Name: 신생아 마우스의 정맥 주사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 배우세요 신생아 마우스의 비침습적 정맥 주사법으로 소아 질환 연구에 필요한 시험 물질을 효과적으로 전달하는 방법을 익히세요. 이 기술은 1-2일령 마우스를 대상으로 하며 정확한 치료제 전달을 가능하게 합니다.

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저자는 금융 지원을위한 SMA의 NINDS, FightSMA, 가족을 인정하고 싶습니다. SEGL은 NINDS 훈련 보조금 # 5T32NS077984-02에 의해 지원됩니다.

프로토콜에 나열된 모든 절차는 오하이오 주립 대학의 동물 사용 및 관리위원회 (IACUC) 연구소 승인되었습니다. 작업 1. 준비 <ol><li> 깔짚, 해부 현미경, 90 °로 주사 (광원의 사용 각도로 위치 될 수 광원으로부터 댐을 분리하는, 빈 케이지 마우스 새끼 마취 젖은 얼음 수집 &#160; 주사 부위에 각도는 정맥), 주사에 대한 동물을 배치 깨끗한 표면, 면봉, 3/8 &quot;30 G 바늘 (동물 당), 1 % 에반스 블루 염료 3/10 CC 인슐린 주사기 (가린다 교육을위한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)) 솔루션을했다. </li><li> 새끼를 조작하면서 별도의 케이지에 댐을 제거합니다. </li></ol> 2. 사출 절차 <ol><li> 동물을 마취하는 30 ~ 60 초 동안 얼음물에 직접 하나의 강아지를 놓습니다. t 방치하지 마십시오인해 심실 세동, 조직의 저산소증과 대사성 산증을 포함하여 저체온증과 관련된 합병증의 위험에 너무 오래 얼음에 그는 동물. 참고 : 우리의 경험은 30 ~ 60 초 분사를 허용하는 강아지의 움직임을 느리게하기에 충분하다는 것이다. 깊은 마취가 요구되는 경우, 예컨대 1 ~ 2 %의 이소 플루 란과 같은 흡입제가 적절할 수있다. </li><li> 동물이 얼음에 있지만, 에반스 블루 염료의 30 μL와 주사기를로드합니다. </li><li> 동물이 완전히 마취되면, 여전히 호흡하는 동안 얼음에 운동 부족에 의해 확인 현미경으로 이동합니다. 오른손 주입 들어, 오른쪽으로 동물의 총구에 직면한다. 이어 버드는 색인과 중간 손가락 (그림 1) 사이가되도록 이어 버드에 총구와 왼쪽 가운데 손가락 꼬리에 왼쪽 검지 손가락을 놓습니다. </li><li> 단지 피부가 조작 될 때 이동하는 표면 모세 혈관의 이어 버드로 전방 검사합니다. 이 모세관하지만, 대상이 아니다식별은 시간 정맥 식별을 위해 중요하다. 다음에 관계없이 피부의 위치에 고정되어 모세관 열등 어두운 그림자가 정맥을 찾습니다. 시간 정맥, 그림자가 나타납니다 지느러미에 복부 실행하고, 경정맥 (그림 1)에 공급한다. </li><li> 바늘 베벨 위로 시간적 정맥을 입력합니다. 올바르게 삽입하면 바늘 베벨 피부를 통해 혈액으로 채워 볼 수있다. 그런 다음 천천히 플런저를 우울하게하고 노트는 얼굴의 측면 아래 정맥의 창백. </li><li> 바늘이 주입 물 역류를 방지하기 위해 첨가 10-15 초 동안 정맥 내 유지하도록 허용. </li></ol> 3. 주입 후 <ol><li> 적절한 주입 한 후, 강아지는 거의 즉시 파란색 설정해야합니다. 바늘을 제거하고 혈액 응고 될 때까지 주사 부위에 면봉을 적용하는 부드러운 힘을 사용합니다. </li><li> 고통의 흔적이 강아지를 모니터링합니다. 강아지 2 ~ 3 분 복구하고 rewarm 허용, R강아지가 케이지에 반환하기 전에, 의식 수직 및 이동 때 ecognize. 컵 탐정의 장갑을 낀 손에 새끼 필요한 경우 복구에 도움이되는 적절한 온기를 제공합니다. 선택적으로, 주입 된 새끼 온난화 촉진하는 홈 케이지 하에서 가열 패드를 배치. 일반적으로 에반스 블루 염료를 주입 한 후, 새끼를 안락사. 시험 물질을 주입 할 때 염료를 포함하지 마십시오. </li><li> 다시 홈 케이지에 강아지를 놓고 강아지가 댐에 의해 reacceptance을 보장하기 위해 침구 및 / 또는 nestlet로 코팅되어 있는지 확인합니다. </li><li> 불임을 유지하기 위해 각각의 강아지에 대한 새 주사기와 면봉을 사용합니다. </li></ol>

