Name: 대사 프로파일의 실시간 분석 전의 VIVO 마우스 장내 크립트 Organoid 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 마우스 장내 크립트 오가노이드의 실시간 대사 프로파일 분석 방법을. XF 24 세포외 유량 분석기를 사용하여 산소 소비율과 산화율을 측정함으로써 줄기세포 생물학 및 대사 연구에 중요한 생리학적 데이터를 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 보조금 RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 및 P3013330에 의해 지원되었다. 우리는 토굴 격리 프로토콜 개발에 소중한 의견을 미셸 휴스턴, 엘레나 Dhima 박사 안나 Velcich에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 직접 각각 해마 시설을 운영하는 당뇨병 교육 및 NIH P60DK20541 지원 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 연구 센터 박사 마이클 브라운 리 박사와 슈 리앙 뒤를, 감사합니다.

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 크립트의 분리 및 문화 <ol><li> 소장에서 납골당의 분리 : <ol><li> 관심의 마우스 모델에서 장 지하실을 격리 할 것. 자궁 경부 전위 다음 CO 2와 쥐를 안락사. </li><li> 길이 방향으로 복부를 열고 얼음 차가운 인산염 완충 생리 식염수와 소장 (SI)를 작성, PBS (-ca 2 +; -Mg 2+) 2 배 항생제 항진균제 (안티 - 안티)와. 신속 소장을 격리 할 것. </li><li> 철저하게 메스를 사용하여 장간막 지방의 무료 해부. 조직을 관통하지 않도록주의 - 모든 시간은 얼음 차가운 PBS와 촉촉한 조직 유지에. INTE을 엽니 다스타 인 세로 방향으로 얼음 차가운 PBS로 깨끗이 씻어. </li><li> 미리 냉각 슬라이드를 사용하여 융모를 긁어 부드럽게, 두 부분으로 소장을 잘라 젖은면 팁을 사용하여 평평. 얼음처럼 차가운 PBS 여러 번에 적극적으로 씻으십시오. </li><li> 조직의 비 효소 분해에 대해 3mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) /0.5 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) 당 1X PBS 20 ㎖의 3 분 부화. </li><li> 미리 냉각 슬라이드에 면도날을 사용하여 작은 조각 (2-4mm)로 조직을 잘라. 20 ml의 빙냉 PBS를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 조각을 전송. </li><li> 피펫은 위아래로 부드럽게 10 배 10 ml의 멸균 일회용 피펫을 사용하여. 조직 조각이 중력에 의해 침전하자. 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 세 개의 추가 번 반복; 확인 상층 액은 분명합니다. </li><li> 2 mM의 EDTA 당 PBS의 20 ML을 추가합니다. 소용돌이와 부드러운 락을 30 분 동안 4 ° C에서 배양한다. </li><li> 조직 침전물을하자 상층 액을 제거한다. 15 ml의 얼음 차가운 PBS 및 피펫 추가위로 10ml를 피펫으로 5 배 아래로. 조직 파편이 침전물하자 분수 1 (F1)과 상층 액을 수집합니다. F2-F5, 별도로 관리 각 부분을 수집 반복합니다. </li><li> 15 초 동안 손으로 격렬하게 15 ml의 얼음 차가운 PBS이 때 흔들림을 추가합니다. , F8을 F6를 수집하고 F7을 위해 반복합니다. 조직 조각이 떠 시작하면, 그들이 정착하기 위해 누릅니다. </li><li> 현미경 각 부분의 나누어지는을 검사합니다. 지하실을 포함하는 분획 풀. </li><li> 50 ML 튜브에 지하실을 수집, 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 풀링 분수를 전달합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 100 XG에 원심 분리기, 15 ML 튜브에 2 배 안티 - 안티 및 전송 납골당 10 ml의 얼음 차가운 PBS에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기합니다. 세차를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 배 안티 - 안티 - 10 ml의 얼음처럼 차가운 ADF, 고급 DMEM / F-12 (둘 베코 &quot;의 수정 이글 중간 / 햄&quot;의 F-12)로 한 번 지하실을 씻으십시오. </li><li> 한 번 납골당 10 ㎖를 씻어DF는 - 안티 - 안티 1 배. </li><li> 혈구를 사용하여 지하실을 계산합니다. 토굴 솔루션 볼륨을 조정하고 재현 탁 최종 토굴 농도가 젤라틴 단백질 혼합물 (마트 리겔)의 50 μL 당 100 ~ 500 지하실 될 수 있도록 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 젤라틴 단백질 혼합물에서 4 ° C 및 재현 탁 지하실에서 5 분 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 접시 토굴 50㎕의 - 24 웰 플레이트에 웰 당 단백질 젤라틴 혼합물을 현탁액 (성장 면적 : 2cm 2), 신중을 각 웰의 중앙에 현탁액 드롭을 배치. , CO 2의 서스펜션은 굳은 ~ 30 분까지 37 ° C 배양기를 접시를 유지한다. </li><li> 500 μl의 빙냉 완전 배양 배지 (고급 DMEM / 1X 방지와 F12 추가 - 안티 10 mm로 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1X 루타, 1X B27 보충, 1X N2 보충, 1mM의 N-L 아세틸 시스테인 (NAC), 50 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF), 100 / ㎖ ng를소량, 500 NG / ㎖의 R-Spondin). <ol><li> PBS 중 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 성장 인자를 재생성. </li></ol></li></ol></li><li> 크립트 Organoid 문화와 항로 : <ol><li> 항로 토굴 organoids 14-21일 포스트 시딩 (필요에 따라)은 다음과 같습니다 : <ol><li> 미디어 변경, 매주 금요일과 월요일. 