Name: 체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 학습하세요 체외 메틸화 분석을 통해 PRMT 기질의 메틸화 상태를 확인하는 방법을. 포유류 세포에서 에피토프 태그된 PRMT를 발현하고 면역침전 후 SDS-PAGE와 자기방사선촬영으로 분석합니다.

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본 연구는 재향 군인의 미국학과에서 우수상 지원하고, NIH는 RW하는 R01CA138528을 부여했다.

식 구조의 1 준비 <ol><li> 프로토콜을 시작하기 전에, N-말단 에피토프 태그 (Myc와 또는 HA), 및 박테리아 세포에서 높은 수준의 단백질 발현 및 정제를위한 기판에서 프레임 글루타치온-S-전이 효소 (GST)와 함께 포유 동물 발현 벡터에 클론 PRMTs 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 용 해물. </li></ol> PRMTs의 2 정제 <ol><li> 인간 기관지 상피 세포 (Beas2B)을 유지하기 위해 100mm 배양 접시를 사용합니다. 통로 세포를 3 일마다 그들을 합류로 성장할 수 있도록하지 않습니다. </li><li> 형질 감염 전날에, 100mm 배양 접시에 10 ml의 배지에 7.5 × 105 세포를 시드. 소용돌이 균일하게 세포를 분산하고, 5 % 가습 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 다음날, 미디어를 대기음 혈청과 항생제없이 배양 배지 5 ㎖를 추가합니다. 소용돌이와 매체를 대기음. 이 단계를 반복 한더 많은 시간, 최종적 혈청 / 항생 배지 5 ㎖를 추가로 진행 형질. </li><li> 멸균 된 1.5 ㎖의 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 무 혈청 배지 750 μL로 플라스미드 DNA 6 μg을 희석. </li><li> 또 다른 1.5ml의 플라스틱 원심 분리기 튜브에서, 무 혈청 배지 750 μL로 형질 감염 시약 30 μL 희석. </li><li> 희석 DNA (단계 2.4)을 함유하는 튜브로 희석 형질 감염 시약 용액 (단계 2.5)을 전송. 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 부드럽게 섞는다. </li><li> 15 분 동안 실온에서 형질 전환 혼합물을 배양한다. </li><li> 15 분 후, 세포 위에 가볍게 형질 전환 혼합물을 피펫, 소용돌이 균일하게 혼합하고, 5 % 가습 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 3 시간 후, 세포로부터 형질 전환 혼합물을 함유하는 배지를 흡인. 혈청과 항생제로 보충 신선한 세포 배양 배지를 추가합니다. </li><li> 5 % 가습 CO 2에서 37 ° C에서 품어48 시간 동안 인큐베이터. </li><li> 48 시간 후, 용해 완충액 1 ㎖로 세포를 용해 (1X 인산 완충 생리 식염수, 1 % Nonidet P-40, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % 나트륨 도데 실 설페이트, 1 μg / ml의 phenlymethyl 술 포닐 플루오 라이드). 셀 리프터와 플라스틱 원심 분리 튜브에 수집하고, 용 해물을 30 분 동안 얼음 위에서 배양 용 해물. </li><li> 세포 파편에서 해물을 취소 벤치 탑 원심 분리기에서 10 분 동안 15,000 XG에 해물을 원심 분리기. [* 이것은 고도로 메틸화 분석 용 효소의 정제를 진행하기 전에 항-HA 항체와 해물의 분취 량 면역 블로 통해 HA-PRMT1의 발현을 확인하기 위해 추천된다.] </li><li> PRMTs의 정화를 들어, 인산염 완충 생리 식염수에 항-HA 친 화성 기질의 50:50 현탁액 30 μL (PBS)와 세포 용 해물의 3 mg의 배양 및 튜브 회전에서 4 ° C에서 하룻밤 회전합니다. </li><li> 다음 날, 수집 2 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 14,000 XG에서 튜브를 회전구슬. 뜨는을 취소하고이 14,000 XG에서 원심 분리 씻어 비즈 [20 mM 트리스 (산도 8.0), 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 EDTA, 1 % 트리톤 X-100] 각 버퍼 RIPA의 1 ㎖로 3 배 씻어 분. 셋째 세척 한 후, 메틸화 버퍼 100 ㎕ 한 번 구슬을 씻는다 (50 mM 트리스의 pH 8.5, 20 mM의의 KCl, 10 mM의 MgCl2를, 1 ㎜의 β-머 캅토 에탄올, 100 MM의 자당). 원심 분리 후, 상층 액을 제거합니다. 