Name: 단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 배우세요 포유 동물 세포 대량 배양을 위한 단일 사용 공압 생물 반응기 시스템의 조립 및 운영 방법을. pH와 용존 산소 센서 교정, 무균 연결, 세포 배양 조건 최적화 과정을 통해 오염 위험을 최소화하고 효율적인 세포 증식을 달성합니다.

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이 프로젝트는 존스 홉킨스 대학의 교무처가 Gateway Science Initiative를 통해 부분적으로 지원했습니다.

1 로그인 <ol><li> 생물 반응기를 전원을 켭니다. 로그인 페이지를 열려면 아무 곳이나 클릭합니다. 사용자 이름을 선택하고 암호를 입력하고 &quot;로그인&quot;을 클릭합니다. </li></ol> 2 교정 <ol><li> pH 센서 (이전 고압 증기 멸균에 2 점)를 보정합니다. </li><li> pH 센서를 점검하고 센서 팁 전해질 용액으로 가득합니다 확인합니다. pH 보정 솔루션 (전해질)의 pH 4, pH가 7 두 개의 비커를 준비하고 증류수로 사용할 수있는 세척​​ 병이있다. </li><li> pH 센서하여 pH 케이블을 연결합니다. 안녕하세요 인터페이스에서 &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;교정&quot;을 클릭합니다. 교정 솔루션 온도 필드에 버퍼 온도를 입력합니다. </li><li> 버퍼 1 (산도 4)에서 pH 센서를 삽입하고 &quot;제로&quot;필드에 값을 입력합니다. 안정 그래프 기다린 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭합니다. 증류수 pH 센서를 헹군다. </li><li> 버퍼에 넣어 센서 2 (산도 7). 버퍼를 입력&quot;범위&quot;필드에이 값입니다. 안정이 버튼을 보정 클릭 그래프 기다립니다. </li><li> &quot;저장&quot;다음 &quot;닫기&quot;를 클릭합니다. </li><li> 용존 산소 (DO) 센서를 보정합니다. </li><li> DO 센서를 확인하는 몇 시간 동안 시스템에 연결 됨으로써 편광되었다. 안녕하세요 인터페이스에서 &quot;작업&quot;탭으로 이동하고 교정을 클릭합니다. &quot;금지&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> DO 센서를 분리하고 &quot;제로&quot;필드에 0을 입력합니다. 안정 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭하여 그래프를 기다립니다. </li><li> DO 센서를 다시 연결하고 &quot;스팬&quot;필드에 100을 입력합니다. 안정 &quot;보정이&quot;버튼을 클릭하여 그래프를 기다립니다. </li><li> &quot;저장&quot;다음 &quot;닫기&quot;를 클릭합니다. </li></ol> 3 압력솥​​ 및 설치 센서 및 시약 용기 <ol><li> autoc에서 보정, 위치 센서 및 열 아니라 후노예 파우치와 121 ° C, 15 PSI에서 30 분 동안 오토 클레이브. </li><li> 70 % 이소 프로필 알코올 (IPA) 및 생물 안전 캐비닛에 전송 파우치 (BSC)와 오토 클레이브 파우치를 소독합니다. 용기의 외부 포장을 제거합니다. </li><li> 70 % IPA와 내부 포장을 소독 및 생물 안전 캐비닛 (BSC)에 선박을 전송합니다. 내부 포장을 제거하고 운송 중에 입은 피해에 대한 용기와 튜브를 검사합니다. </li><li> pH를 설치하고 두 개의 전면 포트에 센서를 않습니다. 다시 왼쪽 포트에 열을 잘 설치합니다. 센서 캡을 엽니 다. </li><li> 센서 포트를 통해 상기 센서 가이드. 포트에 단단히 센서를 끼 웁니다. </li><li> BSC에서 선박을 전송합니다. </li><li> 선박 슬리브 외부 DO 및 pH 센서 케이블을 끊고 아무것도 슬리브 없음을 확인합니다. 첫째, 소매에 발을 선박을 밀어 넣습니다. </li><li> 조심스럽게 용기 열 잘에 온도 센서를 장착한다. 용기의 바닥은 히터에 맞춰져 있는지 확인합니다. </li><li> 제거튜브는 자신의 가방에서 설정합니다. 생물 반응기 제어 장치의 해당 커넥터와 펌프로 튜브에 일치 색상 코드. </li><li> 그 가스 배출구에 커넥터를 눌러 메인 가스 라인을 설치한다. 가스 배출구에 커넥터를 시계 방향으로 꼬아 서, 마이크로 가스 라인을 설치한다. 배기 필터 튜브를 설치합니다 : </li><li> 필터 오븐을 엽니 다. 그 튜브 필터와 오븐이 고리를 통과하도록 U-채널의 배기 필터를 고정합니다. </li><li> 튜브 홀더에 콘덴서 가방에 의해 튜브를 설치합니다. 