수요일에, 새로운 미디어의 절반 미디어를 교체합니다. </li></ol></li><li> 문화 매체를 제거합니다. 5 분 간격으로 500 μL PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거하고 부드럽게 멸균 P1000 마이크로 피펫 팁을 사용하여 젤라틴 단백질 혼합물을 휴식. </li><li> 하나의 웰에 1 ml의 완전한 문화 매체를 추가하고 1 ml의 미디어 organoids를 재현 탁. </li><li> 부드럽게 피펫 팅과 20-30x 아래 P1000을 사용하여 organoids 중단 (일관성있는 기술까지 좋은 토굴 수익률 적절한 organoid 해리에 대한 현미경 검사 개발). </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 지하실로 이동;4 ° C, 5 분에 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ml의 완전한 배양 배지로 두 번 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 웰 당 50 μl를 매트 리겔에서 필요에 재현 탁 지하실 등의 6 : 3 또는 1 : 1의 비율로 분할. (섹션 1.1.16-18) 전술 한 바와 같이 진행합니다. </li></ol></li><li> 크립트 Organoid 냉동 : <ol><li> 문화 매체를 제거합니다. 500 μL PBS에서 샘플을 씻으십시오. </li><li> P1000 피펫 팁을 사용하여 젤라틴 단백질 혼합물을 분산. </li><li> 하나의 웰에 1 ml의 미디어를 추가하고 1 ml의 미디어 organoids를 재현 탁. </li><li> 부드럽게 아래로 20-30x 피펫 팅에 의해 P1000을 사용하여 organoids를 휴식. </li><li> 1.5 ML 튜브에 organoids을 전송합니다. 4 ° C, 5 분 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ml의 완전한 배양 배지로 두 번 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 미디어를 동결 500 μL에 재현 탁의 지하실. </li><li> cryotube로 전송 지하실은 -80 ° C 냉동고 overni에 냉동 컨테이너 및 저장소에 튜브를 배치GHT. </li><li> 액체 N 2 탱크에 지하실을 전송합니다. <ol><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 해동하여 냉동 토굴 organoids를 복구 할 수 있습니다. 상기 한 바와 같이 100 XG, 젤라틴 단백질 혼합물에서 5 분 및 재현 탁하고, 문화 500 μL로 완전한 문화 번 미디어, 원심 분리기를 씻으십시오. 더 나은 복구의 경우, 냉동 미디어 ROCK 저해제 (Y-27632)를 추가합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 크립트 Organoid 대사 분석 <ol><li> 24 웰 플레이트 준비 : <ol><li> 분리 및 프로토콜 (토굴 격리 및 토굴 통로 섹션 1.2 섹션 1.1 참조)에 따라 납골당을 계산합니다. </li><li> 젤라틴 단백질 혼합물에 재현 탁의 지하실 (20 μL 당 100 ~ 200 납골당). </li><li> 24 웰 분석 플레이트 플레이트 토굴 - 젤라틴 단백질 혼합물 서스펜션 (각 샘플에 대한 최소한 삼중 거기 있는지 확인) 현탁액은 CO 2에서 37 ° C에서 응고시킬 것인큐베이터; 500 μL 전체 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> (1.1 절에 설명 된대로) 및 납골당이 완전히 개발 organoids으로 성장할 때까지 현미경으로 관찰 문화 지하실. </li></ol></li><li> 세포 외 유출 분석 : <ol><li> 밤새 비 이산화탄소 하이드레이트 카트리지 (0 %의 CO 2), 37 ° C 배양기. </li><li> 배지를 제거하고 500 ㎕의 DMEM 회 organoids 세척 (않고 : 글루코스, L 글루타민, 피루브산 나트륨 및 중탄산 나트륨과 함께 : 페놀 레드). 5 분을 기다립니다. </li><li> 각 웰에 잘 분석 매체 당 (DMEM 2 mM L- 글루타민 (L-glutamine), 5 mM의 D 글루코스) 675 μl를 추가합니다. </li><li> organoids 및 젤라틴 단백질 혼합물은 세척 후 손상되지 않도록 토굴 organoids 미세한 형태를 확인합니다. 비 CO 2에서 1 시간, 37 ° C 배양기를 품어. </li><li> 10 μM 주사 가능한 화합물 (oligomycin, 카보 시안화 메틸 -p- 플루오로 - 메 톡시 페닐 히드라 존 (FCCP)를 준비, Rotenone) 분석 배지에서. </li><li> 설정 카트리지를 카트리지 순차적으로 포트에 10 μM 주 화합물의 75 μl를로드하여 : 포트 - oligomycin을; 포트 B - FCCP; 및 포트 C는 - 로테 논 (분석 중 최종 농도 1 μM 될 것입니다). </li><li> 카트리지 30 분을 품어 - 37 ° C에서 1 시간을 비 CO 2 배양기에서. </li><li> 동시에, XF 분석기를 켜고 분석 프로토콜 템플릿을 만들 수 있습니다. </li><li> 카트리지를 &quot;보정&quot;XF 분석기로 카트리지와 유틸리티 플레이트를 삽입하고 실행합니다. </li><li> 그들은 젤라틴 단백질 혼합물에 부착되어 있는지 확인하기 위해 현미경 토굴 organoids를 확인합니다. </li><li> 악기와 실행 분석 프로토콜에로드 세포 배양 접시입니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li>
<li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li>
<li>Medina, M. A., Castro I, N. unezde <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7(2013).</li>
<li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+changes+in+histone+modifications%2C+mRNA+levels%2C+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832%2F13+%CE%B2-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li>
<li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