고정화 PRMTs 함유 구슬 메틸화 분석에 사용될 준비가되었다. [*이 높은 메틸화 분석에 즉시 고정 PRMTs를 사용하는 것이 좋습니다.] </li></ol> 기판의 3 정화 <ol><li> GST-G3BP1의 단일 콜로니가 100 μg / ml의 암피실린을 함유하는 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 5 ㎖에 접종 BL21 변형. 250 rpm에서 진탕 37 ° C에서 하룻밤 문화를 성장. </li><li> 다음 날, 신선한 LB 배지 및 계속 50 ㎖에 하룻밤 문화를 전송inue는 (그것은 약 2 시간 소요) OD 0.5-0.7의 600로 증가합니다. </li><li> OD 600이 0.5 ~ 0.7에 도달 할 때, 250 rpm에서 진탕 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 배양 한 mm의 최종 농도 이소 프로필-β-D-티오 갈 락토 시드 (IPTG)를 추가하고 계속하십시오. </li><li> 10 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확하고, -80 ° C에서 GST 정화 또는 저장소의 펠렛을 처리합니다. </li><li> 용해 완충액 5 ㎖의 세균 펠릿 다시 중단 (단백질 분해 효소 억제제, 라이소자임의 100 μg / ml의와 1X PBS를 0.1 % 트리톤 X-100) 및 30 분 동안 37 ° C에서 해물을 품어. 이 때 해물 인해 세균 게놈 DNA의 출시로 혼탁 한 점성이 나타납니다. </li><li> 초음파에 의한 게놈 DNA (1 초 30 %의 진폭을 가진 각각의 10 펄스) 전단. </li><li> 10 분 동안 15,000 XG에서 원심 분리 용 해물을 취소하고 15 ML 튜브에 맑은 상층 액을 전송합니다. 상층 액이 명확하지 않은 경우 centrifu를 반복gation 과정을 한 번 더. </li><li> 한편, 얼음 차가운 PBS로 두 번 GST-세 파로스 비드를 세척하고 PBS에서 GST-세 파로스 50:50 서스펜션을합니다. 삭제 박테리아 세포 용 해물에 GST-세 파로스 현탁액 200 μl를 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 회전합니다. </li><li> 1 시간 후, 비드를 수집하는 3 분 동안 500 XG에서 튜브를 원심 분리. 구슬이 얼음 차가운 PBS로 3 배 씻으십시오. </li><li> 최종 세척 한 후, 용출 버퍼 (50 mM 트리스 산도 8.0, 150 밀리미터의 NaCl, 30 mM의 글루타티온) 100 ㎕에 구슬을 재현 탁하고 10 분 동안 4 ° C에서 회전합니다. </li><li> 2 분 동안 15,000 XG에 튜브를 원심 분리기 및 다른 플라스틱 원심 분리 관에 정제 된 단백질을 포함하는 상층 액을 전송합니다. 정제 된 단백질의 농도를 추정하기 위해 소 혈청 알부민 (BSA)의 공지 된 양 함께 정제 된 단백질의 5 μL를 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석을 수행한다. </li></ol> 4 메틸화 분석 주 : 방사성 동위 원소 작업 및 방사성 동위 원소 실험을 수행하기에 기관의 프로토콜을 준수 지정된 별도의 영역에서 다음 단계를 수행합니다. <ol><li> 정제 된 GST-기판과 1X 메틸화 버퍼 (50 mM 트리스의 pH 8.5, 20 mM의의 KCl, 10 mM의 MgCl2를, 1 ㎜의 β-머 캅토 에탄올, 100 MM의 자당)의 1 μCi 포함하는 마스터 믹스의 2 μg 추가 S를 - adenosyl- L - [메틸 3 H] 메티오닌, 물 고정 PRMTs (단계 2.13)에 10 μL의 최종 볼륨과 1 시간 동안 30 ° C에서 반응을 품어. </li><li> 1 시간 후, 2X SDS 샘플 완충액 10 μl를 첨가하여 반응을 정지. 10 분 동안 95 ° C에서의 시료의 변성 후, SDS-PAGE 겔에서 샘플을 구분합니다. </li><li> 나중에, 반 건조 전기 전송을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 SDS 겔에서 분리 된 단백질을 전송합니다. </li><li> 전사 후, 함께 막을 덮utofluor (방사 법적 화상 압기)가 부드럽게 실온에서 2 시간 동안 흔들어. 2 시간 후, autofluor을 부어 나중에 사용하기 위해 보관합니다. [* 방사성 물질로 튜브를 레이블] </li><li> 빨리 공기는, 여과지를 건조 막 플라스틱 백에 밀봉하고 -20 ° C에서 X-선 필름에 노출을 막. 충분한 노출 시간 5~30일 사이의 범위. </li></ol> PRMT 식 및 기판의 평등로드의 5 확인 <ol><li> 충분한 노출을 달성 한 후, 차단 버퍼가 포함 된 플라스틱 상자 [트윈 20 (TBST + 3 % 무 지방 우유)과 트리스 완충 식염수를]에 멤브레인을 전송하고 부드럽게 한 시간 동안 바위. </li><li> 방사성 폐기물로 차단 버퍼를 폐기하십시오. 사에서 밤새 TBST에서 : (1000 희석 1) 항-HA 항체와 함께 막을 배양 부드러운 락과 ° C,. </li><li> TBST 배와 멤브레인을 세척하고 HRP 표지 항 마우스 이차 항체로 막을 배양부드러운 락을 1 시간 동안 실온에서 TBST에서 (한 5,000 희석). </li><li> 1 시간 후, TBST 배와 멤브레인을 세척하고, HRP의 기질과 단백질의 chemiluminiscence 검출을 수행합니다. </li><li> HA-태그 PRMTs의 검출 후, 실온에서 5 분 동안 Ponseau-S 염색 용액과 함께 막을 배양한다. 신속하게 GST-태그 기판을 감지하는 물을 막 배를 씻는다. 이미지를 스캔합니다. </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
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</ol>

