Name: 소프트 한천 콜로니 형성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 소프트 한천 콜로니 형성 분석을 통해 세포의 부착 비의존성 성장을 정량화하는 방법을 익히세요. 이 기법은 암세포의 종양 형성 능력과 종양 억제 단백질의 효과를 평가하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 미국 재향 군인회(U.S. Department of Veterans Affairs)의 Merit Award와 RW에 대한 NIH 보조금 R01CA1385282522717의 지원을 받았습니다.

재료 및 시약 1. 준비 <ol><li> 레이블 조직 배양의 각 웰은 각각의 세포주 또는 조건에 맞게 6 웰 플레이트 치료가 연구되고. </li><li> 분말 매체의 1g 및 50 ㎖의 최종 부피로 탈 이온수에 탄산 수​​소 나트륨 0.2 g을 용해시켜 배 세포 배양 배지를 준비한다. </li><li> 소독하는 0.2 μm의 필터를 통해이 매체를 전달합니다. </li><li> 관심의 세포 라인의 일반 문화에 필요한 추가 구성 요소를 추가합니다. 예를 들어, 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액으로 보충 된 RPMI 1640 배지에서 CMT 167 세포주 성장. 사용하는 뜨거운 물을 욕조에 37 ° C 따뜻한 매체는 이전에. </li><li> 만약 관심 세포주의 정상 세포 배양 용 마찬가지로 별도로 배속 세포 배양 배지를 준비한다. </li><li> 탈 이온수의 고귀한 한천 100 ml의 1 g을 추가하여 1 % 귀족 한천을 준비합니다. 참고 : 빛나는 한천 혼자 교반 완전히 용해되지 않습니다. </li><li> 준비0.6 % 탈 이온수 100 ㎖에 귀금속 한천 0.6 g을 첨가하여 한천 노블. 두 한천 용액은 장기간 저장을 위해 폐쇄 가능한 뚜껑 100 ml의 유리 병에서 만들어 질 수있다. </li><li> 소독 고귀한 한천 혼합물을 압력솥. 이러한 혼합물은 사전에 4 ° C에서 저장하지만 한천이 완전히 용해 될 때까지 실험시 재가열되어야 할 수있다. </li><li> 1000 ml의 최종 부피로 H 2 O에 PO 4 HPO 4 1X PBS (8g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g이 나트륨에 1 ㎎ / ㎖ 원액함으로써 nitroblue 테트라 졸륨 클로라이드 용액을 준비하고, 0.24 g KH 2 ). 이 콜로니 얼룩이 실험의 마지막에 사용된다. </li></ol> 한천의 하단 레이어 2. 도금 <ol><li> 약 1-2 분 동안 1 % 귀족 한천과 전자 레인지의 병 뚜껑을 풉니 다. 전자 레인지에 가열하면서, 끓어 방지하기 위해 밀접하게 솔루션을 모니터링 할 수 있습니다. 간헐적으로 혼합하면서 가열을 계속,한천이 완전히 용해 될 때까지 용액을 분명하다. 참고 : 가열 후 플라스크를 처리하기 위해 내열 장갑을 사용합니다. 그렇지 않을 경우 화상 또는 심각한 부상을 초래할 수 있습니다. </li><li> 뜨거운 수돗물 (42 ° C)로 가득 얼음 양동이에 녹아 한천 솔루션과 미리 예열 배 배양 배지를 놓습니다. 또한 뜨거운 물을 얼음 통에 튜브 홀더에 50 ML 원뿔 튜브를 배치합니다. 다음 단계는 세포 배양 후드에 버킷을 전송합니다. </li><li> 한천의 맨 아래 층의 경우, 6 웰 플레이트 잘 당 한천의 믹스와 매체의 1.5 ml의가 필요합니다. </li><li> 혼합물의 적절한 양을 보장하기 위해, 각각의 6- 웰 플레이트 12 ㎖가 총을 준비한다. </li><li> 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 배양 배지 6 ㎖의 1 % 귀금속 한천 용액, 6㎖를 첨가하여 시작. </li><li> 혼합 원뿔 튜브를 여러 번 반전. 