더 공개가 없습니다.

우리는 기저 속도 측정 후, 토굴 대사가 oligomycin, 카르 보닐 시아 나이드를 첨가하여 평가 하였다. 산소 소모율 (OCR) 및 8 개월 된 마우스로부터 단리 organoids 체외로 성장 소낭의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)를 테스트 순차적으로 -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)와 로테 논,. 29 분 (그림 2A와 2B) - 기저 OCR 및 기초 ECAR은 0에서 기록되었다. 29 일 분에서 (포트)에서 oligomycin은 (모두 지하실 및 제어 우물, N = 3) 잘 각각 주입 하였다. Oligomycin는 ATP 합성 억제제이다. 이 상태 3 (인산) 호흡을 방지하기 위해 사용된다. 따라서 oligomycin 주입 인해 미토콘드리아 ATP 합성의 봉쇄, OCR 약간 저하 결과 및 소낭은 ECAR에서 증가하게 ATP 그들의 요구를 충족...

대장 암 (CRC)는 미국에서 암 관련 사망 원인 중 3 위를 차지한다. 산발적 인 대장 암은 - 즉 인생의 뒷부분에서 발생하는 (&gt; 50 세)와 명확한 걸리기 유전 적 요인과 -를 차지하고 ~ 강하게 장기식이 패턴 1, 2에 의해 영향을 발생으로 모든 경우의 80 %. 이 종양은 종양 세포의 증식 3-5의 높은 비율을 허용 아마도 운전하는 부분 (glutaminolysis을 통해) 사용 가능한 휴대 빌딩 블록과 에너지의 높은 농도를 만들 수 바르 부르크 효과로 알려진 산화 적 해당 작용에 대한 의존도를 향한 신진 대사 변화를, 전시 . 소장 암을 포함하여 대장 암에 대한 연구뿐만 아니라 다른 위장관 암 종양 형성의 원인으로 중요 통찰력을 제공. 탐지를 도울 수있다 위장 기관계의 정상 친 종양 및 종양 상태 사이의 차이를 조사 대사종양 발생에 대한 상대 위험뿐만 아니라 종양의 조기 발견 ermination. 또한, 미토콘드리아의 호흡과 당분을 포함하는 생체 에너지 대사를 이해하는 것은 세포 생리학, 노화 및 질병 상태가 장내 항상성을 교란하는 방법에 근본적인 통찰력을 제공 할 것입니다. 세포 외 플럭스 분석을위한 생체 에너지 분석 기술의 활용이 실시간으로 6,7 문화에서 성장 세포에서 동시에 미토콘드리아 호흡과 당분의 비율을 평가할 수 있습니다. 최근까지 소장의 시험 관내 연구는 양성 또는 악성 종양 중 -8,9- 유래 세포주에 한정되었고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 2009 년, 사토 등. (10)는 체외 배양 3 차원 (3D) 마우스 장내 상피 organoids를 성장 시스템, 또는 epith 소개실험 진단 및 치료 연구 (10, 11)에 적합 elial &quot;미니 용기&quot;. 또한, 열량 제한 쥐에서 분리 된 납골당은 문화 12 organoids 그들의 변화된 성장 특성을 유지한다. 형질 전환 된 세포주에 비해 토굴 organoid 배양 생체 상태를 이해하기 위해 훨씬 더 좋은 모델을 제시 생리 관련 데이터를 생성하는데 사용될 수있다. 우리는 장 토굴 organoids의 에너지 대사를 분석하는 생체 에너지 분석 기술을 적용. 마우스 장 토굴 organoids 제시 토굴 organoid 에너지 대사 연구 개발에 체외 배양 하였다. 산소 소비 속도 (OCR) 및 굴 organoids의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)가없는 두 개의 다른 대사 억제제 (oligomycin, 로테 논) 및 이온 담체 (보닐 시안화 메틸 -p- trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 존재하에 측정 하였다. 토굴 ORGA이러한 화학 물질에 솔레노이드 대사 반응은 성공적으로 변화 ECAR 및 OCR 값을 반영했다. 셀룰러 바이오 에너지 연구는 암, 비만, 당뇨병, 대사 장애 및 미토콘드리아 질환 신진 대사 상태와 질병 위험과 표현형 사이의 상호 작용을 규명하고 병진 의학에 대한 직접적인 영향은 사전 심사 방법을 도움이 될 것입니다. 여기에, 우리는 상세한 프로토콜 소장 납골당을 분리하고 문화 토굴 organoids의 정보는 다음의 제품에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 대사 분석을 위해 토굴 organoid 문화를 사용하는 새로운 방법을 소개합니다.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수), 마그네슘 없음, 칼슘 없음, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>고급 DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>둘베코&프라임; s 수정된 독수리&프라임; 포도당, L-글루타민, 페놀 레드, 피루브산 나트륨, 중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 나트륨</td>염 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>DMEM에서 최종 농도 15 mg/l (D5030) - step 2.2.2</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>최종 농도 1x 또는 2x</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; 글루타맥스&트레이드; 보충</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>최종 농도 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>최종 농도 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 보충제, 액체</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; 보충제에서 비타민 A를 뺀 액체, 액체</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>최종 농도 1x</td></tr><tr><td>재조합 마우스 R-Spondin 1, CF, 50 &mu; g</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>최종 농도 500 ng / ml</td></tr><tr><td>재조합 쥐 EGF, 100 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>최종 농도 50 ng / ml</td></tr><tr><td>재조합 쥐 Noggin, 20 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>최종 농도 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-글루타민, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>최종 농도 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg; 포도당 분말</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>최종 농도 5</td></tr><tr><td>mM Ambion&reg; 0.5 M EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>최종 농도 <강>단계 1.1.5</강>의 경우 3mM, <강>단계 1.1.8</강></td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td>DTT (디티오트레이톨), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>최종 농도 3 mM</td></tr><tr><td>알부민 소 혈청 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td> PBS 태아 혈청 (FBS)<td>에서 0.1%</td></tr> <tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>PBS</td></tr><tr><td>회수 및 거래에서 1%; 세포 배양 냉동 매체</td><td>생명 기술</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 (Y-27632)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>최종 농도 10 &mu; M</td></tr><tr><td>올리고마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>O4876</td><td>최종 농도 1 &mu; M</td></tr><tr><td>카르 보닐 시안화물 -p- 트리 플루오로 - 메 톡시 - 페닐 - 히드라 존 (FCCP)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>C2920</td><td>최종 농도 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>최종 농도 1 &mu; M</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>221465</td> PBS XF24 세포 외 플럭스 분석기(XF 분석기)<td>에서 최종 농도 0.1N</td></tr> <tr><td></td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

