Name: 청각 신경의 자극 Optogenetic (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 배우세요 생쥐 청각 신경의 광유전학적 자극 방법을 통해 청각 연구의 새로운 접근법을 탐색하세요. 이 기술은 인공와우 이식의 한계를 극복하고 주파수 및 강도 해상도를 향상시켜 청각 장애 치료에 기여할 수 있습니다.

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이 작품은 교육 및 연구 (Neurotechnology에 대한 번스타인 초점 T. 모저에 01GQ0810을 부여하고, MED-EL 독일)의 독일 연방 교육부에 의해 지원되었다; N. Strenzke 및 T. 모저에 독일 연구 나노 현미경과 뇌의 분자 생리학 센터를 통해 재단 (FZT 103, T. 모저)과 SFB889 통해).

본 연구에 제시된 모든 실험은 실험 동물의 보호 독일어 법에 의해 정의 윤리 기준으로 실시 하였다. 동물 복지에 대한 대학 괴팅겐의 보드 및 니더 작센의 상태의 동물 복지 사무소는 실험을 승인했다. μLED - 자극기의 1 준비 <ol><li> μLEDs를 들어, 첫번째 μLED - 자극기를 준비합니다. 200 μm의 활성 표면에 의해 200 블루 LED를 사용 (μLED, 재료 표 참조). </li><li> μLED에 솔더 와이어. 이어서, μLED 에폭시 접착제를 이용하여 연결을 캡슐화한다. 에폭시 경화 수 있도록 장치 하룻밤 둡니다. </li><li> 기계적 안정성 및 전기 절연성이 얇은 유리 모세관을 통해 와이어를 깔때기를 들어, 1mm 외경 보로 실리케이트 모세관을 사용하여 모세관 기계적 머니퓰레이터에 장착 될 수있다 (도 1D)되도록 에폭시 접합부를 밀봉. 참고 : T여기에 충분한 두께 (자극 유물을 피) 좋은 전기 절연을 얻을 수있는 캡슐을 만드는 트레이드 오프,하지만 LED가 수포 내에서 자유롭게 이동할 수 있도록하고 cochleostomy에 그것을 찾을 정도로 얇은입니다. 그것은 하나 이상의 LED를 준비하는 것이 좋습니다. </li><li> 좋은 전기 절연을 확인하려면 먼저 액체로 0.9 % 염화나트륨 및 딥 3 베어 종료 구리 와이어와 페트리 접시를 준비합니다. 이것은 ABR 전극과 동물을 시뮬레이션하는 역할을한다. ABR 앰프와 거기에서 오실로스코프에 전선을 연결합니다. </li><li> 이어서, 자극기에 연결하고 LED가 완전히 피복 될 때까지 용액으로 몰입. 이상 20 분 동안 최대 허용 전류에서 펄스 ​​(단계 3.1.1 참조) LED 자극 아티팩트 드라이브 검사. 나타나는 경우, LED를 폐기하고 새로운 시도. </li></ol> 2 수술 <ol><li> Thy1.2 프로모터에서 ChR2을 표현 4-10주 된 형질 전환 마우스 (9 호선을 사용하여왕의 등. 13). 수술을 동물을 조작하고 수행하려면, 항상 깨끗하고 잘 식별 된 수술 도구를 사용합니다. </li><li> 우레탄 (1.32 밀리그램 / kg), 자일 라진 (5 밀리그램 / kg)의 혼합물의 IP 주입하여 동물을 마취하고, 부 프레 노르 핀 0.1 μg / g 0.9 % 멸균 염화나트륨 용액으로 희석하고, 신체를 유지하기위한 가열 플레이트 상에 마우스를 배치 37 ° C의 온도. 이 용량으로, 일반적으로 마취 전체 실험 프로토콜에 대한 지속됩니다. <ol><li> 발 철수 반사에 의한 흥분의 흔적이 초기 마취 유도 검사 후 10 분 시작. 운동의 경우에, (자일 라진)없이 0.9 % 멸균 NaCl 용액에 희석 우레탄 (0.66 밀리그램 / kg) 및 부 프레 노르 핀 (0.05 μg / g)의 유지 투여 량을 적용한다. 다시 발 철수 반사를 확인하고 반사가없는 경우에만 진행합니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 절개의 준비 retroauricular 영역을 면도. retroauricular을 사용하여수포 (공기 함유 중이강)에 도달하는 접근. <ol><li> 마이크로 포셉 신중하게 해부 및 / 또는 예를 들면 목 근육의 일부, 활 경근, 흉쇄 및 scalenes을 제거와 함께. </li><li> 찾아 수포 (그림 1A)를 노출합니다. 고막 (그림 1A)의 삽입을 나타내는 수포 표면에 반지와 특성 구형과 뼈 구조로 수포를 확인합니다. 