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본원에 기재된 프로토콜은 통상적으로 식별 PRMT 기판의 메틸화 상태를 설정하는 데 사용된다. 이 강력하고 일관성있는 분석은 또한 기판에 대한 PRMTs의 특이성에 대한 결정적인 증거를 제공 할 것입니다. 이 분석의 성공을위한 핵심 구성 요소는 다음과 같습니다 포유 동물 세포에서 PRMTs의 1 식, 정제 PRMTs의 2 활동, 3 식 및 기판의 정제 및 니트로 셀룰로오스 막에 단백질의 4 완료 서부 전송. 재조합 PRMTs 표현 및 세균으로부터 정제는 또한 시험관 10,11,13 메틸화 반응에서 사용될 수있다. 각 PRMT 다른 정제 전략, 저장 조건 및 저장 온도를 필요로하기 때문에, 재조합 PRMTs의 사용은 시험 관내 메틸화 반응은 적합하지 않을 수있다. 또한, 재조합 PRMTs는 단명 (11)이다. 이러한 문제를 고려하면, 우리는 끝까지 마음을 믿는다포유 동물 세포에서 PRMTs의 동북 아시아의 ...

단백질의 메틸화는 첫째 1968 일에 설명했다. 그것은 연구자들이이이 번역 후 변형의 중요성을 인식하기 시작, 1996 년 PRMT1의 첫 번째 복제까지되지 않았습니다. 흥미롭게도, 핵 추출물의 단백질 아르기닌 잔기의 약 2 %는이 수정의 풍요 로움을 나타내는 3 메틸화된다. 아르기닌 될 수 아르기닌 측쇄 내의 염기성 측쇄와 질소 / s와 양전하를 띤 아미노산 포스트 병진 메틸기, 아르기닌 메틸화 4-6로 알려진 프로세스를 추가로 변경됨. 아르기닌 메틸화 효소 즉의 클래스에 의해 촉매된다. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs). 아르기닌은 monomethylated 또는 dimethylated 후자는 공정 4-6 PRMTs 촉매의 종류에 따라 대칭 또는 비대칭이 될 수 될 수 있습니다. arginin 표시 단백질전자 글리신이 풍부한 모티브 PRMT 매개 촉매에 대한 잠재적 인 대상이다. 기판 PRMT 매개 메틸화 정상 세포 항상성 7-9에 중요한 모두의 단백질 - 단백질 상호 작용, 단백질 - 핵산 상호 작용, 단백질 기능, 유전자 발현 및 / 또는 세포 신호 전달을 조절하는 것으로 나타났다. 단백질 아르기닌 메틸화의 생물학적 역할을 이해하기 위해서는, 정확한 효율과 재현성이 분석법은 식별 PRMT 기판의 메틸화 상태를 설정하기 위해 필요하다. 자신의 기판의 메틸화를 촉진하기 위해 정제 PRMTs의 능력을 평가하는 시험 관내 메틸화 분석에서, 아르기닌 메틸화 10-12 연구를위한 잘 받아 분석이다. 이 분석의 전반적인 성공은 대부분 정제 된 PRMTs의 활동에 따라 달라집니다. PRMTs 표현 박테리아 나 포유류 세포 10,11로부터 정제 할 수있다. D 등이 체외 메틸화 분석,프로토콜 절에 etailed 원래 티니와 동료 (10)에 의해 설명 된 방법에 기초한다. 이 프로토콜에서는 상세히 PRMT1 포유류 세포에서의 발현 및 정제하는 단계를 나타낸다. 단백질 결합 단백질 1 (G3BP1), 공지 PRMT 기판 (8)를 활성화하는 라스-GTPase에 메틸화를 촉진하는 정제 PRMT1의 능력은 이상과 같은 S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌의 존재하에 평가 하였다 메틸 공여체. 이 분석을 사용하여, 우리는 확실하게 단백질 아르기닌 메틸화 연구에서 주요 단계 메틸 레이트 신규 또는 공지 된 기판에 PRMTs의 능력을 정의 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>S-아데노실-L-[메틸-3H] 메티오닌</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>병 상단 디스펜서</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>6 ml 섬광 바이알</td><td>National