사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 "화물 매핑"분석

화물 매핑의 전반적인 목표는 소포 화물과 연관되어 이동하는 분자 운동 단백질의 상대적인 양과 유형을 결정하고 이러한 모터 구성을 실제 화물 이동의 방향성과 연관시키는 것입니다. 이것은 먼저 미세유체 장치에서 1차 마우스 해마 뉴런을 성장시켜 축삭돌기가 상대적으로 곧게 성장하도록 하고 일시적으로 형질주입된 뉴런의 축삭에서 형광 표지된 화물 단백질의 실시간 세포 내 이동을 기록함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 살아있는 화물 이미징 과정에서 뉴런을 고정한 다음 kinesin 및 dines와 같은 분자 운동 단백질에 대한 항체로 축삭을 염색한 다음 면역 형광 현미경 이미징을 수행하는 것입니다.

다음으로, 고정된 화물 및 모터 이미지는 면역형광 염색에 의해 결정된 염색된 관련 모터와 살아있는 화물 이동을 상관시키기 위해 크래프트라고도 하는 시간 경과에 따른 화물 이동 플롯에 정렬됩니다. 마지막 단계는 모터 공동 국소화(motor colocalization)라고 하는 맞춤 개발된 MATLAB 소프트웨어 패키지를 사용하여 화물 및 운동 단백질의 하위 픽셀 위치를 결정하는 것입니다. 이 소프트웨어는 각 화물 및 모터 위치의 정확한 XY 좌표뿐만 아니라 화물 및 모터와 관련된 상대적인 형광 강도의 양을 제공합니다.

궁극적으로, 서브 픽셀 해상도 수준에서 활선 및 고정 화물과 모터의 형광 현미경 검사의 상관 관계는 이동 방향성이 알려진 특정 화물과 관련된 모터 유형에 대한 정보를 제공합니다. 따라서 이 방법은 엑손 수송 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 이는 생명 현미경 검사와 면역 형광 염색을 연관시키는 다른 연구, 예를 들어 미세난관 역학 중 미세소관에 대한 단백질의 연관성 또는 세포내이입 중 단백질 동원과 같은 연구에 적용할 수 있습니다.

이 방법을 시각적으로 시연하면 이미징 고정 및 분석 단계를 수행하는 데 도움이 되며, 그렇지 않으면 특수 설정이 필요하기 때문에 배우기 어려울 수 있습니다. 이 절차를 위한 마우스 해마 1차 뉴런은 프로토콜 텍스트에 기인하는 대로 준비되고 신경 기저 난자 성장에 재현탁됩니다. 미세유체 장치에서 뉴런을 플레이트하는 매체.

microfluidic reservoir 1 및 one prime에서 매체를 제거합니다. 20마이크로리터의 세포를 미세유체 저장소에 적용하고 통과하도록 합니다. 장치를 섭씨 37도 5CO2의 인큐베이터에 20분 동안 놓습니다.

현미경 아래를 보고 세포가 덮인 유리에 부착되었는지 확인합니다. 모든 저장소를 채우기 위해 성장 배지인 neuro basal을 추가합니다. 9일째까지 세포가 있는 장치를 인큐베이터에 반환합니다.

배양에서 뉴런은 마이크로 채널을 통해 축삭을 확장하고 형광 단백질의 발현을 위한 형질주입 준비가 되어 있습니다. 형질주입된 쥐 해마 1차 뉴런의 실시간 이미징은 섭씨 37도의 인큐베이터와 CO2 제어 챔버가 장착된 도립 에피 형광 현미경에서 수행됩니다. 이 절차를 시작하려면 100 x 오일 대물렌즈를 선택합니다.

대물렌즈에 오일을 바르고 미세유체 장치에서 자란 해마 뉴런이 있는 커버 슬립을 현미경 스테이지에 장착합니다. 신경 세포의 사멸을 피하려면 신속하게 현미경에서 샘플을 1시간 이상 유지하지 마십시오. 미세유체 챔버의 채널을 통해 확장되는 형질주입된 세포의 축삭돌기를 찾습니다.

형질주입된 축삭돌기가 발견된 채널의 수를 기록합니다. 실시간 움직임의 최적 기록과 후속 공동 국소화 분석을 위해 핸드 탈리 카운터를 사용하여 채널 수를 계산합니다. 대부분의 소포의 이미징을 초점으로 수행할 수 있도록 채널을 통해 비교적 평평하게 자라는 축삭돌기를 선택하십시오.

chm 이식편에서 이동 궤적에 따라 고정된 이미지의 후속 정렬을 용이하게 합니다. 이미징하는 동안 마이크로 채널의 오른쪽 가장자리를 시야에 맞춥니다. 라이브 이미징 중에 세포를 성공적으로 고정하기 위해 한 사람은 고정제를 추가하고 다른 한 사람은 초점을 조정하는 두 사람과 함께 절차를 수행하는 것이 가장 좋습니다.

모든 시약을 준비하고 손이 닿는 곳에 두는 것도 중요합니다. 1 밀리리터 플라스틱 이송 피펫 사용. 저장소 2 및 2에서 매체 대부분을 제거합니다.Prime Start는 분석 중인 화물의 운송 역학에 특정한 타임 랩스 사양으로 실시간 화물 이동을 이미징합니다.