문을 닫습니다. </li><li> 다음 생물 반응기 제어부 행 부가 선 및 B 모두의 미디어 라인, 및 DO 센서 뒤에 벤치 위에 수확 라인. </li><li> DO 및 pH를 센서에 케이블을 연결합니다. </li></ol> (4) 추가 중간 및 마이크로 캐리어 <ol><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동을 클릭 컴퓨터 인터페이스의 &quot;제어 펌프&quot;. </li><li> 스 테리 양식미사용 매체 첨가 라인 (오렌지 1 대역) 및 튜브 용접 또는 루어 피팅을 사용하여 배지 병 / 가방 소스와 르 연결. </li><li> 의 미디어 펌프를 켜 슬라이더를 클릭합니다. 미디어 매체의 또한 원하는 금액으로 꺼 펌프 설정하는 슬라이더를 클릭합니다. </li><li> 실온에서 3 시간 동안, 칼슘 Mg를 2 + 무료 PBS를 마이크로 캐리어 비즈를 놓습니다. </li><li> 워시는 칼슘, 마그네슘 2 + 무료 PBS로 여러 번 구슬. </li><li> 115 ° C, 15 PSI에서 15 분간 고압 증기 멸균한다. 참고 :이 실험에 3g의 /의 L (건조 중량)를 추가합니다. </li><li> 수화 및 세정 매체가 단계 4.1에 첨가 동일한 방식으로 반응기로 멸균 된 마이크로 캐리어에 펌프. </li></ol> 5 평형 및 원 포인트는 교정 DO <ol><li> 자동으로 컨트롤러를 설정하고 원하는 설정 값을 입력합니다. 여기에서, 교반 설정 값 (SP) = 15 RPM, 온도 SP를 = 사용 37.0 ° C, pH가 7.2 = 100 % 마십시오. 페이지 기다립니다arameters는 평형합니다. </li><li> 센서를 확인하는 것은 완전히 편광이다. DO 현재 가치를 확인하는 안정. </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;교정&quot;을 클릭합니다. &quot;원 포인트&quot;를 클릭 &quot;DO&quot;를 클릭합니다. </li><li> &quot;스팬&quot;필드에 &#39;백&#39;을 입력합니다. 을 클릭 &quot;저장&quot;과 &quot;주변&quot;을 클릭 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭합니다 : </li></ol> (6)는 실행을 시작 <ol><li> 작업 탭으로 이동합니다. &quot;일괄 처리&quot;를 클릭하십시오. 배치 이름 16 자 이하를 입력하려면 화면 키보드 나 외장 키보드를 사용합니다. </li><li> 온 스크린 키보드의 &#39;숨기기&#39;버튼을 클릭합니다. &quot;배치 시작&quot;오버레이의 &quot;시작&quot;을 클릭하여 확인을 클릭합니다. </li></ol> 7 세포에 접종 <ol><li> 용접에 의해 사용되지 않는 중간 부가 라인 (1 오렌지 밴드) 사이의 연결 및 멸균 셀 병 / 가방 소스를 형성루어 피팅을 사용하여 튜브 또는. </li><li> 펌프와 용기 사이의 튜브를 향해 화살표가 그래서 미디어 펌프 튜브의 실리콘 부분을 설치합니다. </li><li> 튜브 클램프를 확인하는 것은 개방과 분기 튜브 클램프가 닫힙니다. 의 미디어 펌프를 켜고 셀을 추가 한 후 &quot;Off&quot;로 클릭 슬라이더를 클릭합니다. </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;제어 펌프&quot;를 클릭합니다. </li></ol> 8 샘플링 <ol><li> 자주 배양을 모니터링하고 필요에 따라 접종 후, 다음과 같은 방식으로 배양 물로부터 시료를 그린다 </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;샘플을 채취&quot;를 클릭합니다. 샘플링 펌프 샘플링 튜브를 삽입하고 화면의 지시에 따라 샘플링 꼭지를 조작 할 수 있습니다. </li><li> 이러한 샘플에 적어도 매일 현미경 관찰 및 세포 수를 수행합니다. </li><li> 셀이 C에서 원하는 농도에 도달했으면1.2 × 106 세포 / ml ASE, 바이러스 접종 물을 첨가하여 세포를 감염시킨다. </li><li> 무균는 20 ㎖ 주사기로 접종을 추가하고, 반응기에 공급 부가 포트 중 하나에 연결 주사기. 주사기 플런저를 눌러 반응기로 접종을 소개합니다. </li><li> 샘플링을 계속 아데노 바이러스 세포 내 입자 농도에 대한 문화를 분석. </li></ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
<li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Proc%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).</li>
<li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+Int%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li>
<li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Int+Supp%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li>
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<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