활발한 속도로 작업 부드러운 한천의 조기 경화를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 5 ml의 혈청 학적 파이로 혼합물의 약 5.5 ml의를 그립니다pette. </li><li> 기포가 아니라 각에이​​ 혼합물의 1.5 ml의 증착하기 전에 피펫 컬럼의 상단까지 상승 할 수 있습니다. 판 우물에 공기 방울의 증착을 방지하기 위해주의해야합니다. </li><li> 플레이트를 덮고 한천 혼합물을 30 분 동안 세포 배양 후드에서 실온에서 고화 할 수있다. </li></ol> 3. 도금 한천 함유 세포의 상층 <ol><li> 한천의 하층이 응고되면, 상층의 준비를 시작한다. </li><li> (트립신 1 ml의 예 : 매체의 4를 가하여) 배지에서 5 15 ML 원뿔 튜브로 첫째, 트립신에 의해 수확 세포와 그들에게 일을 희석. </li><li> 세포를 세어 이때 최종 세포 현탁액을 제조 웰 당 필요한 세포의 수를 계산한다. 이 숫자는 세포의 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 5000 세포 / 웰 같은 시작점을 사용하고 필요에 따라 조정한다. 이 세포 수의 경우, 즉, 각 아 (6667 세포 / ml의 세포 현탁액을 제조 할난이 서스펜션의 0.75 mL 및 1.5 ml의 전체 볼륨에 대한 한천 0.75 ㎖를 받게됩니다; 5000의 최종 총 세포 수)가 2 : 세포 농도는 1 희석한다. </li><li> 6- 웰 플레이트의 웰 당 필요한 세포 현탁액의 부피는 다시 1.5 ml의 것이다. 6 웰 플레이트 당 12 ml의 총 추가 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 상기와 전자 레인지의 0.6 % 한천 솔루션을 녹여 튜브 홀더 50 ML 원뿔 튜브와 단계 3.3에서 최종 세포 현탁액과 함께 뜨거운 물을 포함하는 얼음 양동이에 배치합니다. </li><li> 후속 단계에 대한 세포 배양 후드에 녹은 0.6 % 한천과 얼음 통을 전송합니다. </li><li> 6- 웰 플레이트 당 12 ml의 총 부피를 조제 : 1 비율 (1)에 0.6 % 한천 및 세포 현탁액을 섞는다. 1.5 ml를 웰​​ 당 요구되지만 여분 위와 이루어져야한다. </li><li> 피펫 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액의 6 ml의. </li><li> 이어서, 튜브에 0.6 % 한천 (6)를 가하여. 참고 :이 혼합물의 온도를해야합니다조기 경화를 방지하고 세포 생존을 최대화하기 위해 약 42 ° C를 유지했다. </li><li> 피펫 세포를 배포 할 수있는이 혼합물을 2 ~ 3 배 빠르게 작동 후 5 ㎖의 혈청 학적 피펫으로 혼합물의 5.5 ml의를 그립니다. </li><li> 기포가 아니라 각에이​​ 혼합물의 1.5 ml의 증착하기 전에 피펫 컬럼의 상단까지 상승 할 수 있습니다. 판 우물에 공기 방울의 증착을 방지하기 위해주의해야합니다. </li><li> 셀 / 한천 혼합물을 37 ° C 가습 세포 배양 용 인큐베이터에 배치하기 전에 30 분 동안 세포 배양 후드에서 실온에서 고화하도록 허용. </li><li> 적절한 콜로니 형성에 필요한 시간은 약 이십일일 전형적 각 세포주에 대해 변화한다. </li><li> 성장 배지의 층은 탈수를 방지하기 위해 한천의 상층에 걸쳐 유지되어야한다. 회씩 첨가 배지 100 ㎕이 목적을 위해 충분하다. </li></ol> 4. 플레이트를 염색하고 계산 식민지 <ol><li> 200을 첨가하여 스테인 셀 _6 웰, 37 ° C에서 밤새 배양 접시 당 nitroblue 테트라 졸륨 클로라이드 용액 리터. </li><li> 콜로니 염색되면, 이미 저를 사용하여 웰의 사진 촬영과 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 콜로니를 카운트. </li></ol>

