소프트 한천 콜로니 형성 분석

이 절차의 전반적인 목표는 세포 정착지 독립적 성장을 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 세포 배양 플레이트에 한천 층을 도금하고 굳어지도록 함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이전 한천 층의 맨 위에 한천의 세포 혼합물을 도금하는 것입니다.

다음으로, 세포는 몇 주에 걸쳐 군체를 형성할 수 있습니다. 마지막 단계는 시각화 및 정량화를 위해 군체를 염색하는 것입니다. 궁극적으로, 연질 한천 군집 형성 분석법은 세포 형질전환의 지표로서 앵커리지의 독립적 성장을 보여주기 위해 사용됩니다.

Clon genic assay와 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 soft agar colony formation assay에서 세포가 Anchorage 독립적인 방식으로 colony를 형성해야 한다는 것입니다. 처리된 조직 배양물의 각 웰에 라벨을 부착하여 절차를 시작합니다. 조사 중인 각 세포주 또는 상태에 적합한 6개의 웰 플레이트.

다음으로, 분말 배지 1g과 중탄산나트륨 0.2g을 탈이온수에 최종 부피 50ml로 용해하여 두 개의 Xcel 배양 배지를 준비합니다. 이 매체를 0.2미크론 필터에 통과시킵니다. 관심 세포주의 정상적인 배양에 필요한 추가 성분을 추가합니다.

예를 들어, 10% FBS 및 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 보충된 RPMI 1640 배지에서 CMT 1 67 세포주를 성장시킵니다. 사용하기 전에 섭씨 37도의 뜨거운 물로 중간 온도로 데우십시오. 이제 하나의 Xcel 배양 배지를 준비합니다.

그런 다음 100ml의 탈이온수에 1g의 고귀한 한천을 첨가하여 1%고귀한 한천을 준비합니다. 그 후 0.6ml의 탈이온수에 0.6g의 고귀한 한천 100g을 첨가하여 0.6% 고귀한 한천을 준비합니다. 다음으로 고귀한 한천 혼합물을 오토클레이브합니다.

그 후, 콜로니를 염색하기 위해 하나의 XPBS에 밀리리터 니트로 블루 테트라 올레움 클로라이드 원액 1 밀리그램을 만든다. 이 절차에서는 전자 레인지에서 가열하면서 1 % noble 한천 병을 약 1-2 분 동안 전자 레인지에 돌립니다. 끓는 일이 일어나지 않도록 용액을 면밀히 모니터링하십시오.

그런 다음 한천이 완전히 용해되고 용액이 깨끗해질 때까지 간헐적으로 가열 및 혼합을 계속하십시오. 그 후, 녹은 한천 용액과 Prewarm two x 배양 배지를 섭씨 42도로 채워진 얼음 양동이에 넣습니다. 수돗물.

또한 뜨거운 물이 담긴 얼음 양동이의 튜브 홀더에 50ml 원뿔형 튜브를 넣습니다. 그런 다음 버킷을 세포 배양 후드로 옮깁니다. 그런 다음 6 밀리리터의 배양 배지와 6 밀리리터의 1 % 고귀한 한천 용액을 50 밀리리터 원추형 튜브에 첨가합니다.

피펫을 위아래로 여러 번 움직여 혼합합니다. 빠른 속도로 작업하면 부드러운 한천이 조기에 굳어지는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 5ml 혈청학적 피펫으로 약 5.5ml의 혼합물을 추출합니다.

기포가 피펫 컬럼 상단으로 올라오도록 합니다. 그런 다음 1.5ml의 혼합물을 각 웰에 넣고 기포가 침전되지 않도록 합니다. 플레이트를 덮고 한천 혼합물이 실온에서 30분 동안 세포 배양 후드에서 응고되도록 합니다.

첫째, 트립신으로 세포를 수확하고 배양에서 1-5 개로 희석하고 배지를 15 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 세포를 계수하고 이때 최종 세포 현탁액을 준비하기 위해 웰당 필요한 세포 수를 계산합니다. 다음으로 전자 레인지에서 0.6 % 한천 용액을 녹입니다.

뜨거운 물이 담긴 얼음 양동이에 튜브 홀더에 50ml 원추형 튜브와 최종 셀 서스펜션을 넣습니다. 그런 다음 0.6%한천이 녹은 얼음 양동이를 세포 배양 후드로 옮겨 후속 단계를 수행합니다. 6웰 플레이트에 대해 총 부피 12ml의 세포 현탁액을 준비하기 위해 먼저 6ml의 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브에 피펫으로 주입합니다.

그런 다음 튜브에 0.6%한천 6ml를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 42도로 유지하여 조기 경화를 방지하고 세포 생존을 극대화하십시오. 그 후, 혼합물을 2-3회 빠르게 피펫팅하여 세포를 분산시킵니다.

5ml 혈청학적 피펫으로 5.5ml의 혼합물을 추출하고 기포가 피펫 컬럼 상단으로 올라오도록 합니다. 그런 다음 혼합물 1.5ml를 각각에 주입합니다. 글쎄요, 세포 한천 혼합물을 섭씨 37도의 가습된 세포 배양 인큐베이터에 넣기 전에 세포 배양 후드에서 실온에서 30분 동안 응고되도록 합니다.

일주일에 두 번 한천의 상층부에 100마이크로리터의 성장 배지를 추가하여 건조를 방지하고 적절한 집락 형성을 위해 약 21일을 허용합니다. 세포를 염색하려면 각 웰에 200마이크로리터의 니트로 블루 테트라 올레움 클로라이드 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 군체가 염색되면 이미저를 사용하여 우물 사진을 찍고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 군체를 세십시오.

여기에 도시된 것은 CMT 1 67 LNCX LPC X 세포 및 CMT 1 67 LL을 발현하는 벡터의 부드러운 한천 집락 형성 분석법입니다. CMT 1 67 L 및 CXL PC X 셀과 CMT 1 67 LL을 발현하는 벡터는 7 a f를 곱슬곱슬하게 만들었다. 9개의 발현 세포를 부드러운 한천 집락 형성 분석법에서 도말하고, CMT 1 67 LL은 7개의 곱슬곱슬한 세포가 발현 후 집락 형성의 현저한 감소를 보였다.

이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 체외에서 세포 변형을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 앵커리지 독립 성장을 위해 세포를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.