Name: 녹농균 유발 폐 손상 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 학습하세요 Pseudomonas aeruginosa 기관내 주입으로 마우스 폐 손상 모델을 만드는 방법을. 이 기법은 폐렴 유발 급성 폐 손상의 염증과 복구 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 HL105947-01(YL), HL07829-16(AM), HL090152(AM)의 지원을 받았습니다.

동물 실험은 시카고 일리노이 대학의 동물 관리위원회와 기관 바이오 안전성위원회에 의해 승인되었다. 참고 : 마스크, 보안경, 가운 또는 점프 수트, 더블 장갑 : 녹농균을 포함한 모든 절차를 포함 하나 이에 한정되지 않는다 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 방식으로 수행되어야한다. 인증 바이오 안전성 캐비닛에서 작동합니다. 표백제 또는 이산화 염소 소독제와 박테리아와 접촉 악기를 취급합니다. 전송 샘플 봉인 상자를 사용합니다. 1. P. aeruginosa의 문화와 성장 <ol><li> 스토어 P. -80 ° C에서 cryovial 스크류 캡에 세균 재고로 aeruginosa의 PA103. </li><li> 70 % 에탄올 젖은 종이 타월 상자에 랙에 유리 병을 놓고 바이오 안전성 레벨 2 (BSL2) 실험실에 걸릴. </li><li> 킬 양 혈액 아가 플레이트 상에 박테리아가 인큐베이터에서 15 시간 ~ 37 ° C에서 성장한다. </li&gt; <li> BSL2 후드, 5 ㎖ PBS에서 박테리아 루프 및 재현 탁과 접시에서 세균에 상처. </li><li> 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 재고를 보관합니다. 그러나, 역가에게 2 주마다 결정한다. </li><li> 직렬 (1시 10분 7 1:10 (4)로부터 보통) PBS로 세균을 희석 양 혈액 아가 플레이트에 공지 된 희석액을 플레이트. </li><li> ~ 15 시간 동안 번호판을 품어. 콜로니 카운트 박테리아 농도를 결정하기 위해 콜로니 형성 단위 (CFU)을 계산한다. </li><li> 적절한 농도를 재현 탁 (~ 5 × 103 CFU / μL) 1.5 ml의 멸균 스크류 캡 크리오 바이알 (cryovial) 0.5 ml의 PBS에서. 크리오 바이알 (cryovial)를 밀봉 스냅 뚜껑 상자에 살균제 라덴 종이 타월에 cryovial 랙에 배치합니다. </li><li> BSL2 동물 시설에있는 상자를 운반. 일단 거기, BSL2 캐비닛의 상자를 엽니 다. </li></ol> 2. P. aeruginosa에 떨어 뜨림 <ol><li> 생존 수술 무균 (멸균 장갑, 멸균 악기를 수행및 무균 기술). 살균 (멸균) 수술기구에 대한 작업 표면을 제공하기 위해 무균 드레이프를 사용합니다. 