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</ol>

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시그널링 단백질의 종양 억제 기능의 확인 시험 관내에서 곤란하다. 이 속성을 조사하기 위해 사용할 수있는 가장 엄격한 분석 중 하나는 부드러운 한천 콜로니 형성 분석이다. 여기서는 안정적으로 그 부모 CMT167 세포주에 비해 Wnt7a 및 Fzd9 과발현 뮤린 폐 암종 세포주를 사용하여 연질 한천 콜로니 형성 분석을 보여왔다. 부드러운 한천 분석에 대해 고려해야 할 몇 가지 중요한 사항이있다. 이 분석에서 가장 중요한 단계는 세포 도금된다. 세포 수는 정확해야하며, 한천 솔루션은 너무 뜨거운 안됩니다. 어떠한 콜로니가 형성되지 않은 경우, 셀은 열 응력에 의한 손상되었을 수도있다. 이 상황에서 분석이 가능한 42 ° C에 가까운 한천 온도를 유지하기 위해 예방 조치, 반복해야합니다. 대안 적으로, 셀들의보다 많은 수의 도금 될 수있다. 부드러운 한천 분석에 몇 가지 제한 사항이 있습니다.하나는 이러한 한계는...

소프트 한천 콜로니 형성 분석은 널리 시험 관내 세포 변형을 평가하는데 사용되는 기술이다. 역사적으로, 퍽 등의 문헌에 의해 기술. 1956 년 다른 분석법, 클론 원성 분석은, 콜로니 하나를 형성하는 세포의 능력을 평가하는 데 사용 하였다. 이 기술에서, 세포는 배양 접시 상에 분산시키고, 필요한 성장 인자를 제공하기위한 &#39;피더&#39;세포 조정 배지의 존재하에 성장. 이 기술의 한계는 단지 콜로니 형성에 관한 정보를 제공하는 것이 었습니다. 정상 세포 인해 anoikis이 호출 아폽토시스 죽음의 특정 유형으로, 앵커리지 - 독립된 성장이 방지된다. 그러나, 형질 전환 된 세포는 기판에 결합하지 않고 성장 능력과 격차가있다. 이 개념을 활용하기 위해, 연구진은 부드러운 한천 콜로니 형성 분석을 개발했다. 소프트 한천 콜로니 형성 분석은 이후 SP를 해결하기 위해,보다 최근에는, 개질 된ecific 필요가있다. 하나의 변화는 높은 처리량 콜로니 카운팅 있도록 형광 염료의 혼입을 포함한다. 또 다른 변화는 단백질 또는 DNA 샘플이 필요할 때 콜로니 형성 후 생존 세포의 검색을 허용하기 위해 전문화 된 한천 용액의 사용을 포함한다. 전통적인 소프트 한천 콜로니 형성 어 세이에서, 세포는 또한 세포 배양 배지와 혼합 된 연질 한천, 다른 층에 달려 세포 배양 배지와 혼합 된 연질 한천 층에서 성장하지만, 한천의 높은 농도를 함유한다. 이 배양 접시에 부착 세포를 방지하면서도 가시 콜로니를 형성하는 형질 전환 세포를 허용한다. 이 기술 뒤에 근거는 정상 세포의 성장과 분할 할 수 있도록 세포 외 기질 접촉 세포에 의존한다는 것입니다. 반대로, 형질 전환 된 세포의 성장과 무관하게 항상 주변 환경 분할하는 능력을 가지고있다. 따라서, 앵커리지 독립적 인 방식으로 식민지를 형성 할 수 세포는 C했다onsidered은 변형과 암을 유발한다. 이 방법의 전반적인 목표는 반 정량적 엄격한 방식으로 세포에서이 기능을 측정하는 것입니다. Wnt 신호 전달 경로는 배아 발생에서 중요한 종종 종양 3-6에서 해제 조절된다. Wnt 신호와 관련된 여러 경로가 있습니다. 정식 경로는 전사 보조 활성화 베타 카테닌 (β-catenin)에 미치는 영향을 통해 Wnt 신호 및 다운 스트림 유전자 전사 조절을 포함한다. Wnts는 예를 들어, 여러 비정규 경로를 통해 신호, 소포체 (8)에서 칼슘의 방출을 조절하는 세포 골격 구조 (7)에 관련된 요소를 조절하는 평면 셀 극성 통로, 그리고이 Wnt 칼슘 통로. 이 Wnt 리간드 Frizzled 수용체 결합을 통해 활성을 발휘한다. 여러 Wnts 폐암에서 상향 조절되는 것으로 도시 하였지만, Wnt7a 비 스말에서 하향 조절되는 것으로 밝혀졌다프로모터 메틸화 내지 9 리터 세포 폐암. Wnt7a가 아닌 정식 경로를 통해 종양 억제로 Fzd9과 행위를 결합한다. 이 Wnt-7a 및 FZD-9의 복원은 비 - 소세포 폐암 세포 (10)의 성장을 억제한다. Wnt7a / Fzd9의 효과 ERK-5, 차례로, 페 록시 좀 증식 제 - 활성화 수용체 γ를 활성화 (PPARγ) 11,12의 활성화를 통해 매개된다. 여기서는 Wnt7a 및 Fzd9 과발현은 뮤린 폐 암종 세포주의 앵커리지 - 독립된 성장의 억제 결과 것을 보여준다. 쥐의 CMT167 세포는 C57BL / lcrf 마우스 (13)의 폐암에서 파생 된 안정적 Wnt7A과 Fzd9로 형질 감염시켰다. Wnt7A 및 Fzd9의 과발현이 양적-PCR (Q-PCR) 및 Wnt7A과 Fzd9 과발현의 기능에 의해 확인 하였다는 PPARγ의 다운 스트림 활성화를 통해 확인되었다.