Diagnostics</td><td>SKU:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharose</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-글루타티온 환원</td><td>시그마</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td>, <td>Invitrogen</td><td></td><td>형질주입 시약</td></tr><tr><td>, Beas2B,</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Optimem,</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td>, <td>US-Biologicals,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS,</td><td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 나트륨, 데옥시콜레이트</td>, <td>시그마</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>PMSF</td>, <td>시그마</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항 HA 친화성 매트릭스</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항 HA 항체</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

단백질 아르기닌 메틸화는 핵에서 가장 풍부하게 번역 후 변형 중 하나이다. 단백질 아르기닌 메틸화는 식별 및 / 또는 프로테오믹스 방법을 통해 결정, 및 / 또는 메틸 아르기닌 특이 항체 발현 수준으로 할 수있다. 그러나, 이러한 기술은 때때로 오해의 소지가 될 수 있으며 종종 거짓 긍정적 인 결과를 제공한다. 가장 중요한 것은, 이들 기술은 메틸화 분석법은, 반면에, 민감한 유용한 생화학 분석법이다 체외. PRMT의 기질 특이성을 지원하는 직접적인 증거를 제공 할 수 있고, 식별 된 단백질이 실제로 PRMT 기판 인 경우 일관 공개. 전형적인 관내 메틸화 분석은 정제 된 활성 PRMTs 정제 기판과 방사성 동위 원소 표지 된 메틸 공여체 (S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌)을 포함한다. 여기에서 우리는 촉매 활성 PRMT1, 재하 표현 PRMT의 가족을 분리하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 나정제 PRMT1의로 메틸 트랜스퍼 활동 이후 S-아데노 실-L-메틸 공여체로서 [메틸 3 H] 메티오닌의 존재하에, 단백질 1 (G3BP1)를 결합 라스-GTPase 활성화 단백질, 공지 PRMT 기판 상에 시험 하였다. 이 프로토콜은 새로운 생리 PRMT1 기판의 메틸화 상태를 설정하기위한,뿐만 아니라 단백질 아르기닌 메틸화의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 단지 사용될 수있다.

<html> GST-G3BP1 메틸화하는 HA-PRMT1의 능력은 체외 메틸화 분석에 의해 결정되었다. Beas2B 세포 용 해물로부터 정제 HA-태그 PRMT1는 GST-G3BP1를 포함하는 메틸화 반응에 고용되었다 메틸 공여체 S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌 1 μCi. PRMT1 효율적 GST-G3BP1 (그림 1, 상단 패널)의 메틸화를 촉진 할 수있다. 음성 대조군 (그림 1, 상판, 차선 1)을 역임 빈 벡터 형질 Beas2B 세포의 용 해물을 수행 풀다운을 사용하여 메틸화 반응. PRMT1의 발현이 항-HA 항체와 면역 블로 확인했다 (그림 1, 가운데 패널). Ponseau-S 염색 반응은 모두 GST-G3BP1 동등한 하중 (도 1, 하부 패널)을 입증하기 위해 사용되었다. <p class="jove_content" fo:keep-toget...

