 같은 과도한 조직을 제거합니다. 요추 부위보다 우수한 DRG를 얻으려면 흉추 및 경추 척추의 복부 절반을 제거합니다.이것은 상부 요추 부위의 척수 축에 수직으로 발달 중인 척추를 절단하고 상부 경추 부위를 또 한 번 절단하여 수행됩니다. 그런 다음 척추의 오른쪽과 왼쪽을 따라 자릅니다. 총체적으로, 이러한 절단은 배아에서 척추의 복부 절반을 분리하고, 배아에서 기둥을 제거하여 DRG에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.미세한 집게로 척수를 잡고 흉추와 경추의 척수를 제거합니다. 다음으로, 이전과 같이 손상되지 않은 흉부 및 경추 DRG를 수집하고 다른 DRG와 함께 따뜻한 F 12 HS 10에 놓습니다.DRG에 부착될 수 있는 과도한 조직을 제거합니다.그런 다음 새 유리 페이스트 파이펫 내부를 F 12 HS 10으로 헹구어 DRG가 파이펫 벽에 달라붙는 것을 방지합니다. 헹궈진 피펫을 사용하여 작은 페트리 접시의 모든 DRG와 F 12 HS 10을 15ml 멸균 원뿔형 튜브로 옮기고, 이 절차에서 DRG 수를 늘리기 위해 추가 배아를 절부할 수 있습니다. DRG가 손상되지 않은 원뿔형 튜브를 원심분리기에 넣고 2-3분 동안 200배 G로 부드럽게 회전합니다.DRG가 튜브 바닥으로 가라앉았는지 확인합니다. 그런 다음 F 12 HS 10을 부드럽게 제거하고 DRG 펠릿을 방해하지 않습니다. 다음으로, 1개의 X-C-M-F-P-B-S 2밀리리터를 첨가하여 DRG 펠릿을 제거합니다.다시 돌리고 DRG를 유지하면서 C-M-F-P-B-S를 제거합니다. 이 세척 단계를 반복하여 총 3회 세척합니다. 세척이 완료되고 C-M-F-P-B-S를 제거한 후 15ml 튜브에 2ml의 따뜻한 트립신을 넣고 DRG를 부드럽게 제거합니다.그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 10-15분 동안 넣어 DRG를 해리된 세포로 소화합니다. 트립신 용액에 DRG를 부드럽게 코팅하고 온전한 DRG가 없는지 육안으로 검사합니다. 온전한 DRG가 더 이상 눈으로 보이지 않을 때까지 tation을 계속하거나 온전한 DRG가 해리될 때까지 섭씨 37도의 수조에서 더 긴 트립신 배양을 허용합니다.다음으로 해리된 DRG와 트립신을 200배 G로 3-5분 동안 원심분리하여 펠릿을 형성합니다. 펠릿이 형성될 때까지 필요한 경우 더 오래 회전합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 트립신을 조심스럽게 흡입합니다.펠릿에 F 12 hs 10 2 밀리리터를 추가하고 DRG를 부드럽게 트라이 링합니다. 그런 다음 원뿔형 튜브의 모든 내용물을 100mm 배양 접시로 옮깁니다. 튜브를 8 밀리리터의 F 12 HS 10으로 헹구고 한 번에 2 밀리리터씩 총 10 밀리리터를 배양 접시에 옮깁니다.그 후, 배양 접시를 가습 된 섭씨 37도 인큐베이터에 3 시간 동안 놓습니다. 이제 준비된 라미닌 400마이크로리터를 산성 세척 및 구운 유리 커버 슬립에 하나씩 추가하고 피펫 팁으로 펴 펴 전체 커버를 보장합니다. 표면 장력으로 인해 라미닌 1이 커버 슬립에 남아 있고 배양 접시 바닥에 퍼지지 않도록 합니다.접시 위에 뚜껑을 덮고 Lamin One을 실온에서 2-3시간 동안 배양합니다. 그 후, 라미닌 코팅된 커버 슬립을 층류 후드에서 멸균 PBS로 세 번 헹굽니다. 마지막 헹굼 후 커버 슬립에 PBS를 그대로 두십시오.헹굼 단계에서 표면 장력을 잃지 마십시오. 배양 후 10ml 멸균 피펫을 사용하여 해리된 DRG 세포가 들어 있는 접시 바닥을 부드럽게 헹굽니다. 