충분한 실시간 움직임 데이터를 수집한 후 한 사람이 예열 고정제로 저장 탱크 2와 2 프라임을 채우도록 합니다. 미세유체 장치를 만지면 라이브 이미징의 초점이 방해될 수 있으므로 만지지 마십시오. 고정제가 추가되는 동안 다른 사람이 초점을 조정하도록 합니다.

같은 방식으로, 저장 탱크 1과 1 프라임을 고정성 고정으로 채우는 것은 즉각적인 움직임 중단이 관찰 될 때 성공합니다. 그 후, 고정된 뉴런은 내인성 운동 단백질에 대한 항체로 염색되고 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 이미지화됩니다. 화물 매핑을 시작하려면 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 화물 이동의 크로모그래프를 생성합니다.

Rich Dorf Insights에서 개발한 Image J 플러그인은 상용 그래픽 소프트웨어를 사용하여 Kraft를 생성하는 데 권장되며, 화물의 면역형광 이미지를 화물 이동의 CHM 그래프에 수동으로 정렬하고, 고정 지점에서 CHM 그래프의 궤적 위치에 화물 펑크를 겹쳐서 각 화물 펑크가 CHM 그래프의 특정 궤적에 해당하도록 합니다. 최상의 정렬 결과를 얻으려면 매핑된 화물에 가장 초점이 맞춰진 Z 슬라이스를 사용합니다. Z 스택의 각 이미지에 대해 여러 Z 슬라이스를 사용할 수 있습니다.

확립된 알고리즘을 사용하여 각 형광 반점에 대한 XY 좌표 및 강도 진폭을 결정하여 2D 가우시안을 3개 채널 각각의 점 소스를 나타내는 점 확산 함수에 맞춥니다. XY 좌표를 얻기 위해 Yakima DONA와 동료들이 모바일 또는 정지 궤적에 매핑된 각 개별 화물 푼크타에 대해 개발한 가우시안 피팅 알고리즘을 통합한 모터 공동 현지화라는 맞춤형 MATLAB 소프트웨어 패키지가 개발되었습니다. Kog 그래프에서, 모터 공동 국소화 프로그램의 결과에서 XY 좌표와 강도 진폭을 선택합니다.

여러 Zack 이미지를 사용하여 서로 다른 초점면에서 발견되는 더 많은 화물을 매핑할 수 있습니다. 매핑된 화물에 대한 개별 XY 좌표를 해당 Z 슬라이스의 각 모터 채널에 대해 얻은 좌표와 비교합니다. 동일한 초점면 내에서 신호를 보낸 화물 및 모터에 대해 화물의 반경 300나노미터 내에 있는 XY 모터 좌표를 결정하고 선택합니다.

모터 공동 국소화 소프트웨어 패키지를 사용하여 반경 300나노미터 내에 위치한 반점을 확인할 수 있습니다. 화물 매핑은 노란색 형광 단백질 또는 Y-F-P-P-R-P-C로 태그가 지정된 정상 프리온 단백질을 운반하는 소포의 수송을 축삭의 키네신 및 다이네 모터의 상대적인 양과 연관시키는 데 사용되었습니다. 이 그래프는 F-P-P-R-P-C 소포 움직임을 보여주며 점선은 라이브 이미징 중 고정 시간을 나타냅니다.

고정된 Y-F-P-P-R-P-C 소포의 형광 이미지와 Kinesin, 경쇄 1 및 다인의 해당 면역 형광 이미지가 크로모그래프에 정렬됩니다. 이 확대는 2D gian function 할당을 통해 3개 채널 각각의 면역형광 신호를 보여줍니다. 이 그래프는 Y-F-P-P-R-P-C 소포, kinesin 경쇄 1 및 야생형 뉴런과 KINESIN 중쇄가 없는 뉴런 사이의 COLOCALIZATION의 정량화를 나타냅니다.

Y-F-P-P-R-P-C 소포와 관련된 Kinesin 경쇄 1 및 Dine의 상대적인 양은 가우스 진폭에서 얻어지며 상대적인 운동량과 이동 방향 사이의 가능한 상관 관계를 면밀히 조사하기 위해 플롯됩니다. 야생형 뉴런의 이 예는 움직이거나 정지해 있는 Y-F-P-P-R-P-C 소포가 KINESIN 경쇄 하나 또는 식사 또는 둘 다와 연관되어 이 기술을 마스터하면 3일 이내에 수행할 수 있음을 나타냅니다. 약 10일 동안 micro fillic 장치와 1차 뉴런에 대한 pre-EM imaging 준비 외에도 3일 이내에 면역형광 염색 및 데이터 분석에 대한 실시간 이미징 이미징을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미세유체 장치에서 성장한 형광 표지된 화물과 뉴런의 실시간 움직임을 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이미징 중 C 세포를 고정하는 방법, 서브 픽셀 해상도로 공동 국소화를 분석하는 방법, 화물 및 분자 운동 단백질의 공동 국소화와 화물 이동의 상관 관계를 파악하는 방법.