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<li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+scAAV9+delivery+of+a+codon-optimized+SMN1+sequence+rescues+SMA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice.</a> Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).</li>
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</ol>

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CNS 또는 몸 전체 에이전트의 혈관 배달 질환의 신생아 쥐 모델에서 어렵다. 설명 프로토콜은 정맥 최소한의 장비 요구 사항에 신생아 쥐에 솔루션을 관리 할 수​​있는 빠르고, 비교적 비 침습적 방법입니다. 시간적 얼굴 정맥을 육안으로 볼 수 있지만, 주사는 특히 unpracticed 인젝터, 현미경 및 광섬유 광원의 사용과 높은 정확도를 가질 수있다. 신생아 마우스에서 혈관 내 주사는 높은 성공률 (12)을 가지며, AAV 형질 도입은 주입 물 중 일부가 피하 투여해도 이른 새끼에서 관찰되었다. 주입은 잘 마우스 새끼에 의해 허용 및 FVB / N 또는 C57BL / 6 배경에 댐 아주 잘 새끼의 조작을 허용한다. 그러나 드문 경우에 댐 전체 새끼를 파괴 할 수 있습니다. 이러한 주사 성공적 1.6 g 내지 0.8 g 정도로 작은 마우스에서 수행 될 수있다. 대체 injectioN 신생아 쥐 루트는 미국과 복고풍 궤도, intrajugular 및 복강 내 10,15,22를 포함하여 다른...

소아 질병의 쥐 모델에서 중추 신경계 (CNS)에 대한 치료제의 배달는 도전 할 부분이 남아있다. 모델 신생아 질병 상태를 직접 CNS 내에서 적절한 구조에 삽입하기 어려울 수 있으므로 소형 및 발달 미숙 한 것을 마우스. 치료제의 혈관 내 주입 CNS 1-5과 3,5-9 망막을 포함한 몸 전체에 세포, 약물, 또는 바이러스 벡터를 제공 할 수있는 비 침습적, 내약성 방법이다. 이전 출판물은 해부 현미경 11, 12 않고, transilluminator가 10, 11을 사용하여 시간적 얼굴 정맥 주입을 설명, 또는 두 사람을 요구하는 것은 (10)를 삽입 할 수 있습니다. 한 개인이 새끼를 주입 할 수 있으며, 광원은 시간적 정맥이 강아지를 만지고 고정 표면 외과 테이프의 필요성 또는 강아지의 부착을 제거하지 않은 볼 때문에 프로토콜에서 설명 주입 기술은 유리한transilluminator가 11 등. 마우스에 아데노 - 관련 바이러스 벡터 혈청 형 9 (AAV9)의 전달은 뇌와 척수 (그림 1)를 통해 신경 세포와 성상 세포에 강력한 표현을 생성합니다. 피상적 시간적 안면 정맥 내로 바이러스 벡터의 전달을 확실하게 혈관 신경 근육 질환 소아 척수 근육 위축 (SMA) 2,4,13,14을 치료하는 신생아 마우스에서 다양한 연구에 사용 된 궁극적으로 처리 된 마우스의 수명을 증가되었다. 신생아 쥐의 혈관 내 주입도 효과적으로 말초 신경계 및 말초 기관 (그림 2)을 대상으로합니다. AAV의 주입 후, 후근 신경절, 간, 심장, 골격근, 폐, 그리고 창자의 myenteric 신경 얼기의 전달은 1,3,6,7,15을 관찰되었다. CNS와 주변의 대폭적인 전달은 글로벌 표현을 필요로하는 질병에 대한 분사 이상이 방법을 만든다이러한 고셔병 (16) 및 기타 리소좀 저장 질환 17, 18, ​​판자의 질병과 관련된 신경 ceroid lipofuscinoses, 19 Bardet-Biedl 증후군, 유아 (20)에서 발생하는 증상의 발병에 유전 적 다중 시스템 장애로 형질 전환 유전자,. 혈관 신생 생쥐에 주입은 모델링 시스템 전체 소아 질환의 신규 한 방법으로 고려되어야한다. 이 기술은 큰 동물 모델 5,21로 번역 한 내용 및 혈관 내 주입 이미 치료제를 전달 임상 적으로 허용되는 방법으로 존재한다. 현재의 프로토콜은 출생 후 하루 2 사출 늦어도 피상적 인 시간적 얼굴 정맥을 통해 신생아 쥐에 에이전트를 도출하는 간단하고 효율적인 방법을 설명하는 하나의 완성 할 수있다, 개인 연습을 잘 새끼와 어미 모두 허용됩니다. 새끼 최소한의 고통을 경험하고 신속하게 복구 할 수 있습니다. ImportanTLY, 성공적인 주입은 관리 에이전트의 글로벌 배달 될 것입니다. 이 프로토콜은 바이러스 벡터, 신생아 쥐에 제약 제제 또는 세포의 전달에 적합하다.