저자 D. 지로와 Y Hashimura이 문서에서 사용되는 시약 및 장비를 생산 PBS 바이오 테크의 직원입니다.

이 회용 바이오 리액터 시스템은 사용하기 비교적 간단하고 반응기 모니터링 및 분석을위한 실시간 분석을 제공한다. 그것은 매우 잘 천만명 이상의 세포 / ml에 도달 한 세포 밀도가 포유 동물과 곤충 세포 배양에 적합하다. A549 세포는이 보고서 11에 설명 외에, 우리는뿐만 아니라 생물 반응기에서 SF-9 곤충 세포를 성장했다. 공압 공기 휠이 제공하는 부드러운 혼합 세포 손상을 줄일 수 있습니다. 이 반응기를 설정할 때 몇 가지 단계가 중요하다. 첫째, 적절한 산도의 교정 및 센서는 문화의 최적의 모니터링 및 산도 또는 시스템의 산소를 조절 시약을 첨가 한 중요 않습니다. 둘째, 시약 및 종자 병이 채워지고 루어 첨부는 BSC로 무균 환경에서 이루어져야한다. 시약 병은 무균 환경에서 벗어나게되면, 생물 반응기 공급 라인의 연결은 미생물이 오염되지 않도록주의해야합니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;이 생물 반응기 시스템이이 박테리아 배양을 위해 설계되지 포유 동물과 곤충 세포주 잘 작동하는 동안. 시스템은 세균 세포에 필요한 산소와 급속한 혼합을 제공 할 수 없다. 세균의 성장에 가장 교반 탱크 생물 반응기에서 수행됩니다. 포유 동물 또는 곤충 세포 배양에 대한 다른 일회용 바이오 리액터에 비해,이 시스템은 사용하기 쉽고 실행의 분석을 위해 충분한 데이터를 제공하고, 우리가 평가 한 다른 단일 사용 시스템보다 비슷하거나 더 나은 세포의 성장이 있습니다. 회용 바이오 리액터 공압 시스템은 세포를 연구 biotherapeutics, 백신의 임상 응용 분야에서의 여러 줄기를 충족 할 가능성, 및 개인화 된 약 4를 갖는다. 또한,이 시스템의 유연성은 배치, 회분, 관류 및 형질을 기반으로 생물 반응기 애플리케이션 다섯 수 있습니다. 마지막으로, 단일 사용 회용 바이오 리액터 시스템이 poten대규모 산업 생산의 요구를 충족하고, 가이드 라인과 국내 및 국제 규제 기관 6-10의 권장 사항을 준수 자유형.