대사 프로파일의 실시간 분석 전의 vivo 마우스 장내 크립트 organoid 문화

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

소장 점막은 두 가지 기본적인 구조로 구성 반복적 인 구조 전시 : 융모, 장 내강으로 돌출 성숙 장 세포, 술잔 세포와 enteroendocrine 세포 구성을; 및 점막하 근육 판과, 은닉 성체 줄기 및 전구 세포 및 성숙한 Paneth 세포 근위뿐만 아니라 간질과 토굴 미세 환경의 면역 세포를있는 소낭. 지난 몇 년 전까지의 소장 시험 관내 연구에서 양성 또는 악성 종양 중 하나로부터 유래 된 세포주로 제한하고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 여기서 우리는 사토 등의 알에서 적응하는 방법. (2009) C57BL / 6 마우스에서 파생 된 기본 마우스 장 토굴 organoids을 배양를 보여줍니다. 또, 측정에 의해 실시간으로 토굴 대사 프로파일을 분석하는 토굴 organoid 배양의 사용을 제시기저 산소 소비, 당분 레이트, ATP 생산 및 호흡 능력, 표준. Organoids는 소스에 의해 정의 된 속성을 유지하고 산소 소비와 세포 외 산성화 속도에 의해 반사 된 대사 적응의 측면을 유지합니다. 이 토굴 organoid 문화 시스템에서 실시간 대사 연구는 토굴 organoid 에너지 대사를 연구하는 강력한 도구이며, 어떻게이 영양과 약물 학적 요인에 의해 변조 될 수 있습니다.