<table><tbody><tr><td>Thinpro 인슐린 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS30M3009</td><td>3/10 cc, 3/8" 바늘, 30 G, 마우스당 1</td></tr>개 <tr><td>Evans 파란색 염료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td>1x 인산염 완충 식염</td></tr>수 <tr><td>면 팁 어플리케이터</td>로 1%로 희석 <td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 광원</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 마우스의 정맥 주사

Intravenous Injections in Neonatal Mice

정맥 주사는 치료제를 제공하기 위해 임상 적으로 적용 가능한 방법이다. 성인 설치류 큰 동물의 경우, 정맥 주사는 기술적으로 가능하고 일상이다. 그러나 일부 마우스 모델은 잠재적 인 치료의 관리가 어려워 빠른 진행과 질병의 조기 발병을 가질 수 있습니다. 시간 (또는 안면) 정맥은 마우스에서 이어 버드에 전방 및 해부 현미경을 사용하여 머리의 어느 한쪽에 생후 명확 처음 이틀 동안 표시된다. 이 윈도우 동안, 시간적 정맥 50 μl의 최대 양으로 주입 될 수있다. 주사는 안전하고 잘 새끼와 어미 모두 허용합니다. 전형적인 주입 과정은 강아지가 홈 케이지로 복귀 된 후 1-2 분 이내에 완료된다. 제 생후함으로써 정맥 시각화 어렵고 주입 과정은 기술적으로 불안정해진다. 이 기술은 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) VECT의 전달을 위해 사용되어왔다차례로 선택한 바이러스 혈청 형에 따라 동물의 수명을 거의 몸 전체, 안정적인 형질 전환 유전자 발현을 제공 할 수 있습니다 ORS.

적절한 주입하는 동안, 정맥은 순간적으로 분명, 또는 희게을 설정해야합니다. 염료 주입하면 전체 강아지 초 ​​이내에 파란색 설정해야합니다. 부적절한 분사가 발생한 경우, 종종 주사 부위 밖으로 누출 될 머리 또는 목 주입 물에서 농축 피하 볼 러스있다. 부적절한 주사는 또한 목 주위에 멍이의 모양이 발생할 수 있습니다. (분사가 완전히 정맥에 배달되지 않은 IE) 일반적으로 더 아픈 부작용을 경험하지 않고 적절하게 주입 된 쥐처럼 일상적으로 치료에 반응 피하 주사를받을 새끼. 제공되는 치료에 따라, 성공적인 주입은 중추 신경계 및 말초 기관에 광범위하게 전달 될 수 있습니다. 닭 β 액틴 혼성 프로모터 (CB)와 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 자기 무료 아데노 - 관련 바이러스 혈청 형 (9)를 주입하면, 트랜스 (함께 "scAAV9 CB GFP"이라한다)유전자 발현은 다수의 뇌 영역에 걸쳐 신경 교세포 및 신경 및 척수 (도 2A-2...