현탁액에서 성장 세포 응집체로서 세포 성장 및 세포 기질에 고정 성장 : 포유류 세포 선은 그들의 성장 특성에 따라 세 개의 카테고리 중 하나로 분류 될 수있다. 이 비디오에서 보여준 공기 륜 생물 반응기는 세포의 세 가지 유형을 성장할 수 있지만,이 비디오는 마이크로 캐리어에 고정 장치 의존 세포를 성장하는 생물 반응기의 사용을 설명합니다. 세포 자체 산물 - 앵커리지 종속 포유류 세포보다 세포를 생산하기위한 목적으로 성장시킬 수있다. 예를 들어, 인간의 골수 유래 중간 엽 줄기 세포는 현재 세포를 수확하고 병든 조직으로 이들을 주입 목적으로 재배되고있다. 이 동영상에서 입증 공압 생물 반응기가이 애플리케이션에 대한 이러한 중간 엽 줄기 세포의 제조에 적합한 입증되었다 (세라 외., 개인 통신, 2013). 앵커리지 출발endent 포유 동물 세포는 일반적으로 그들이 특별하게 취급 성장 표면에 부착 한 세포 배양 접시, 세포 배양 플라스크, 또는 롤러 병으로 2D 배양 용기에서 작은 규모의 성장하고 있습니다. 이상의 셀이 요구되는 경우, 플레이트 또는 플라스크 개 이상의 용기를 사용하여 확장 될 수있다. 그러나,보다 비용 효율적인 앵커리지 의존적 세포의 대량 배양, 세포 부착을위한 표면적을 증가시키기 위해 마이크로 - 고체 담체라는 작은 비드를 사용하여 수행 할 수있다. 세포의 부착 특성에 따라, 마이크로 캐리어의 여러 다른 유형의 코팅 된 덱스 트란과 같은, 펩타이드, 콜라겐과 같은 시판 중이다. 마이크로 캐리어는 세포 성장을위한 큰 표면적을 제공 부피비 큰 표면적을 갖고; 및 마이크로 캐리어 세포 바이오 리액터 시스템이 높은 밀도로 배양 할 수 교반과 현탁액에서 유지 될 수있다. biorea의 현재 형식부착 세포는 마이크로 캐리어에 성장 ctors 셀 코팅 마이크로 캐리어들의 현탁액을 유지하기 위해 축 방향 임펠러를 사용하여 스피너 플라스크 및 교반되는 탱크 시스템을 포함한다. 여러 가지 요인 산소 장력, 전단 응력, 표면 행렬, 영양소 및 대사 산물 농도를 포함한 세포의 배양에 성공에 중요하다. 생물 반응기의 사용은 실시간 성장 조건의 모니터링 및 상당히 낮은 생산 비용 1 전위 허용한다. 를 포함하여 체외 세포 배양, 교반 서스펜션, 회전 벽 용기, 중공 섬유, 로커 플랫폼에서 가방 생물 반응기, 유동층 시스템 3에 대한 몇 가지 일반적인 생물 반응기 설계가 있습니다. 이들 시스템의 대부분은 높은 비용, 영양소 농도 기울기, 유체 역학적 전단력, 세포 응집 어려움 샘플링에서, 모니터링 및 제어 CEL 같이, 세포 배양을 위해 고유의 문제를 제시하고 - 최대 스케일리터 규모입니다. 다양한 점착성 세포주 바이러스 백신의 제조 또는 유전자 치료 응용을위한 바이러스 벡터의 제조 중, 바이러스의 생산에 사용된다. 이 비디오에서는, 단일 사용 공기 (에어 휠) 생물 반응기 시스템을 사용하여, 우리는 인간의 폐암 세포 (A549) 콜리 틱 아데노 바이러스의 생산을위한 마이크로 캐리어에 세포의 문화를 보여줍니다. 공압 생물 반응기 설계는 생물 반응기의 바닥으로 살포 기체의 부력에 의해 구동되는 수직 교반 휠을 사용한다. 이 부드러운 교반 방법은 유체 ​​역학적 전단력을 제한하지만 여전히 최적 배지 및 세포가 4를 혼합 보장한다. 교반 탱크 반응기에 비해, 공기 반응기 심지어 대용량 에어 휠 바이오 리액터 시스템 (도 1)와 낮은 벽 전단 응력을 갖는다. 교반 탱크 생물 반응기는 대조적으로,이 단일 사용 반응기의 수직 임펠러는 기포의 스트림 내에서 켜져부드럽고 균일 한 매체의 혼합 (그림 2)을 허용 용기.