크립트 organoids 8 개월 된 C57BL / 6 마​​우스에서 설립되었다가 영양 76A (AIN76A)의 설치류 다이어트 미국 연구소 정제 먹인. 장 토굴 organoids는 하나의 토굴 (그림 1A, 하나의 빨간색 화살표)에서 연장 된 기간 동안 문화에서 재배 할 수있다. Organoids 문화 18 ~ 20 일 (그림 1B, 빨간색 화살표)를 토굴 같은 구조를 성장. 납골당은 모든 삼주 계​​대하고 organoids 효율적으로 각각의 통과 다음 회복했다. 해마 생물 에너지 학 계측 실시간으로 문화에서 성장 세포에서 동시에 미토콘드리아 호흡과 당분의 비율을 평가할 수 있습니다. 우리는 토굴 organoid 신진 대사를 분석하기 위해이 기술을 적용. 8개월 생쥐 공급 AIN76A 정제 다이어트에서 파생 organoids, 우리는 측정 :. 1 산소 소비 속도, OCR은 그림 2a...

소장 토굴 organoids 줄기 세포와 그 틈새에 의존 소낭의 성장을 되풀이 조직 배양 시스템을 제공하는 생체 외 배양. 우리는 기본 마우스 토굴 organoids에 실시간으로 대사 프로파일을 분석하는 방법을 설립했다. 우리는 organoids 자신의 소스에 의해 정의 된 생리 학적 특성을 유지했습니다.