단백질 아르기닌 메틸화, 즉 효소의 클래스에 의해 촉매. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs)는 단백질 내의 아르기닌에 메틸기 (들)의 첨가의 효소 과정이다. 체외 메틸화 분석은 공지 또는 신규 PRMT 기판의 메틸화 상태를 평가하기위한 가장 신뢰할 도구이다.

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 아르기닌 메틸 전이효소 또는 PRMT 기질의 메틸화 상태를 확인하는 것입니다. 이는 먼저 포유류 세포에서 에피토프 태그가 지정된 PRT를 발현함으로써 이루어집니다. 그런 다음 P RMT는 항 헤마글루티닌 또는 항 HA 코팅 SRO 속도를 사용하여 세포 용해물에서 면역 침전된 후 비특이적으로 결합된 단백질을 제거하기 위해 광범위한 세척을 수행합니다.다음으로, 세척된 비드는 박테리아와 삼중수소로 표지된 달팽이 L 메티오닌 또는 sam에서 정제된 기질 단백질과 함께 배양됩니다. 마지막으로, 반응이 중단되고 기질의 메틸화 상태가 sodium syl sulfate, poly acrylamide gel 전기 영동 또는 SDS 페이지 분석 후 자동 방사선 촬영을 통해 결정됩니다. 궁극적으로, 기질을 메틸화하는 p RMT의 능력은 빈 벡터와 BRMT 형질 주입된 세포의 용해물에서 수행된 면역침전을 사용하여 메틸화 반응을 비교함으로써 결정됩니다.메틸 아르기닌 특이적 항체를 사용한 단백질체학 접근법 또는 면역 블로팅은 때때로 오해의 소지가 있을 수 있으며, 종종 잘못된 우편 결과를 제공할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 PRMT 기질 특이성을 뒷받침하는 직접적인 증거를 제공할 수 없다는 것입니다. 이 비디오에서 시연할 시험관 내 메틸화 분석법의 주요 장점은 민감하고 식별된 단백질이 PRMT 기질이 어디에 있는지 일관되게 드러낸다는 것입니다.100mm 배양 접시에 접시를 휘젓고 세포가 고르게 분산되도록 접시를 휘젓고 5% 가습 CO2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음날 배지를 흡인하고 혈청과 항생제가 없는 5ml의 배양 배지를 첨가하고 배지를 소용돌이치고 흡인합니다. 이 단계를 한 번 더 반복하고 마지막으로 5ml의 혈청 무항생제 배지를 추가하고 형질주입을 진행합니다.transfection을 수행하려면 먼저 6마이크로그램의 PRMT 플라스미드 DNA를 멸균 1.5ml 플라스틱 원심분리기 튜브의 다른 1.5ml 플라스틱 원심분리기 튜브에 있는 750마이크로리터의 무혈청 배지에 희석합니다. 30마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 750마이크로리터의 무혈청 배지에 희석합니다. 그런 다음 희석된 transfection 시약 용액을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 부드럽게 혼합된 희석된 DNA가 들어 있는 튜브로 옮깁니다.transfection 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 형질주입 혼합물을 세포에 부드럽게 피펫팅하고 균일하게 혼합되도록 소용돌이칩니다. 섭씨 37도에서 3시간 배양 후, 세포의 형질주입 혼합물을 함유한 배지를 흡인합니다.그런 다음 혈청과 항생제가 보충된 신선한 세포 배양 배지를 추가합니다. 섭씨 37도에서 48시간 배양 후 1ml의 용해 완충액에 라이스 세포를 넣습니다. 세포 리프터가 있는 플라스틱 원심분리기 튜브에 용해물을 모읍니다.그런 다음 얼음에서 30분 동안 용해물을 배양합니다. 다음은 원심분리기입니다. 15, 000 GS에서 벤치탑 원심 분리기에서 10 분 동안 용해됩니다.P mts의 정제를 위해 세포 파편에서 용해물을 제거합니다. 3mg의 세포 용해물을 인산염 완충 식염수에서 30 마이크로리터의 50-50 현탁액 anti HA 친화성 매트릭스와 함께 배양합니다. 또는 PBS는 튜브 로테이터에서 섭씨 4도에서 밤새 회전합니다.다음날, 구슬을 모으기 위하여 2 분 동안 탁상용 분리기에 14, 000 GS에 관을 회전시키십시오. 스내트를 버린 후 1ml의 RIPA 버퍼로 비드를 세척한 다음 이전과 같이 원심분리합니다. RIPA 완충액으로 비드를 세 번 세척한 후 100마이크로리터의 메틸화 완충액으로 비드를 한 번 세척합니다.원심분리 후 상층액을 제거합니다. 고정화된 p RMT를 포함하는 비드는 메틸화 분석에 사용할 준비가 되었습니다. 