<table><tbody><tr><td>PBS 3&nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단일 용도 회의</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간적인 폐 암종 세포 (A549)</td> <td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 높은 포도당 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립신 EDTA, 0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 Microcarriers</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>소포제 C</td><td>시그마</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

최근 포유류, 곤충 및 줄기세포 배양 및 규모 확장의 발전은 새로운 치료법과 맞춤형 의학 혁신을 위한 엄청난 기회를 창출했습니다. 그러나 이러한 발전을 치료 응용 분야로 전환하려면 견고하고 유연하며 비용 효율적인 생물 반응기 시스템을 허용하는 체외 시스템이 필요합니다. 현재 연구 및 상업 환경에서 활용되는 여러 생물 반응기 시스템이 있습니다. 그러나 이러한 시스템 중 다수는 다양한 세포 유형의 성장을 설정, 확장 및 모니터링하는 데 최적이 아닙니다. 이러한 시스템에서 제어하기 가장 어려운 배양 파라미터에는 유체역학적 전단 최소화, 영양염 구배 형성 방지, 균일한 배양 배지 폭기 설정, 미생물 오염 방지, 실시간 배양 조건 모니터링 및 조정이 포함됩니다. 공압식 일회용 바이오리액터 시스템을 사용하여 마이크로 캐리어에서 성장한 포유류 세포를 위한 이 새로운 바이오리액터의 조립 및 작동을 시연합니다. 이 바이오리액터 시스템은 유체역학적 전단 및 영양염 구배 형성을 최소화하고 균일한 배양 배지 폭기를 허용함으로써 현재 사용 가능한 시스템과 관련된 많은 문제를 제거합니다. 또한 바이오리액터의 소프트웨어를 사용하면 바이오리액터 실행 매개변수를 원격으로 실시간으로 모니터링하고 조정할 수 있습니다. 이 바이오리액터 시스템은 또한 다양한 치료용 단백질, 단클론 항체, 줄기 세포, 바이오시밀러 및 백신의 생산을 위해 부착 및 현탁 포유류 세포를 확장할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.

그림 3에서 생물 반응기 실행의 개시에 대한 매개 변수가 표시됩니다. 이 그림은 온도, 용존 산소, pH와 교반의 매개 변수를 설정하기 전에 화면을 보여줍니다. 매개 변수가 설정되면, 실행 파라미터는 연속적으로 모니터링하고 조정이 필요한 상태를 유지하도록 할 수있다. 이 소프트웨어는 문제를 쉽게 식별 할 수있는 연속 판독 값을 생성합니다. DMEM은 10 % FBS, SAFC 안티 폼 C 250 PPM, 2mm의 L-글루타민 및 3g / 마이크로 캐리어들의 L을 함유하는 2.5 L를 이용하여 본 실험에서, 시스템은 매우 산소 퍼센트가 50 %, 인 안정 온도는 37 ° C이며, pH는 7.2이다. 반응기를 7 × 104 세포 / ml (또는 / 미세 담체 10 세포)의 농도에서 A549 세포를 접종한다. 이 실행을 위해 선택된 파라미터는 2 시간 (도 4) 내에 마이크로 캐리어에 부착 된 세포의 대다수되었습니다. 12 시간 후, 세포는 악마입니다(그림 5) 평탄화 및 마이크로 캐리어 표면에 확산 trating 표지판. 24 시간으로, 마이크로 캐리어 (그림 6) 세포없이 어떤 마이크로 사업자 및 마이크로 캐리어에 세포의 더 큰 덩어리와 세포의 비교적 고른 분포를 가지고있다. A549 세포에 의해 마이크로 캐리어 식민지의 비율은 24 시간 후 90 % (그림 7) 75 %이다. 세포는 48 시간 (그림 8) 후 ~ 1,000,000 세포 / ml로 기하 급수적으로 증가하는 것을 계속했다. 50 시간에 온 콜리 틱 아데노 바이러스 (2 × 10 8 비리 온 / ㎖)의 투여에 의해 감염 후, 밀도는 ML 1,200,000 세포 / 증가하고 용균 감염이 진행됨에 따라 감소하기 시작했다. 바이러스 접종 ~ 10,000 배 증폭이 있었다. 이전의 실험에서, 우리는 가스 흐름을 모니터링하고 조정하는 것은 세포의 성장 (게시되지 않은 데이터)를 극대화하는 데 중요한 것으로 나타났습니다. 빠르게 성장하는 세포는 산소 시스템을 고갈 수 제로로 떨어지는 DO 수준입니다. 세포는 성장을 계속하지만, 훨씬 더 느린 속도로했다. 그것은 모니터링 및 대수 성장 단계에서 세포의 요구를 충족시키기 위해 산소 유량을 조정하는 것이 중요하다. 각각의 실행은 매일 세포 수와 산도, DO, 온도를 비교하여 최적의 성장을 분석 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg"> 다양한 원자로 볼륨에서 벽 전단력을 측정 교반기 탱크 생물 반응기에 비해 공압 생물 반응기 시스템 (PBS)의 그림 1 유체 역학. <img alt="그림이" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg"> 그림 2 공압 에어 휠 원자로 임펠러. 52008 / 52008fig3highres.jpg "/&gt; 생물 반응기의 실행을 시작하는 매개 변수의 3 공압 에어 휠 소프트웨어 스크린 샷 그림. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg"> A549 세포 2 시간 게시물 접종 그림 4 마이크로 캐리어 식민지. (평균 마이크로 캐리어 직경 ~ 180 μm의.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg"> 도 5에서 12 시간 배양 개시 후, A549 세포는 부착 평탄화 및 마이크로 캐리어 상으로 확산된다.5highres.jpg "대상 ="_ 빈 "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg"> 문화 24 시간 후 세포로 코팅 된 그림 6 마이크로 캐리어. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg"> A549 세포에 의해 마이크로 캐리어 식민지의 그림 7 비율 접종을 게시 할 수 있습니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg"> 도 8 adenovir 함께 예비 배양에서 생존 A549 세포의 수와 포스트 감염우리는. 바이러스 감염 단계는 50 시간에서 발생합니다.