대사 프로파일의 실시간 분석 전의 VIVO 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

이 절차의 목적은 일차 마우스 crypt 오가노이드의 대사 프로파일을 실시간으로 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 마우스의 소장을 채취한 다음 matrigel에서 Andre bending의 장샘을 분리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 완전히 자란 소낭선 오가노이드를 형성할 때까지 소굴을 배양하는 것입니다.다음 단계는 대사 연구를 위한 카트리지 분석을 준비하는 것입니다. 마지막 단계는 카트리지와 유틸리티 플레이트를 XF 24 세포외 플럭스 분석기에 로드하고 세포 외 플럭스 분석을 실행하여 K crypt 오가노이드의 산소 소비율과 세포 외 산성화율을 측정하는 것입니다. 궁극적으로 이 절차를 통해 일차 마우스 장샘 오가노이드의 대사 프로파일을 실시간으로 연구할 수 있습니다.대사 에세이에 세포 배양을 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 장 암호화 장기 대사를 실시간으로 평가할 수 있다는 것입니다. 오가노이드 배양은 면역 상태를 보다 정확하게 모방하여 보다 생리학적으로 관련성 있는 데이터를 생성하는 데 도움이 됩니다. 이 기술은 다른 XI 3D 오가노이드 배양 분석으로도 확장될 수 있습니다.이 방법은 종양 발생 중 소장 크립스의 대사 변화를 특성화하는 것과 같은 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 정상 상태와 질병 상태의 대사를 비교하는 것과 같은 당뇨병 및 대사 연구에서 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 안락사된 쥐의 복부를 세로로 엽니다. 소장을 얼음처럼 차가운 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS와 2개의 항생제 항진균제로 채웁니다.그런 다음 소장을 신속하게 분리하십시오. 메스로 장간막 지방을 제거합니다. 조직에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하고 전체 시술 동안 얼음처럼 차가운 PBS로 조직을 촉촉하게 유지하십시오.장을 열고 얼음처럼 차가운 PBS로 철저히 씻으십시오. 그런 다음 소장을 두 부분으로 자릅니다. 젖은 면봉을 사용하여 평평하게 펴십시오.그런 다음 프리코 슬라이드를 사용하여 VII를 부드럽게 긁어냅니다. 얼음처럼 차가운 PBS에서 조직을 여러 번 세게 씻습니다. 그런 다음 3 밀리 몰 EDTA 및 0.5 밀리 몰 DTT와 함께 1 XPBS 20 밀리리터에서 3 분 동안 배양합니다.그런 다음 프리코 슬라이드에서 조직을 2-4mm 조각으로 자릅니다. 면도날을 사용하여 20ml의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 50ml 튜브에 조각을 옮깁니다. 그런 다음 10 밀리리터 멸균 일회용 피펫을 사용하여 위아래로 10회 부드럽게 피펫팅합니다.조직 조각이 중력에 의해 가라앉은 후 피펫으로 SUP natum을 제거합니다. 절차를 세 번 더 반복하고 상등액이 깨끗한지 확인하십시오. 이제 조직 조각을 20밀리리터의 PBS가 들어 있는 50밀리리터 튜브와 2밀리리터의 EDTA SW로 옮기고 부드러운 흔들림으로 섭씨 4도에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다.그 후, 조직을 가라앉히고 supinate를 버리십시오. 15ml의 얼음 석탄 PBS와 파이프를 위아래로 5회 추가합니다. 조직 단편이 가라앉고 supinate를 분획 1로 수집합니다.절차를 반복하여 분수 2에서 분수 5를 수집하고 분수를 별도로 유지합니다. 다음으로 PBS라는 얼음 15ml를 넣고 15초 동안 손으로 세게 흔듭니다. 분수 6을 수집하고 분수 7과 분수 8에 대한 절차를 반복합니다.조직 조각이 뜨기 시작하면 튜브를 두드려 가라앉을 수 있도록 도와줍니다. 