1.3: 뉴런의 칼슘 이미징

칼슘 이미징은 칼슘 이온이 뉴런 기능에서 갖는 다양한 역할을 조사하는 데 매우 유용한 기술입니다. 칼슘 이온은 시냅스 소포에서 신경전달물질 방출과 같은 주요 기능을 제어하는 수많은 세포 내 신호를 생성합니다. 칼슘 이미징 방법을 사용하면 뉴런과 뉴런 조직 내의 동적 칼슘 플럭스를 직접 측정할 수 있습니다. 이 비디오는 칼슘 지시약 염료의 작동 방식, 칼슘 이미징 실험이 완료되는 방법에 대한 개요를 제공하고 마지막으로 이 기술의 일부 응용 분야에 대해 설명합니다.

먼저, 칼슘 지시약 염료의 생화학적 원리를 검토해 보겠습니다.

칼슘 지시약 염료는 Fura-2와 같은 변형된 킬레이터 분자로, 두 가지 주요 성분으로 구성됩니다. 첫 번째는 칼슘을 선택적으로 결합하는 킬레이터 부위입니다. 두 번째는 자외선의 여기 파장에 의해 조명될 때 특정 파장의 빛을 방출하는 형광 부위입니다.

칼슘이 염료에 결합하면 형광 특성이 변경되며, 이는 칼슘 농도의 변화를 정량화하는 방법을 제공하며, 이는 두 개의 서로 다른 여기 파장에서 이 뉴런이 방출하는 형광 강도의 차이로 표시됩니다.

대부분의 칼슘 지시약 염료는 세포막을 쉽게 통과할 수 있도록 추가로 변형되며, 뉴런과 함께 수조 용액에 도입되거나 전체 동물 연구를 위해 뇌 조직에 주입됩니다.

일부 염료는 칼슘의 결합 여부에 따라 이중 여기 또는 이중 방출 특성을 갖습니다. 예를 들어, 염료 Fura-2는 칼슘이 결합되어 있을 때와 결합되지 않을 때 다른 여기 파장을 갖습니다. 두 excitation 파장에서 방출 강도의 비율을 취하면 칼슘 농도를 훨씬 더 정확하게 추정할 수 있습니다.

Fura-2와 같은 이중 여기 또는 방출 염료는 비율계량 칼슘 지표라고 합니다. 단일 excitation 및 emission 파장을 갖는 Non-ratiometric dyes가 존재합니다. 그러나 그들은 장시간 빛에 노출되면 형광이 약화되거나 손실되는 광표백에 더 취약합니다.

실험에서 염료를 사용하기 전에 중요한 단계는 알려진 칼슘 농도의 용액으로 염료에서 취한 형광 측정을 보정하는 것입니다. 이를 통해 과학자들은 실험 중에 측정된 방출 강도를 기반으로 세포 내 칼슘 농도를 정확하게 추정할 수 있습니다.

이제 칼슘 지표가 어떻게 작동하는지 배웠으니, 도금된 뉴런에서 칼슘 플럭스를 이미지화하는 방법을 탐구해 보겠습니다.

Fura-2와 같은 칼슘 지시약 염료를 준비하고 이를 추가 생리학적 용액과 혼합하는 것으로 시작합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위한 솔루션을 소용돌이치십시오. 충분히 섞이면 접시에 옮깁니다. 이제 배양된 뉴런이 있는 커버 슬립을 염료 용액이 있는 접시에 놓습니다. 다음으로, 적절한 온도(이 경우 37°C에서 30분)에서 필요한 시간 동안 어둠 속에서 뉴런을 배양합니다. 잠복기가 끝나면 커버슬립을 염료가 없는 접시에 옮깁니다.

다음 단계는 커버슬립을 현미경의 이미징 챔버에 장착하는 것입니다. 장착되면 관류 시스템의 입력 라인을 연결하고 챔버를 천천히 채웁니다. 챔버를 현미경 스테이지에 고정하고 출력 관류 라인을 설치하여 관류 시스템 전체에 걸쳐 지속적인 흐름을 보장합니다.