소아 질환의 동물 모델은 초기 발병과 적극적인 질병의 진행을 경험할 수 있습니다. 임상 어린 마우스 모델에 관련된 치료 전달 기술적 어려울 수있다. 이 프로토콜은 생후 두 생후 일 이내 신생 쥐 비 침습적 정맥 주입 방법을 설명한다.

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

이 절차의 전반적인 목표는 신생아 마우스에게 테스트 물품을 정맥 주사하는 것입니다. 이것은 먼저 치료할 생후 1-2일 된 쥐를 식별함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 사출 재료를 준비하는 것입니다.다음으로 주입을 수행합니다. 마지막 단계는 치료를 받고 깨어난 쥐를 어미에게 돌려주는 것입니다. 궁극적으로, 검사 물품이 원하는 효과를 갖는지 여부를 결정하기 위해 다운스트림 분석이 필요합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 적절한 정맥을 식별하고 표적으로 삼는 데 가장 어려움을 겪습니다. 시작하려면 주입 절차에 필요한 모든 장비를 함께 모으십시오. 또한 PBS에 1%Evans blue dye를 준비하고 주입할 동물 1마리당 30게이지 바늘이 있는 인슐린 주사기 1개를 준비합니다.다음으로, 새끼를 조작하는 동안 댐을 별도의 케이지로 제거하십시오. 준비가 되면. 강아지 한 마리를 젖은 얼음 위에 30-60초 동안 직접 놓습니다.마취하기 위해. 동물이 얼음 위에 있는 동안 저체온증 관련 합병증의 위험이 있으므로 동물을 얼음 위에 너무 오래 두지 마십시오. Evan의 파란색 염료 30마이크로리터가 함유된 연꽃 주사기.동물이 완전히 마취되어 숨을 쉬는 동안 얼음 위에서 움직임이 없는 것으로 확인되면 오른손잡이 주사를 위해 현미경 아래로 옮기고 동물의 주둥이를 올바른 위치에 놓습니다. 주둥이에 있는 왼쪽 집게손가락과 왼쪽 중지를 이어버드에 끼워 이어버드가 검지와 중지지 사이에 있도록 합니다. 이어버드 바로 앞쪽에 피부가 조작될 때 움직이는 표재성 모세혈관이 있는지 검사합니다.이 모세관은 대상이 아닙니다. 그러나 측두 정맥 식별을 위해서는 식별이 중요합니다. 다음으로, 피부 위치에 관계없이 고정된 상태로 유지되는 모세혈관보다 아래쪽에 있는 어둡고 그늘진 정맥을 찾습니다.측두정맥은 그늘진 것처럼 보이며 등쪽에서 복부로 이어지며 경정맥으로 공급됩니다. 바늘이 비스듬하게 위로 향하게 측두정맥을 입력합니다. 올바르게 삽입된 경우.피부를 통해 바늘 경사가 혈액으로 채워지는 것을 볼 수 있습니다. 그런 다음 플런저를 천천히 누르고 얼굴 옆의 정맥이 희어지는 것을 확인하십시오. 주사의 역류를 방지하기 위해 바늘이 정맥 내에 10-15초 더 남아 있도록 합니다.적절한 주사 후 강아지는 파란색으로 변해야 합니다. 거의 즉시. 바늘을 제거하고 혈전이 생길 때까지 주사 부위에 면봉을 부드러운 힘으로 바릅니다.강아지가 회복하고 다시 데울

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

신생아 생쥐의 중추 신경계에 치료 요원들을 소개하는 뇌 (intracerebroventricular)와 (정맥 주사) 2) 체계로 : 1)이 문서 분사의 두 가지 방법을 보여줍니다.