그런 다음 현미경으로 각 분획의 분취액을 검사하여 크립이 있는지 확인합니다. 이것은 나쁜 분수의 예이고 이것은 좋은 분수의 예입니다.Crips가 포함된 항목을 함께 당깁니다. 그 후, 뽑은 분획을 70미크론 나일론 세포 여과기에 통과시키고 50ml 튜브에 크립스를 수집합니다. 그 후, 샘플을 섭씨 4도, 5분 동안 100배 G로 원심분리하고, supinate를 버리고 PT를 2개의 x 항생제 항진균제로 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 다시 현탁시킵니다.그런 다음 Crips를 15ml 튜브로 옮기고 세척을 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 10ml의 얼음처럼 차갑게 샘샘을 한 번 씻고, 2개의 항생제 항진균제가 포함된 A DF advanced D-M-E-M-F 12를 사용합니다. 그 후, 항생제 항진균제 1개가 함유된 DF 10밀리리터로 소crypt를 한 번 세척합니다.그 후, 혈구 분석기를 사용하여 crypts를 세십시오. crypt 용액의 부피를 조정하고 1.5ml 튜브로 옮겨 재현탁 시 최종 crypt 농도가 20마이크로리터 젤라틴 단백질 혼합물당 100-200crypt가 되도록 합니다. 다음으로, 크립트 용액을 섭씨 4도에서 5분 동안 100배 G로 원심분리합니다.Senna를 제거하고 젤라틴 단백질 혼합물에 crypts를 재현탁시킵니다. 그 후, 24 웰 유틸리티 플레이트에 웰 당 20 마이크로 리터의 크립트 젤라틴 단백질 혼합물 현탁액을 플레이트합니다. 현탁액이 응고될 때까지 플레이트를 섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에 30분 동안 보관하십시오.그런 다음 500마이크로리터의 얼음처럼 차갑고 완전한 배양 배지를 각 웰에 추가하고 완전히 발달된 오가노이드로 자랄 때까지 Crips를 배양합니다.이 절차에서는 섭씨 37도의 비이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 카트리지를 수화합니다. 그런 다음 배양 배지를 제거하고 500마이크로리터의 DMEM으로 오가노이드를 두 번 세척합니다. 5분 후 각각에 675마이크로리터의 분석 배지를 추가합니다.그런 다음 크립트 오가노이드의 미세한 형태를 확인하여 섭씨 37도의 비이산화탄소 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 분석 매체에 10 마이크로 몰 주사 가능한 화합물을 준비합니다. 75마이크로리터의 10마이크로몰 주사 가능한 화합물을 카트리지 포트에 순차적으로 로드하여 카트리지를 설정합니다.다음으로, 섭씨 37도의 비이산화탄소 인큐베이터에서 30분에서 1시간 동안 카트리지를 배양합니다. 동시에 XF 분석기를 켜고 분석 프로토콜 템플릿을 생성합니다. 카트리지와 유틸리티 플레이트를 XF 분석기에 넣고 calibrate cartridge를 실행합니다.그런 다음 세포 배양 플레이트를 기기에 로드하고 분석을 실행합니다.여기에 표시된 프로토콜은 8개월 된 C 57 블랙 식스 마우스에서 2일 또는 18일 만에 파생된 크립트 오가노이드입니다. 문화. 이 그림은 산소 소비율과 세포 외 산성화 속도가 제시된 8개월 된 C 57 블랙 식스 마우스에서 유래한 오가노이드를 사용한 대사 분석을 보여줍니다. crypts는 빨간색으로 표시되고 컨트롤은 파란색으로 표시됩니다.카트리지에 사전 로드된 시약을 올리고 마이신, B-F-C-C-P 및 C 로테논으로 순차적으로 주입했습니다. 이 기술은 암 및 대사 분야의 연구자들이 환자 유래 크립트 오가노이드의 대사 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 장샘, 오가노이드 대사를 실시간으로 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 마우스의 소장에서 전체 소변선을 분리하는 기술을 보여줍니다. 분리된 전체 crypt는 수명이 길고 자가 재생되는 3D 오가노이드를 in vitro에서 증식시키는 데 사용할 수 있습니다.