각 기관 점안 절차 사이에 뜨거운 구슬 살균기를 사용하여 악기를 소독. </li><li> 마취하기 전에 마우스의 무게를. , 케타민 (100 ㎎ / ㎏), 자일 라진 (xylazine) (5 ㎎ / ㎏)와 쥐를 마취 0.1 - 0.2 ml의 PBS 복강 내 (IP). 발가락 핀치에 비 대응하여 마취의 효과를 결정합니다. 마취하에 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> BSL2 캐비닛의 수술 보드에 마우스를 제지합니다. </li><li> 절단 아래의 영역을 식별합니다. 이 영역을 면도하고 3 회 알코올과 포비돈 요오드 면봉을 교대로 사용하여 피부를 준비합니다. </li><li> 이 마취 같은 기관에 액세스하기로 피부 절개 부 수술에 충분한로서 국소 마취제 (리도카인)와 절개 영역 치료. </li><li> 목의 정중선 작은 절개 (약 5mm)를 확인하고 무딘 F를 사용orceps 부드럽게 기관에 액세스 근육을 이동합니다. 수술 절개하여 기관을 노출. </li><li> 27 G 바늘 1 ml의 일회용 주사기로 세균 솔루션을 그립니다. 각 마우스의 경우, 적절한 농도 (105 CFU 각 마우스까지) 박테리아의 20 ~ 30 μl를 관리 할 수 있습니다. </li><li> 기관에 바늘을 삽입합니다. 기관에 천천히 솔루션을 주입한다. </li><li> 일반적으로 해당 솔루션을 나타내는 동물 헐떡 거림이 폐에 도달 한 것을 확인합니다. </li><li> 무균 조건에서 멸균 봉합 (6-0 모노 필라멘트)와 상처를 닫습니다. </li><li> 0.1 ㎎ / 수술 후 통증을 제어하기 위해 수술 후 진통제 등의 피하 주사에 의해 kg 프레 노르 핀을 사용합니다. </li><li> 폐쇄를 절개하는 초기 마취 유도에 필요한 시간보다 15 분인지 확인합니다. </li><li> 주입 한 후, 적절한 생물 학적 날카로운 물건 용기에 주사기와 주사 바늘 폐기하십시오. </li><li> 이산화 염소를 기반으로 DISI와 수술 도구를 취급nfectant 15 분 동안 씻어 살균을 위해 실험실로 돌아가서 필요한 경우 다시 사용합니다. </li><li> 단독으로 따뜻한 환경에서 깨끗한 케이지의 집은 마우스. </li><li> 이 의식을 회복하고 이동하기 시작 때까지 동물에 매 30 분을 확인; 나중에 처음 3 일 수술 후 12 시간 간격으로. </li><li> 실험을하는 동안 동물 BSL2 시설에 마우스를 유지합니다. 밀봉 된 상자에 포함 된 유일한 조직은 동물 BSL2 시설 나뭇잎 있는지 확인합니다. 쥐가 죽어가는 행동 중 하나를 표현하는 경우 연구에 어떤 시점에서 (호흡 곤란, 혼수, 부드러운 자극에 대한 응답으로 ambulate 실패로 정의), 자궁 경부 전위 다음에 병에 소스에서 CO 2 흡입 쥐를 안락사. </li><li> 마취에서 일어난 과다 출혈에 의한 실험 주제를 안락사. <ol><li> 안락사 쥐에서 폐 조직을 수집합니다. BSL2 후드에서이 절차를 수행하십시오. 필요한 경우, 라 세미 배치 밀봉 된 튜브를 사용하여 샘​​플을 전송할추가 프로세스에 대한 스냅 뚜껑 상자에 살균제 라덴 종이 타월에 케이. </li></ol></li></ol>