공압 바이오리액터를 사용하여 포유류 세포의 성장을 위한 이 일회용 바이오리액터 시스템의 조립, 작동 및 성능을 시연합니다.

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

이 절차의 전반적인 목표는 많은 양의 포유류 세포를 성장시키는 것입니다. 이는 먼저 pH 및 용존 산소 또는 do 프로브를 보정한 다음 pH, do 프로브 및 온도 프로브 슬리브를 고압멸균하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 프로브와 슬리브를 용기에 삽입하고 용기를 생물 반응기에 배치하고 배기 장치, 필터, 가스 라인 및 온도 프로브를 연결하는 것입니다.다음 단계는 DO 및 pH 케이블을 연결하고 바이오리액터로 펌핑되는 배지 및 마이크로 캐리어를 무균 방식으로 연결하는 것입니다. 마지막 단계는 바이오리액터가 원하는 임펠러 속도, 온도 및 산소 포화도를 달성할 수 있도록 컨트롤러를 시작하는 것입니다. 궁극적으로, 접종 및 컴퓨터 모니터링 후, 배양액은 원하는 산물의 추출 및 정제를 위해 처리될 수 있습니다.재사용 가능한 교반 탱크 바이오리액터와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 에어 휠 바이오리액터가 사용하기 쉽고 미생물 오염 가능성을 최소화한다는 것입니다. 시작하자. 프로토콜을 시작하려면 hello 화면에 로그인합니다.그런 다음 pH 센서를 검사하고 센서 팁에 전해질 용액이 채워져 있는지 확인합니다. pH 4 용액이 있는 비커 하나, pH 7 용액이 있는 다른 비커, 증류수가 담긴 세척 병을 구합니다. 그런 다음 pH 케이블을 pH 센서에 연결합니다.hello 인터페이스의 actions(작업) 탭으로 이동하여 calibrate(보정)를 선택합니다. 그런 다음 PHA 탭과 2점 보정을 선택합니다. 교정 용액 온도 필드에 버퍼 온도를 입력합니다.보정할 pH 4 용액에 센서를 놓고 0 필드에 값을 입력합니다. 그래프가 안정화되면 pH 센서를 증류수로 밀어 보정하고 헹굽니다. pH 7에 대한 보정을 반복하고 설정을 저장합니다.span 필드에 버퍼 값을 입력하고 이식편이 안정화될 때까지 기다립니다. 용존 산소를 시작하거나 보정을 수행합니다. DO 센서가 몇 시간 동안 시스템에 연결되어 있고 calibrate 탭에서 극성이 지정되었는지 확인하고 DOA 및 2점 교정을 선택합니다.DO 센서를 분리합니다. 0 탭에 0을 입력하고 그래프가 안정화될 때까지 기다립니다. calibrate one을 선택하기 전에 do 센서를 다시 연결하고 span 필드에 100을 입력합니다.그래프가 안정화되면 2 보정을 클릭합니다. 그런 다음 설정을 저장하고 프로그램을 닫습니다. 보정 후 센서와 열 웰을 오토클레이브 파우치에 넣고 섭씨 30도 및 121PSI에서 15분 동안 오토클레이브합니다.오토클레이브가 완료된 후 오토클레이브 파우치를 70% 이소프로필 알코올로 소독하고 파우치를 생물 안전 캐비닛 또는 BSC로 옮깁니다. 시약 용기를 소독하고 BSC에 도입합니다. 내부 포장을 제거하고 용기와 튜브에 손상이 있는지 검사합니다.다음으로, 시약 용기의 전면 좌측 포트에 DO 센서를 설치하고 후면 좌측 포트에 열 웰을 설치합니다. 설치할 오른쪽 전면 포트에 pH 센서를 설치하십시오. 센서 캡을 열고 센서를 용기 상단의 포트에 가볍게 끼웁니다.그런 다음 선박을 BSC 밖으로 옮깁니다. pH 및 DO 센서 케이블이 용기 슬리브 외부에 있고 슬리브 내부에 아무 것도 없는지 확인하십시오. 앞쪽을 향하도록 용기를 잡고 용기 발을 먼저 슬리브에 밀어 넣습니다.용기의 바닥이 히터에 놓여 있는지 확인하십시오. 그런 다음 온도 센서를 용기 열에 조심스럽게 끼웁니다. 잘. 그런 다음 백에서 튜빙 세트를 제거합니다.튜브의 색상 코드를 생물반응기 제어 장치의 해당 커넥터 및 펌프와 일치시킵니다. 매체 추가 및 샘플링 라인을 DO 센서와 열 뒤에 배선합니다. 튜브를 생물 반응기 왼쪽에 있는 색상으로 구분된 펌프에 잘 삽입합니다.메인 가스관과 마이크로 가스관을 연결합니다. 