바로이 반지 아래 인슐린 바늘의 끝이 구멍을 확인합니다. 달팽이관 promontorium은 (도 1b)에 노출되는 방식으로 미세 Rongeur (gnawer) 또는 microforceps과 수포 커버 뼈 제거가 시작. </li></ol></li><li> 그대로 막 미로 (그림 1B)를 떠나 돌보는 : cochleostomy를 들어, 부드럽게 작은 창을 엽니 다 (~ 500-800 μm의 cochleostomy를) 뼈 캡슐을 면도. 두 번째 인공 와우에 cochleostomy를 수행이 stapedial 동맥과 정점에서 충분히 그대로십시오. 정점을 열면 modiolus의 골절을 포함하여 달팽이관의 파열을 생성 할 수 있습니다. </li><li> 스칼라 고실 광섬유 또는 μLED 임플란트의 둥근 창을 삽입하는 경우, 조심스럽게 날카로운 메스의 끝이 뼈 틈새 시장을 긁어서 라운드 창 틈새 시장을 확대 (블레이드 번호 11은 좋은 선택이 될 것입니다). 항상 새로운 날 또는 메스를 사용합니다. stapedial 동맥 둥근 창 (그림 1B)에 매우 근접 실행될 때 매우주의해야합니다. </li></ol> 두 가지 방법을 사용하여 3 광 자극 <ol><li> transcochlear 자극, 사용 μLEDs 또는 섬유 결합 레이저하십시오. <ol><li> cochleostomy에 μLED의 위치를​​주의 깊게 기계 조작자에 μLED를 운반하는 모세 혈관을 마운트하고. 또는 위치를 최적화하기위한 수단으로서, 1-5 Hz에서 전류원 (2.7 V에서 통상적 5~40mA)에서 3-10 밀리 긴 자극에 의​​해 유발 사용 oABR,μLED의 ientation. </li><li> 레이저 자극의 경우, 473 nm의 연속파 레이저와 250 μm의 광섬유 (자료 참조)를 사용합니다. 커플 이상적 전력의 고속 아날로그 제어 (다른 광학 자극을 정의하는 음향 광학 소자 또는 빠른 셔터를 사용하여)를 제공 청색 레이저 광원에 광파이버. 미세 조작기를 사용하여, 직접 cochleostomy 상 섬유의 끝 부분을 찾아서 그 치과 용 시멘트 (transcochlear 자극)을 사용하여 해결할 수있다. </li></ol></li><li> intracochlear 자극의 경우, 스칼라 고실에 둥근 창을 통해 광섬유를 삽입합니다. 그런 다음 oABR을 유도하기 위해 1-5 Hz에서 10 ~ 30 mW의 (광 출력 전력)의 3-10 밀리 초 레이저 펄스를 사용합니다. oABR의 큰 진폭은 판독으로 oABR 진폭을 사용하여 이미 터의 위치와 방향 (μLED 또는 광섬유)를 최적화하기 위해 오실로스코프에 하나의 자극에 의​​해 유발 oABR을 관찰 할 수있는 실험을 할 수 있습니다. </li><li> 좋은 oABR이 달성되고 나면, cyanoacr와 섬유를 수정접착제 고체 때까지 ylate 접착제, 치과 시멘트 기다립니다. 참고 : 달팽이관에서 나오는 몇 가지 액체를 관찰하는 것은 정상입니다. 그러나 시멘트 중합 문제를 방지하기 위해서는, 미세한면 심지를 이용하여 영역을 건조하는 것이 바람직하다. </li></ol> oABR의 4 녹음 <ol><li> 정점과 다리 근처의 뒷면에, 귓바퀴 아래 바늘 전극을 삽입하고 앰프에 연결합니다. </li><li> 정점 차이 전위를 증폭 및 피하 주사 바늘을 유상 돌기. 50 kHz 및 필터 (1-10,000 Hz에서)의 비율로 샘플. 광 자극의 위치를​​ 최적화하기위한 녹화 설정 근처 이상적 오실로스코프 차분 전위 시각화. 신호 평균 (50-1,000x)를 사용하여 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 데이터를 저장합니다. </li></ol> 광학 유발 현지 필드 잠재력의 5 녹음 <ol><li> 정위 프레임에 동물을 배치합니다. 집게 센트를 사용하여집회는 두개골을 덮고 피부를 당겨 가위 대략 목 근육은 두개골에 연결 지점으로 눈 사이에서 연장과 중간 절개를 수행합니다. <ol><li> 측 방향으로 피부를 반영한​​다. 시상 봉합 길이 방향으로 골막을 잘라 조심스럽게 면봉으로 노출 된 두개골 뼈를 문질러 그것을 측방를 제거합니다. </li></ol></li><li> 접시와 람다의 꼬리 끝 사이의 약 1mm 공간을 남기고 노출 된 두개골에 사용자 정의 만든 금속판을 배치합니다. 