이제 현미경 스테이지가 준비되었으므로 가시광선을 사용하여 뉴런에 초점을 맞춥니다. 340 및 380nm 파장에서 세포를 조명하여 염료를 테스트합니다. Fura-2의 경우 칼슘이 결합되어 있지 않기 때문에 활성화되지 않은 뉴런이 380nm까지 여기될 때 더 많은 빛을 방출해야 합니다.

다음으로, 실험을 시작하기 전에 다이내믹 레인지를 최적화하기 위해 카메라 설정을 조정합니다. 각 파장에서 이미지를 수집한 다음 관심 영역 또는 ROI 도구를 사용하여 각 파장의 배경 강도를 측정합니다. 배경 값을 제어 소프트웨어에 입력하여 후속 이미지에서 뺄 수 있습니다.

초기 설정이 완료되면 실험을 위해 이미지화할 5개 정도의 시야를 선택하고 제어 소프트웨어에 좌표를 저장합니다. 실험 중에 자동화된 스테이지는 필드로 이동하여 340 및 380nm 파장에서 필드 강도의 비율을 수집하고 모든 필드가 수집될 때까지 다음 필드로 이동합니다.

일부 실험에서는 세포 내 칼슘 수치에 변화를 일으키는 관류액에 약리학적 제제를 첨가합니다. 뉴런을 탈분극시키는 고칼륨 용액은 이 타임 랩스 시리즈 이미지에서 볼 수 있듯이 세포 내 칼슘 농도를 상승시킬 수 있으며 좋은 양성 대조군 역할을 합니다. 데이터 수집이 완료되면 분석을 진행합니다.

결과를 분석하려면 소프트웨어를 사용하여 뉴런 또는 뉴런의 일부를 포함하는 관심 영역을 선택하십시오. 다음으로, 소프트웨어를 사용하여 수집된 모든 이미지의 각 ROI에서 두 파장의 이미지 비율계량 강도 정보를 측정합니다. 이 정보를 통해 시간 경과에 따른 세포 내 칼슘 농도의 변화에 대한 정량적 평가를 수행할 수 있습니다.

이제 뉴런의 칼슘 이미징이 어떻게 이루어지는지 이해했으므로 이 귀중한 방법이 오늘날 연구에 적용되는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.

무엇보다도, 칼슘 이미징은 세포 내 칼슘이 신경 활동과 관련하여 어떻게 변동하는지 조사하는 데 사용됩니다.

이 연구에서는 개별 뉴런을 칼슘 지시 염료로 채우는 동안 패치 클램프를 기록했습니다. patch-clamp 기법으로 구현되는 멤브레인 전위의 정밀한 제어는 칼슘 플럭스 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.

칼슘 이미징을 통해 연구원들은 뉴런의 고도로 동기화된 네트워크 활동을 조사할 수 있습니다.

여기에서 신경과학자들은 칼슘 이미징을 사용하여 40개 뉴런의 형광 신호를 평가했습니다. 이 정보를 사용하여 신호 전파 및 신경 상관과 같은 네트워크 속성을 결정할 수 있습니다.

칼슘 역학은 또한 뉴런이 냄새와 같은 외부 세계의 신호를 어떻게 처리하는지 밝힐 수 있습니다.

이 실험에서는 쥐의 코에서 추출한 페로몬 감지 기관을 배양하여 배양했습니다. 조직 내의 뉴런을 Fura-2로 배양하고 소변 또는 정제된 페로몬과 같은 냄새 물질을 제공하면서 이미지화했습니다. 후각 뉴런에서 냄새 수용체 단백질의 발현을 조작함으로써 단일 단백질이 고유한 냄새에 반응하는 세포의 능력에 어떤 영향을 미치는지 직접 시각화할 수 있습니다.

당신은 방금 뉴런의 칼슘 이미징에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이 비디오에서는 이 기술의 특성에 대해 논의하고 일반적인 실험을 검토했습니다.

칼슘의 많은 중요한 역할을 감안할 때, 칼슘 이미징은 뉴런과 뉴런이 서로 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 데 중요한 도구로 남을 것입니다.

시청해 주셔서 감사합니다!