주 가스 라인 커넥터를 가스 배출구에 눌러 주 가스 라인을 설치하십시오. 그런 다음 마이크로 가스 라인 커넥터를 가스 배출구에 시계 방향으로 돌려 마이크로 가스 라인을 설치합니다.필터 오븐 튜브를 설치하려면 필터 오븐을 열고 배기 필터 튜브를 uan에 고정합니다. 튜브가 두 개의 고리를 통해 필터로 들어가 오븐에서 나오는지 확인하십시오. 필터 오븐 바닥에 있는 고리를 통해 하단 라인을 배선하고 도어를 닫습니다.그런 다음 케이블을 DO 및 pH 센서에 연결합니다. 설치가 완료된 후 사용하지 않는 미디엄 에디션 라인과 미디엄 보틀 백 소스 사이에 루어 피팅을 사용하여 멸균 연결을 형성합니다. Hello 인터페이스의 작업 탭으로 이동합니다.제어 펌프를 클릭하고 미디어 펌프를 선택한 다음 슬라이더를 클릭하여 미디어 펌프를 켭니다. 그런 다음 1.5-3.0리터의 미디어를 추가하고 슬라이더를 클릭하여 펌프를 끕니다. 이제 이 시스템은 이전에 준비된 마이크로 캐리어를 반응기로 펌핑할 준비가 되었습니다.덧셈줄을 사용하여 추가할 수 있습니다. 멸균 루어 잠금 장치를 사용하여 MICROCAR 병을 적절한 추가 라인에 부착합니다. 제어 펌프 화면에서 추가 펌프를 켭니다.마이크로 캐리어를 추가한 후 슬라이더를 사용하여 펌프를 끄고 hello 인터페이스의 메인 화면으로 다시 이동하여 작업을 선택한 다음 고급을 선택합니다. 적절한 컨트롤러를 선택하여 설정을 편집합니다. 컨트롤러를 자동으로 설정하고 설정값을 입력합니다.컨트롤러를 설정한 후 공기 펌프를 켭니다. 시약 용기 내부를 살펴보고 에어 휠이 회전하고 있는지 확인하십시오. DO 센서가 완전히 편광되어 있고 do 값이 안정화되었는지 확인합니다.그런 다음 하나의 주황색 밴드로 식별되는 미사용 배지 추가 라인과 루어 피팅을 사용하여 셀 병 백 소스 사이의 멸균 연결인 do 센서 형태를 보정합니다. 그런 다음 튜브의 실리콘 부분을 미디어 펌프에 설치합니다. 튜빙 cl을 확인하십시오.amp 열려 있고 분기 튜빙 clamp 닫혀 있습니다.제어 펌프 탭으로 이동한 다음 미디어 펌프를 켭니다. 셀을 추가하고 미디어 펌프를 끕니다. 접종 후 작업 탭으로 이동하여 샘플 채취를 선택합니다.샘플링 튜브가 샘플링 펌프에 있는지 확인하고 s를 조작합니다.amp화면의 지시에 따라 링 스톱 콕. 세포 계수를 위해 샘플과 함께 주사기를 제거하고 다른 다운스트림 응용 분야에서 세포 계수를 수행합니다. 마지막으로, 세포가 1.2 곱하기 10의 원하는 밀도에 도달하여 밀리리터당 6개의 세포에 도달하면, 20밀리리터 주사기에 바이러스 접종물을 정화조로 첨가합니다.주사기를 반응기의 예비 추가 포트에 연결합니다. 제어 펌프 화면을 사용하여 덧셈 펌프를 켜고 바이러스 접종물을 추가합니다. A 5 49 세포의 대다수는 2시간 이내에 마이크로 캐리어에 부착되었습니다.12시간 후, 세포는 편평해지고 마이크로카 표면에서 퍼지는 징후를 보였습니다. 24시간까지 마이크로 캐리어는 세포의 균일한 분포를 보였습니다. 마이크로카 집락화는 여기에서 보여준 것처럼 빠르게 발생합니다.54 9 세포에 의한 마이크로카 집락화의 비율은 24 시간까지 75 %입니다. 이 그래프는 아데노바이러스 감염 전후에 배양된 54 9 세포의 수를 보여줍니다. 세포는 48시간 후에도 밀리리터당 100만 개의 세포로 기하급수적으로 계속 성장합니다.이 비디오를 시청한 후에는 세포 또는 단백질 생산을 위해 포유류 세포를 고밀도로 성장시키기 위해 에어휠 생물 반응기를 조립하고 작동하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 마이크로 bioreactors에서 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 플랫폼을 설명합니다. 하나의 칩 10 미오 최대 집 수 있습니다. 멸균, 폐쇄 순환 루프에서 유체 흐름, 산소 장력 등에 관한 정확하게 정의된 조건 하에서 재배 세포 수 있습니다.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