<table><tbody><tr><td>관심 암 세포주</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10032302</td><td>CMT-167 세포</td></tr><tr><td>분말 RPMI 1640 배지</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td>2x 세포 배양 배지를 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>액체 RPMI 1650 배지</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>1x 세포 배양 배지라고 합니다.</td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td>세포 배양 배지를 보충하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>CellGro</td><td>30-002-Cl</td><td>세포 배양 배지에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Difco Noble Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214230</td><td>1.0% 및 0.6% 한천을 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>피셔</td><td>BP-328-1</td><td>2x 세포 배양 배지에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>멸균 보틀탑 필터</td><td>Fisher</td><td>09-761-126</td><td>필터 2x 매체를 멸균하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 시약</td><td>Invitrogen</td><td>18324-020</td><td>PPAR-RE 루시페라제 분석에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>6웰 플레이트 조직 배양 처리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; C/5% CO2 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Doc Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>군체의 사진을 찍는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Quantity One Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>세포 군체를 세는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>15 ml 원뿔 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 삼각 플라스크</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 혈청 학적 피펫 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>보조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계 (커버 포함) 슬립</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 반전광 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 내열 장갑</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 얼음 양동이</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

소프트 한천 콜로니 형성 분석

The Soft Agar Colony Formation Assay

앵커리지 독립적 성장은 형질전환된 세포가 단단한 표면과 독립적으로 자랄 수 있는 능력으로, 발암의 특징입니다. 연질 한천 집락 형성 분석법은 in vitro에서 이러한 능력을 특성화하기 위한 잘 정립된 방법이며 세포 내 악성 형질전환에 대한 가장 엄격한 테스트 중 하나로 간주됩니다. 이 분석은 또한 다양한 치료 조건에 대한 반응으로 이 능력에 대한 반정량적 평가를 가능하게 합니다. 여기에서는 쥐 폐 암종 세포주 CMT167을 사용하여 Wnt 신호 경로의 두 구성원인 Wnt7A 및 Frizzled-9(Fzd-9)의 종양 억제 효과를 입증하기 위해 연질 한천 집락 형성 분석을 시연합니다. Wnt7a 및 Fzd-9의 동시 과발현은 CMT167 세포에서 집락 형성을 억제했습니다. 이는 Wnt7a 리간드와 Frizzled-9 수용체의 발현이 쥐 폐 암종 모델에서 종양 성장을 억제하기에 충분하다는 것을 보여줍니다.