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우리가 여기에서 설명하는 슈도모나스 마우스 폐 손상 모델은 급성 폐 손상이나 폐렴에 따라 발생하는 염증, 폐 손상, 수리 및 해상도의 전 과정을 모방. 그것은 임상 적으로 비교적 안전하고 취급이 용이 점에서 여러 가지 다른 부상 모델에 비해 독특한 장점을 가지고있다. 절차의 중요한 단계는 박테리아 용액의 주입이 매우 느리게 할 필요가 있다는 것이다. 주사가 너무 빠르다면, 마우스는 초크 의해 죽을 가능성이 높다. 성공적으로 주입 한 후, 마우스는 일반적으로 입자가 폐에 들어가 박테리아를 도움이 될 것입니다 몇 가지 깊은 숨 쉬고 헐떡 거림을 보여줍니다. 우리가 사용 된 균주는 PA103 6했다. 이 모델의 중요한 점 중 하나는 P.의 역가 녹농균이 엄격하게 제어 될 필요가있다. P.의 배치 다른 소스에서 녹농균은 다른 염증의 정도와 손상도 보...

폐는 환경 병원균에 노출 염증과 손상 1-3에 취약합니다. 폐렴 또는 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS)과 같은 병적 인 상황에서는 백혈구가 발표 한 병원균뿐만 아니라 염증 요인이 폐포 세포 1-3의 부상과 죽음을 유도한다. 이것은 수리 부상 병리학 연구뿐만 아니라기구를 용이 급성 폐 손상의 동물 모델을 개발하는 것이 중요하다. 현재, 대부분의 사람들은 고농도 산소 및 블레오 마이신 유도 마우스 폐 손상 모델 4를 사용합니다. 그러나 고농도 산소의 메커니즘은 부상이 폐렴이나 급성 호흡 곤란 증후군 5시에 가장 자주 발생하는 폐 손상과 동일하지 않습니다 일으켰습니다. 블레오 마이신에 의한 급성 손상은 임상 상황에 맞는 4 드물다. 여기에서 우리는 P.의 내부 기관 주사를 사용하여 마우스 폐 손상 모델을보고 aeruginosa의 6,7. 이 모델은 임상 적이며, 모방 P폐렴 8 다음과 같은 일이 rocesses. 면역 개인의 기회, 병원 내 병원균, P.로 녹농균은 일반적으로 폐, 요로, 화상, 상처 감염 및 다른 혈액 감염 (6)이 발생합니다. 박테리아 병원성 인자 외독소를 해제 곱하고 면역 반응 (6)를 발생시킨다. P.의 내 trachael 관리 녹농균 폐렴을 유발할 박테리아 인체 노출의 상황을 반영하고 병리 최근보고 된 인플루엔자 바이러스 H1N1 유도 폐 손상 모델 (9)로부터 상이 할 가능성이있다. P. 이후 aeruginosa에 그것이 더 악성 병원균 중 일부에 비하여 취급이 비교적 안전하다 기회 병원체이다. 우리가 관찰하기 때문에 여기에서 우리는이 방법에 비해 폐의 말초 폐포 지역에 더 많은 박테리아를 도입하는 박테리아를 관리하는 내부 기관 주사를 사용입소문을 통해 카테터를 사용하는 등 다른 절차. 다른 급성 폐 손상 모델에 비해 P. 여기에 설명 녹농균 모델은 박테리아에 의해 과도한 염증에 의해 유발 된 폐 손상을 연구하는데 적합하다. P.를 사용하는 다른 동물 모델과는 달리 녹농균은 여기에 우리가 현지화 된 급성 폐 손상을 유발하는 박테리아의 내부 기관 주사를 사용, 패혈증 (10, 11)을 유도한다.

<table><tbody><tr><td>마취제: 케타민, 자일라진, 리도카인, 부프레노르핀</td><td></td><td></td><td>제약 등급</td></tr><tr><td>27 G 바늘</td><td>Fisher</td><td>1482648</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Fisher</td><td>14823434</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>봉합사&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>19-037-526</td><td></td></tr><tr><td>아이 게이지, 장갑, 가운</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>바이오세이프티 캐비닛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 산화물 기반 소독제</td><td></td><td></td><td>클리독스</td></tr><tr><td>양 혈액 아가르 플레이트&nbsp;</td><td>Medex 공급</td><td>HL-1160</td><td></td></tr></tbody></table>

녹농균 유발 폐 손상 모델

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

인간 급성 폐 손상 및 폐렴을 연구하기 위해,이 질환의 다양한 병리학 적 특징을 모방하는 동물 모델을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 박테리아 녹농균 (P. aeruginosa의 또는 PA)의 내부 기관 주입에 의한 마우스 폐 손상 모델을 개발했다. 이 모델을 사용하여, 우리는 손상의 초기 단계에서의 폐 염증을 표시 할 수 있었다. 또한, 폐포 상피 장벽 leakiness는 기관지 폐포 세척액 (BAL)을 분석하여 관찰 하였다; 및 폐포 세포 사멸로부터 제조 부상 폐 조직을 사용 TUNEL 염색하여 관찰 하였다. 손상 후 이후의 단계에서, 우리는 복구 프로세스에 필요한 세포 증식을 관찰 하였다. 부상 7 일 P.의 시작에서 해결되었습니다 aeruginosa에 주입입니다. 이 모델은 폐렴 동안 폐 염증, 손상 및 수리의 순차적 과정을 모방. 이 임상 적으로 관련된 동물 모델에서 F, 수리 메커니즘을 병리학을 공부에 적합급성 폐 손상을 따르게하고,은이 질환의 잠재적 인 치료제를 시험하기 위해 사용될 수있다.