방사성 동위원소로 지정된 별도의 영역에서 메틸화 분석을 수행합니다.방사성 동위원소 작업에 대한 기관의 프로토콜에 따라 작업합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정제된 글루타티온, s 전이효소 또는 GST 기질을 준비합니다. 2마이크로그램을 1개의 x 메틸화 완충액과 트리듐 라벨이 붙은 달팽이 L 메티오닌의 마이크로 퀴리가 함유된 마스터 믹스와 결합하십시오.고정화된 p RMT에 혼합물을 첨가하고 섭씨 30도에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 후 10마이크로리터의 2개의 XSD를 첨가하여 반응을 중지합니다. 시료를 섭씨 95도에서 10분 동안 변성시킨 후 시료 완충액.나중에 SDS 페이지별로 샘플을 분리합니다. SDS 젤에서 분리된 단백질을 반건조 전기영동 전달을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮깁니다. 이송 후 멤브레인을 자동 방사선 사진으로 덮습니다.실온에서 2시간 동안 증점제를 넣고 부드럽게 흔듭니다.2시간 후 증압기를 붓고 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다. 여과지에 멤브레인을 빠르게 자연 건조하고 비닐 봉지에 밀봉한 다음 멤브레인을 섭씨 영하 20도의 X선 필름에 노출시킵니다. 충분한 노출 시간은 5일에서 30일 사이입니다.충분한 노출을 달성한 후 멤브레인을 차단 버퍼가 들어 있는 플라스틱 상자에 옮기고 1시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 차단 버퍼는 방사성 폐기물로 폐기하십시오. 그런 다음 T tris의 항 HA 항체로 멤브레인을 배양하고 tween 20으로 완충 식염수를 배양하고 다음날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 TBST로 약칭하고 다음날 부드럽게 흔듭니다.TBST로 멤브레인을 세 번 세척합니다. 그런 다음 TBST에 안티 마우스 2차 항체로 표시된 무 과산화효소로 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. TBST로 멤브레인을 3회 세척한 후 HA tag P RMT를 검출한 후 horseradish peroxidase 기질로 단백질의 화학발광 검출을 수행합니다.판초 S 염색 용액으로 멤브레인을 5 분 동안 배양합니다. 실온에서 이미지를 스캔하기 전에 멤브레인을 물로 빠르게 세 번 씻습니다. GST 태그가 붙은 기질을 검출하기 위해, GST 태그 G 3 PP 1을 메틸화하는 HA 태그 PMT 1의 능력은 시험관 내 메틸화 분석에 의해 결정되었습니다.HA TAG prm T는 B2B 세포에서 정제됩니다. 용해물은 GSTG 3 개, BP 1 개 및 1 개의 마이크로 카레를 함유 한 메틸화 반응에 사용되었으며, 트리티움 표지 달팽이 L 메티오닌. 메틸 공여체로서, p MT one은 빈 벡터의 용해물에서 수행되는 풀다운을 사용하여 GS TG 3 BP 1 메틸화 반응의 메틸화를 효율적으로 촉매 할 수 있습니다.형질주입된 B2B 세포는 음성 대조군 역할을 했습니다. 항 HA 항체를 이용한 면역 블롯팅은 p rmt의 발현을 확인했다. 그런 다음 하나의 판초 염색을 사용하여 두 반응에서 GSTG 3 BP 1의 동일한 하중을 입증했습니다.이 동영상을 시청한 후에는 체외 메틸화 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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이 문서에서는 단순 양적, 액상 친화 캡쳐 분석이 제공됩니다. 그것은 한 손으로 그리고 다른 한편으로는 태그를 단백질과 두 번째 레이블이 붙은 단백질 (예 : poliovirus) 간의 친화력에 자석 구슬 및 태그 단백질 (예 : nanobodies) 사이의 상호 작용을 기반으로 안정적인 기술입니다.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

학습하세요 체외 메틸화 분석을 통해 PRMT 기질의 메틸화 상태를 확인하는 방법을. 포유류 세포에서 에피토프 태그된 PRMT를 발현하고 면역침전 후 SDS-PAGE와 자기방사선촬영으로 분석합니다.

체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다

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