우리 소프트 한천 콜로니 형성 분석으로 도시 된 바와 같이 CMT167 세포 Wnt7A과 Fzd9의 발현은 종양 억제에 효과적이다. 예비, 우리는 Wnt7A과 Fzd9의 mRNA가 CMT167 세포에서 낮은 수준에서 표현되는 것을 보여주기 위해 Q-PCR을 사용했다. MLE-12 세포, SV40 형질 전환 쥐의 폐 상피 세포주 (도 1)과 비교할 때 CMT167 세포는 내인성 Wnt7A과 Fzd9 낮은 수준을 보였다. 우리는 두 개의 레트로 바이러스 과발현 벡터가 Wnt7A과 Fzd9 (CMT LL Wnt7a / Fzd9)을 모두 표현하는 안정적인 세포주를 만들 Wnt7A (LNCX-Wnt7A)과 Fzd9 (LPCX-Fzd9)의 인간의 구조를 표현하는 CMT167 세포를 형질 전환. 우리는이 세포주 (그림 2)에서 Q-PCR에 의한 Wnt7A과 Fzd9의 발현을 확인했다. 우리의 이전 작업이 수 있듯이, PPARγ는 Wnt7A / Fzd9 신호의 다운 스트림 이펙터입...

soft 한천 집락 형성 분석은 in vitro에서 세포 앵커리지 독립적 성장을 확인하는 데 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 형질전환된 세포의 종양형성 전위와 형질전환된 세포에 대한 단백질의 종양 억제 효과를 검출하기 위한 엄격한 방법을 설명하는 것입니다.