72 시간 게시물 P. - 24 일부터 시작 녹농균 주입, 세포 수 증가는 (도 1a-D) 폐 섹션에서 관찰되었다. 폐는 96 시간 포스트 부상 (그림 1E)를 복구하기 시작했다. 칠일에 P.를 게시 녹농균, 정상 폐포 형태는 크게 (그림 1 층) 복원되었습니다. 터널 염색하여 폐 섹션은 24 시간 후 P.에서 준비 녹농균은 폐포 세포 (도 1G-I)에서 세포 사멸을 보였다. 이 손상 모델에서 복구 프로세스를 연구하기 위해, BrdU의 포스트는 P. 삼일에서 생쥐에 주입 녹농균. 폐는 5 시간 후 BrdU의 주입에 격리와 BrdU의 항체 염색법에 대한 처리되었습니다. 도 1J 및 K에 도시 된 바와 같이, 상당히 72 시...

우리는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 기관내 주입에 의한 쥐 폐 손상 모델을 개발했습니다. 이 모델은 폐렴 중 폐 손상을 모방하며 임상적으로 관련이 있습니다.

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

이 절차의 전반적인 목표는 슈도모나스 에어로겐 투여에 의해 마우스의 폐렴, 폐 손상 상태를 모방하는 것입니다. 이것은 먼저 슈도모나스를 주사를 위한 적절한 농도로 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 마우스 기관을 조심스럽게 노출시킨 다음 박테리아를 기관 내 주사로 폐에 투여합니다.마지막 단계에서는 마우스의 질병 진행을 주의 깊게 모니터링합니다. 궁극적으로, 폐 염증, 폐포 장벽의 세포 사멸 변화 및 폐 복구는 슈도모나스 에어로겐 주입 마우스 폐에서 연구할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 폐렴으로 인한 급성 폐 손상 치료로 확장됩니다.이 모델은 폐렴 다음 과정을 모방하기 때문에 p Aerogen, PA 1 0 3 설치를위한 박테리아의 냉동 바이알을 섭씨 영하 80도에서 생물 안전 수준 2 또는 BSL 2 실험실로 운반하여 70 % 에탄올이 늘어선 상자 안의 랙에 보관하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 BSL 두 개의 후드 줄무늬 아래에서 P aerogen PA 1 0 3 박테리아 군체를 양의 혈액 한천 플레이트에 넣고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 군체를 성장시킵니다. 약 15시간 후, 박테리아 루프를 사용하여 콜로니를 5ml의 PBS로 이동합니다.그런 다음 연속적으로 박테리아를 1-10, 4, 1-10, 7 농도에 더 많은 PBS에 희석하여 신선한 양 혈액 한천 플레이트에 희석을 플레이트로 묽게 합니다. 그런 다음 약 15 시간 더 배양 한 후 각 플레이트의 콜로니 형성 단위를 계산하여 박테리아 농도를 결정합니다. 다음으로, Eloqua는 1.5 밀리리터의 PBS 0.5 밀리리터에 적절한 양의 박테리아, 멸균 나사 캡 극저온 바이알을 넣은 다음 BSL 2 캐비닛의 스냅 뚜껑 상자에 소독제가 가득한 종이 타월에 밀봉 된 바이알을 냉동 바이알 랙에 놓고 거부권 연고로 동물의 눈을 부드럽게 덮습니다.절개 부위를 빠르게 면도하고 알코올과 포비돈 요오드를 3회 번갈아 가며 면봉으로 피부를 청소하고 발가락으로 진정을 확인합니다. 국소 마취제로 피부를 치료한 후 수술 보드에 마우스를 꼬집어 고정합니다. 다음으로, 동물의 목 정중선을 5mm 정도 작게 절개하고 뭉툭한 집게를 사용하여 근육을 부드럽게 움직여 기관에 접근합니다.기관이 노출되면 20-30 마이크로 리터의 PBS에있는 박테리아의 5 개의 집락 형성 단위에 10 배까지 27 게이지 바늘이 장착 된 1 밀리리터 일회용 주사기로 뽑습니다. 그런 다음 바늘을 기관에