우리 그룹은 심장 혈관 시스템의 생리 타악기의 스트레스가 implantable 작은 직경 혈관 이식을 다시 생성하기 위해 일일 생물 반응기 문화 시스템을 개발했습니다.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

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여기에서, 우리는 단백질 A 열을 사용하여 세포 수확 및 단백질 정량화에 선행된 자동화된 마이크로 bioreactor에 있는 실험의 디자인을 실행하는 상세한 절차를 제시합니다.

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후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

여기에서는 GMP 등급의 용해성 마이크로캐리어를 기반으로 하는 완전 폐쇄형 시스템을 통해 부착 세포의 대규모 제조를 달성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 중간엽 줄기 세포, HEK293T 세포 및 Vero 세포의 배양은 검증되었으며 세포 및 유전자 치료 산업의 수량 요구와 품질 기준을 모두 충족했습니다.

GMP 등급의 용해성 다공성 마이크로캐리어를 기반으로 한 대규모 셀 생산

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Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

배우세요 포유 동물 세포 대량 배양을 위한 단일 사용 공압 생물 반응기 시스템의 조립 및 운영 방법을. pH와 용존 산소 센서 교정, 무균 연결, 세포 배양 조건 최적화 과정을 통해 오염 위험을 최소화하고 효율적인 세포 증식을 달성합니다.

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

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