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

이 절차의 전반적인 목표는 세포 정착지 독립적 성장을 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 세포 배양 플레이트에 한천 층을 도금하고 굳어지도록 함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 이전 한천 층의 맨 위에 한천의 세포 혼합물을 도금하는 것입니다.다음으로, 세포는 몇 주에 걸쳐 군체를 형성할 수 있습니다. 마지막 단계는 시각화 및 정량화를 위해 군체를 염색하는 것입니다. 궁극적으로, 연질 한천 군집 형성 분석법은 세포 형질전환의 지표로서 앵커리지의 독립적 성장을 보여주기 위해 사용됩니다.Clon genic assay와 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 soft agar colony formation assay에서 세포가 Anchorage 독립적인 방식으로 colony를 형성해야 한다는 것입니다. 처리된 조직 배양물의 각 웰에 라벨을 부착하여 절차를 시작합니다. 조사 중인 각 세포주 또는 상태에 적합한 6개의 웰 플레이트.다음으로, 분말 배지 1g과 중탄산나트륨 0.2g을 탈이온수에 최종 부피 50ml로 용해하여 두 개의 Xcel 배양 배지를 준비합니다. 이 매체를 0.2미크론 필터에 통과시킵니다. 관심 세포주의 정상적인 배양에 필요한 추가 성분을 추가합니다.예를 들어, 10% FBS 및 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 보충된 RPMI 1640 배지에서 CMT 1 67 세포주를 성장시킵니다. 사용하기 전에 섭씨 37도의 뜨거운 물로 중간 온도로 데우십시오. 이제 하나의 Xcel 배양 배지를 준비합니다.그런 다음 100ml의 탈이온수에 1g의 고귀한 한천을 첨가하여 1%고귀한 한천을 준비합니다. 그 후 0.6ml의 탈이온수에 0.6g의 고귀한 한천 100g을 첨가하여 0.6% 고귀한 한천을 준비합니다. 다음으로 고귀한 한천 혼합물을 오토클레이브합니다.그 후, 콜로니를 염색하기 위해 하나의 XPBS에 밀리리터 니트로 블루 테트라 올레움 클로라이드 원액 1 밀리그램을 만든다. 이 절차에서는 전자 레인지에서 가열하면서 1 % noble 한천 병을 약 1-2 분 동안 전자 레인지에 돌립니다. 끓는 일이 일어나지 않도록 용액을 면밀히 모니터링하십시오.그런 다음 한천이 완전히 용해되고 용액이 깨끗해질 때까지 간헐적으로 가열 및 혼합을 계속하십시오. 그 후, 녹은 한천 용액과 Prewarm two x 배양 배지를 섭씨 42도로 채워진 얼음 양동이에 넣습니다. 수돗물.또한 뜨거운 물이 담긴 얼음 양동이의 튜브 홀더에 50ml 원뿔형 튜브를 넣습니다. 그런 다음 버킷을 세포 배양 후드로 옮깁니다. 그런 다음 6 밀리리터의 배양 배지와 6 밀리리터의 1 % 고귀한 한천 용액을 50 밀리리터 원추형 튜브에 첨가합니다.피펫을 위아래로 여러 번 움직여 혼합합니다. 빠른 속도로 작업하면 부드러운 한천이 조기에 굳어지는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음 5ml 혈청학적 피펫으로 약 5.5ml의 혼합물을 추출합니다.기포가 피펫 컬럼 상단으로 올라오도록 합니다. 그런 다음 1.5ml의 혼합물을 각 웰에 넣고 기포가 침전되지 않도록 합니다. 플레이트를 덮고 한천 혼합물이 실온에서 30분 동안 세포 배양 후드에서 응고되도록 합니다.첫째, 트립신으로 세포를 수확하고 배양에서 1-5 개로 희석하고 배지를 15 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 세포를 계수하고 이때 최종 세포 현탁액을 준비하기 위해 웰당 필요한 세포 수를 계산합니다. 다음으로 전자 레인지에서 0.6 % 한천 용액을 녹입니다.뜨거운 물이 담긴 얼음 양동이에 튜브 홀더에 50ml 원추형 튜브와 최종 셀 서스펜션을 넣습니다. 그런 다음 0.6%한천이 녹은 얼음 양동이를 세포 배양 후드로 옮겨 후속 단계를 수행합니다. 6웰 플레이트에 대해 총 부피 12ml의 세포 현탁액을 준비하기 위해 먼저 6ml의 세포 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브에 피펫으로 주입합니다.그런 다음 튜브에 0.6%한천 6ml를 추가합니다. 혼합물을 섭씨 42도로 유지하여 조기 경화를 방지하고 세포 생존을 극대화하십시오. 그 후, 혼합물을 2-3회 빠르게 피펫팅하여 세포를 분산시킵니다.5ml 혈청학적 피펫으로 5.5ml의 혼합물을 추출하고 기포가 피펫 컬럼 상단으로 올라오도록 합니다. 그런 다음 혼합물 1.5ml를 각각에 주입합니다. 글쎄요, 세포 한천 혼합물을 섭씨 37도의 가습된 세포 배양 인큐베이터에 넣기 전에 세포 배양 후드에서 실온에서 30분 동안 응고되도록 합니다.일주일에 두 번 한천의 상층부에 100마이크로리터의 성장 배지를 추가하여 건조를 방지하고 적절한 집락 형성을 위해 약 21일을 허용합니다. 세포를 염색하려면 각 웰에 200마이크로리터의 니트로 블루 테트라 올레움 클로라이드 용액을 추가하고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 군체가 염색되면 이미저를 사용하여 우물 사진을 찍고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 군체를 세십시오.여기에 도시된 것은 CMT 1 67 LNCX LPC X 세포 및 CMT 1 67 LL을 발현하는 벡터의 부드러운 한천 집락 형성 분석법입니다. CMT 1 67 L 및 CXL PC X 셀과 CMT 1 67 LL을 발현하는 벡터는 7 a f를 곱슬곱슬하게 만들었다. 9개의 발현 세포를 부드러운 한천 집락 형성 분석법에서 도말하고, CMT 1 67 LL은 7개의 곱슬곱슬한 세포가 발현 후 집락 형성의 현저한 감소를 보였다.이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 체외에서 세포 변형을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 앵커리지 독립 성장을 위해 세포를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

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생물학

생식 가능성을 평가하기위한 clonogenic 분석의 응용은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다. 여기 자기편 세포와 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다.