마우스에 Intracerebroventricular을 통해 치료 대리점 납품 (ICV)과 정맥 (IV) 사출

출처: Seman, B. G. 외 그람 음성 세균성 패혈증의 신생아 영상 모델. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 캡슐화된 생물발광 박테리아를 이용한 신생아 마우스 모델을 시연하여 전신 감염을 연구합니다. 신생아 새끼들은 고용량 또는 저용량 박테리아 현탁액을 주사한 후 산후 관리를 위해 어미에게 돌려보냅니다. 캡슐화된 박테리아는 조기 면역 검출을 피하고 전신적으로 퍼지며, 발광 영상을 통해 시간이 지남에 따라 시각화됩니다. 이 모델은 신생아 쥐에서 감염 진행을 비침습적으로 추적할 수 있게 합니다.

캡슐화된 생물발광 박테리아를 이용한 신생아 쥐 감염 모델링

이 비디오는 신생아 마우스 뇌에서 쥐 거대세포바이러스(MCMV) 분포를 연구하기 위한 뇌내폐 주사 과정을 보여줍니다. 가시성을 위해 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하도록 설계된 MCMV는 새끼 쥐의 뇌 외측심실에 주입됩니다. 주입된 바이러스는 뇌척수액을 통해 순환하여 가장자리 영역, 맥락막 신경총 및 심실하 영역을 포함한 뇌실 주위 영역의 세포를 감염시킵니다.

신생아 마우스 뇌에서 쥐 사이토메갈로바이러스 분포를 분석하기 위한 뇌실 내 주사

신생아 인간의 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV) 감염은 정신 지체의 중요한 원인을 나타내는, 아직 바이러스에 의한 발병으로 이어지는 분자 이벤트가 여전히 제대로 이해하고 있습니다. 뇌 감염의 역학을 조사하기 위해, 우리는 전체 - 동물의...

사용<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징 신생아의 실험 쥐 거대 세포 바이러스 감염의 진행 상황을 모니터링 할 수

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

여기에서는 바이러스 입자 또는 형광 마이크로비즈를 신생아 쥐의 뇌에 뇌내실 및 혈관 내 주입하는 간단한 방법을 설명합니다. 바이러스와 나노 입자의 국소화 패턴은 현미경 평가 또는 현장 혼성화에 의해 검출될 수 있습니다.

신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입

우리는 murine 모델에 주입의 정 맥 및 양수 내 노선을 통해는 utero에 이식 (IUT)을 수행 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 독특한 면역 관용 태아 환경에 셀, 바이러스 성 벡터, 및 다른 물질을 소개 하는 것이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

여기에서, 자유형 접근법(즉, 입체적 장치 없이)을 사용하여 마우스에서 뇌내주사를 수행하기 위한 간단하고 신속한 접근법이 설명된다.

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

이 프로토콜은 신생아 기간 동안 쥐와 생쥐에서 사용할 수 있는 재현 가능한 정맥 투여 경로를 입증하는 것을 목표로 합니다. 이 절차는 주로 정맥 투여를 사용하는 신생아 치료실에서 약물 투여를 미러링하고자 하는 전임상 설치류 연구에 중요합니다.

후안와 정맥 주입의 신생아 설치류 모델

본 프로토콜은 유전자 편집 및 약물 전달을 위해 신생아 마우스에서 척수강내 주사를 수행하기 위한 단계별 지침을 설명합니다.

게놈 편집 및 약물 전달을 위한 신생아 마우스의 척수강내 주사

이 프로토콜은 신생아 마우스에게 소아 암세포를 정맥 주사로 전달하는 측두정맥 주입을 시연하여, 암에 대한 초기 면역 반응의 정밀하고 재현 가능한 모델링을 가능하게 합니다. 이 방법은 신생아 기간 동안 면역조절이나 치료와 같은 중재가 적용될 때 미치는 영향을 평가할 수 있게 합니다.

암세포에 대한 초기 면역 활동 평가를 위한 신생아 정맥 이식 모델

배우세요 신생아 마우스의 비침습적 정맥 주사법으로 소아 질환 연구에 필요한 시험 물질을 효과적으로 전달하는 방법을 익히세요. 이 기술은 1-2일령 마우스를 대상으로 하며 정확한 치료제 전달을 가능하게 합니다.

신생아 마우스의 정맥 주사

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