Intestinal Crypts Isolation: A Method to Isolate Whole Crypts from Small Intestine of Murine 모델

이 비디오에서는 쥐의 장 조직 조각과 특정 장내 세균 간의 상호 작용을 연구하기 위해 생체 외 장 장기 배양 시스템을 설정하는 방법론을 설명합니다. 이 장치는 두 쌍의 입력-출력 포트로 구성되며, 첫 번째는 장 조직 내강을 연결하고 특정 박테리아 현탁액을 공급하고, 두 번째는 생체 외 조직 생존력을 유지하기 위해 장치의 웰에 매체를 지속적으로 공급합니다.

숙주-미생물총(Microbiota) 상호작용을 연구하기 위한 생체 외 장기 배양 시스템

향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

이 비디오 프로토콜에서는 1차 장 상피의 오가노이드에서 렌티바이러스 형질전환과 정량적 RT-PCR, RNA-마이크로어레이 및 면역조직화학에 의한 이러한 배양의 처리 및 다운스트림 분석에 대해 단계별로 설명합니다.

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

우리는 단계별 지침을 설명합니다 : 1) 렌티 또는 레트로 바이러스 변환을위한 자기 나노 입자를 사용하여 장 오르가노이드를 효율적으로 엔지니어링하고, 2) 엔지니어링 된 오르가노이드에서 냉동 섹션을 생성합니다. 이 접근은 다운스트림 효력의 조사를 위한 organoids에 있는 유전자 발현을 능등하게 바꾸는 강력한 공구를 제공합니다.

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

이 문서는 전 생체 내 실험을 위한 새로운 창자 기관 배양 시스템을 사용하여 호스트-미생물군유전체 상호 작용을 분석하기 위한 독특한 방법을 제시합니다.

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

학습하세요 마우스 장내 크립트 오가노이드의 실시간 대사 프로파일 분석 방법을. XF 24 세포외 유량 분석기를 사용하여 산소 소비율과 산화율을 측정함으로써 줄기세포 생물학 및 대사 연구에 중요한 생리학적 데이터를 제공합니다.

대사 프로파일의 실시간 분석 전의 VIVO 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

더 많은 동영상 탐색