pseudomonas-aeruginosa-induced-lung-injury-model

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

우리는 급성 폐 손상을 모델링하기 위해, 분무에 의해 에어로졸 리포 폴리 사카 라이드에 도전하여 호중구 폐 염증을 유도하는 방법을 설명합니다. 또한, 폐 격리, 기관 삽관 및 기관지 세척액에 대한 기본적인 수술 기법도 설명되어 있습니다.

에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

면역 능력이 있는 설치류에서 폐 감염을 확립하는 방법이 설명되어 있습니다. 숙련되면 이 방법을 빠르고 쉽게 수행하여 S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae 및 A. baumannii의 많은 분리물에서 안정적인 감염을 유도할 수 있습니다.

면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기<i&gt; S. 폐렴</i&gt;<i&gt; H. 인플루엔자</i&gt;<i&gt; K. 폐렴</i&gt;<em&gt; P. 녹농균</em&gt; 또는<em&gt;를했다. baumannii가</em

간단한 방법은 다음 폐 피 내 막의 감염 세포 독성 amyloids의 생산 위한 녹 농 균에 의해 설명 되어 있습니다.

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

여기에 제시된 단계별 절차는 직접적인 경포대당증 주입에 의해 마우스에서 급성 폐 손상을 유도하고 혈액 샘플, 기관지 정맥 세척액 및 폐 조직의 FACS 분석을 수행하기 위한 것이다. 최소 침습성, 간단한 취급, 좋은 재현성 및 질병 중증도의 적정은 이 접근법의 이점입니다.

직접 경포당증 주입에 의해 마우스에 있는 심각한 폐 상해를 유도하는

우리는 면역 적격 마우스에서 만성 상처 감염을 생성하기위한 지연 접종 프로토콜을 설명합니다.

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

이 원고는 생쥐에서 폐렴의 전염성 모델을 확립하고 손상 해결의 각각의 특성과 함께 박테리아 성장 및 기관 내 점안 방법을 설명합니다. 고차원 유세포 분석을 사용하여 면역 환경을 평가하는 새로운 접근 방식도 설명합니다.

폐렴의 해결을 평가하기 위한 실험모델

현재 만성 세균 감염에 대한 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 모델이 부족합니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 지속적인 감염을 일으키기 위해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 임상 격리 물질에 의한 상처 감염에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Wounded Zebrafish 유충에서 지속적인 녹농 균 감염 모델링

본 연구에서는 기본 후두경을 사용하여 쥐에서 ALI를 발달시키는 비침습적 기기관내 삽입 기법이 입증되어 LPS가 폐에 정밀히 전달되도록 합니다. LPS는 후두경을 이용한 기관내관 을 통해 주입됩니다. 폐 손상의 규모는 여러 시점에서 평가됩니다.

설치류에서 급성 폐 손상을 유도하기 위한 비침습적 기관내 지포폴리당(Lipopolysaccharide) 투여

학습하세요 Pseudomonas aeruginosa 기관내 주입으로 마우스 폐 손상 모델을 만드는 방법을. 이 기법은 폐렴 유발 급성 폐 손상의 염증과 복구 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

녹농균 유발 폐 손상 모델

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