접시를 45도 각도로 잡습니다.약 7밀리리터의 F 12 HS 10을 빼냅니다. 그런 다음 접시의 1/3로 부드럽게 배출하여 뉴런을 제거합니다. 이 작업을 5회 더 반복합니다.그런 다음 접시를 약 120도 회전하고 헹굼 절차를 반복하여 다시 6번 헹굽니다. 그런 다음 접시의 나머지 1/3에 대해 절차를 다시 반복합니다. 이제 동일한 피펫을 사용하여 접시의 뉴런을 포함하는 F 12 HS 10을 원뿔형 튜브로 옮깁니다.펠릿으로 200G에서 5-10분 동안 원심분리합니다. 세포는 이후에 F12HS10을 제거하여 펠릿을 방해받지 않습니다. 그런 다음 2 밀리리터의 따뜻한 F 12 H 플러스 보충제로 펠릿을 재현탁시킵니다.그 후, 혈구 분석기로 세포 밀도를 결정하고 필요에 따라 F12 H 플러스 보충제로 세포를 희석하여 원하는 도금 농도를 얻습니다. 그런 다음 라미닌 코팅 커버 슬립에서 PBS를 즉시 제거하십시오. 그 위에 400마이크로리터의 세포를 놓습니다.접시를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터로 조심스럽게 옮기고 멸균 상태에서 2-3시간 동안 배양합니다. 뉴런이 들어있는 35mm 접시에 1.6 밀리리터의 F 12 H 플러스 보충제를 부드럽게 범람시킵니다. 그런 다음 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓고 밤새 배양합니다.이 그림은 NCA와 활성화된 베타 1 인테그린에 대해 표지된 배양된 해리된 1차 감각 뉴런 면역을 보여줍니다. 배아 병아리 뉴런은 고농도의 라미닌 1 뉴런 세포체에서 견고하게 성장합니다. 신경돌림과 성장원뿔은 NCA에 대해 면역 양성이며 베타 원 인테그린을 활성화합니다.두 염색체의 병합된 이미지는 대부분의 세포가 N cam과 활성화된 beta one integrin에 모두 양성임을 보여줍니다. 배아 병아리 감각 뉴런의 경우 예상대로 이 기술로 수확된 세포 중 5% 미만이 비뉴런입니다. 이 이미지에는 NCA M 음성 및 베타 원 인테그린 양성인 신경교세포와 유사한 형태를 가진 세포가 있습니다.비신경 세포와 일치합니다. 배양된 감각 뉴런의 배율이 높을수록 세포체에서 뻗어 나온 신경돌기가 명확하게 표시되며, 이 삽입물은 중성석 끝에 있는 성장 원뿔의 배율이 더 높다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 온전한 등쪽 뿌리 신경절을 신중하고 완전히 해리하고 뉴런을 플레이트화하고 정의된 하위층에 적절한 밀도를 플레이트화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다(예: 알려진 농도의 라미네이트 1로 코딩된 산성 세척 및 구운 커버 슬립).타임 랩스 현미경 검사와 같은 실시간 이미징 방법을 수행하여 정의된 하층에서 그리고 배양 배지에 적용된 분자에 대한 반응으로 성장 원뿔, 운동성 phylo, POAL 역학 및 기타 성장 원뿔 거동을 평가할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 병아리 배아 배근 신경절의 1차 해리 뉴런에 대해 고도로 농축된 강력하게 성장하는 배양을 생산하는 방법에 대한 확실한 이해를 갖게 될 것입니다.

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연구

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Neuroscience

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