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

문화 미생물에 사용되는 미디어 및 시약과 함께 작업할 경우 무균 기술은 오염을 최소화하기 위해 실천해야합니다. 도금 방법의 다양한 정기적으로, 고립 전파, 또는 열거 세균 및 파지, 실험 재료의 불임을 유지 절차를 포함 모두의하는 데 사용됩니다.

무균 실험실 기술 : 도금 방법

이 비디오는 유방암 종양 원성에 대한 PADI 효소 억제제와 BB-Cl-아미딘의 효과를 시험관내에서 테스트하기 위한 부드러운 한천 집락 형성 분석을 설명합니다. 이 분석은 또한 유전적 교란의 맥락에서 세포 형질전환 가능성의 정량적 평가를 가능하게 합니다.

Soft Agar Colony Formation Assay: 암세포 증식에 대한 새로운 화합물의 효과를 테스트하는 방법

이 비디오는 폐암 세포가 무한정 증식하고 개별 군체를 형성하는 능력을 결정하는 데 도움이 되는 군집 형성 분석에 대해 설명합니다. 항암제가 군집 형성 세포에 미치는 영향은 결과 군체의 수 및/또는 크기의 변화를 분석하여 분석할 수 있습니다.

Colony Formation Assay: Colony Forming Lung Cancer Cells에 대한 항암제의 효능 평가

출처: Cayron, J. 및 Lesterlin, C. 스트레스 치료 하에서 박테리아 성장에 대한 다중 규모 분석. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 도금을 사용하여 생존율을 측정하고 유세포 분석을 사용하여 세포 분열 억제 항생제 처리에서 대장균 필라멘트 및 DNA 복제를 평가하는 절차를 보여줍니다.

도금 분석 및 유세포 분석을 사용한 대장균 의 항생제 유도 필라멘션 평가

출처: 템킨, M. I. 외 미생물 상호작용 연구를 위한 고처리량 공동 배양 분석법. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 코리네박테리움 프로핀쿰과 포도상구균 간의 미생물 상호작용을 연구하기 위한 시험관 내 검사를 시연합니다.

공동 배양에서 미생물 상호작용을 연구하기 위한 시험관 내 분석법

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

여기에서는 펩티딜아르기닌 데이미나제(PADI) 효소 억제제인 BB-Cl-아미딘이 체외 유방암 종양원성에 미치는 영향을 테스트하기 위해 연질 한천 집락 형성 분석법을 사용하는 방법을 문서화합니다.

소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

이 방법은 콜로니 형성 단위(CFU)를 플레이트하기 위해 96웰 플레이트 형식을 사용하여 미생물 풍부도를 정량화하고 전체 파리 균질물 샘플의 초파리 마이크로바이옴에 적용됩니다. CFU는 여기에 제공된 자동 이미지 분석 소프트웨어로 계산됩니다.

초파리 마이크로바이옴에 적용된 96웰 플레이트 형식의 빠른 콜로니 형성 단위 계수

호기성 메탄 산화 박테리아의 자연 서식지에서 발견되는 메탄-산소 카운터 구배를 재현하는 간단한 모델 생태계를 준비하기 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이를 통해 공간적으로 해결된 맥락에서 박테리아의 생리학을 연구할 수 있습니다. 아가로스 기반 모델 에코시스템과 함께 사용하기 위한 일반적인 생화학 분석에 대한 수정 사항도 설명되어 있습니다.

메탄-산소 카운터 그래디언트에서 메탄영양생물을 배양하기 위한 아가로스 기반 모델 생태계

배우세요 소프트 한천 콜로니 형성 분석을 통해 세포의 부착 비의존성 성장을 정량화하는 방법을 익히세요. 이 기법은 암세포의 종양 형성 능력과 종양 억제 단백질의 효과를 평가하는 데 활용됩니다.

소프트 한천 콜로니 형성 분석

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