0.7 mm 직경으로 조심스럽게 드릴 정수리 뼈에 구멍을 드릴. </li><li> 부드럽게 0.85 mm 직경 나사에 나사 - 열등한 둔덕에서 기록 된 전위에 대한 기준 역할을하는 (IC) - 한 나사가 단단히 고정되지 않는 집게로 고정 나사. 뇌를 관통하지 않고 나사와 경막 사이 좋은 접촉을 확인합니다. 나사와 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 두개골 상에 금속 접시를 붙인다. </li><li> N을 풉니 다부드럽게 두개골에서 에크 근육. 하방 경 1-2mm에 목 근육을 잡아 당깁니다. 우수한 시상 동 (SSS) 및 횡 방향 동 (TS)의 교차점을 확인합니다. 필요한 경우, 생리 염화나트륨 용액으로 뼈를 가습하여 두개골의 투명성을 증가시킨다. <ol><li> SSS와 TS 교차로에 직접적으로 꼬리 거짓말로 쥐 IC를 식별합니다. 천천히 조심스럽게 IC의 위치를​​ 식별 한 후 공술 (Trepanation) 연장 약을 수행 0.5 mm rostrally TS에 하방 1.5 mm 및 횡 방향으로 약 3mm이다. </li><li> 성공적인 실험을 배제 할 이들과 같은 SSS와 TS에 부상을 피하십시오. 여기서, 구멍 뚫린 뼈가 부드럽게 밀어 넣어 느슨해 여부를 테스트합니다. 사용 집게 천천히 뼈를 들어 올립니다. </li></ol></li><li> 적절한 어댑터를 미세 조작기 상에 멀티 어레이와 headstage를 연결합니다. 경질를 꺼낼 때 조심스럽게, IC에 삽입하는 동안 멀티 채널 녹음 배열을 파괴 방지하기 위해작은 피하 주사 바늘의 구부러진 끝이 뼈 가장자리에 시작하는. <ol><li> 고정대에서 동물을 제거합니다. 정위 고정 남아 줄에 금속판을 고정합니다. IC를 통해 기록 프로브를 위치시키고 최상위 채널 표면에서 바로 볼 수 있도록 미세한 제어를 삽입합니다. </li></ol></li><li> 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 32 kHz의 로우 패스 필터 (300 Hz에서)과 상점의 속도로 기록 어레이와 정수리 뼈 기준 나사, 샘플의 개별 채널의 차이 전위를 증폭한다. </li><li> 모든 동물을 인도적으로 안락사 이전에 관련 지침에 따른 마취 회복 과정의 끝에 안락사한다. 안락사의 적절한 방법은 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입을 포함 할 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

설명한 실험 SGNs의 optogenetic 자극을 입증하고, 원칙적으로, 또한 내측 및 / 또는 외측 유모 세포를 자극하는 데 사용될 수 opsins의 발현을 제공 하였다. 이 실험은 많은 인내와 배려가 필요합니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 가장 중요한 단계는 광원의 좋은 cochleostomy / 라운드 창 삽입뿐만 아니라 적절한 위치 자세이다. ChR2를 사용 optogenetic 자극과 제한 사항이 있습니다. 자극의 속도가 15 증가 할 때 빛의 세기 및 펄스 지속 시간 그러나 우리의 경우 oABR 진폭이 증가에서 감소한다. 응답 지연 시간은 또한 감소, 광 강도에 의존 할 때 자극의 강도가 증가. 우리는 이러한 응답은 ChR2의 속도론 및 SGNs 표현 채널 수의 결과임을 제안한다. 또한 ChR2 높은 스파이크에 여분 스파이크, 장애 및 막 전위를 발생할 수 합산요금 27,40. 이러한 제한 (32, 33)을</sup...

세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 3억6천만명는 전 세계적으로 청력 상실로 고통. 청각 장애인 대상에서 CI에 의해 SGNs 직접 전기 자극 그들 1,2,4,5-의 대부분에서 열려 음성 이해를 할 수 있습니다. 비록 CI에 따라서는 가장 성공적인 neuroprosthesis되고, 20 만 명 이상에 이식되어, 현재 인공 와우 이식에 의해 구동 사운드 인코딩이 제한됩니다. CI에 각 하나가 청각 신경 따라서 달팽이관에 코르티 역기능 감각 기관을 우회 tonotopic 영역을 활성화 전극의 특정 번호에 의해 전기 자극을 기반으로합니다. 정상 청력 청취자 그러나 오늘날의 CI는 최대 12-22 주파수 채널 4에 사용, 2,000 개 이상의 주파수를 구별 할 수 있습니다. 이는 많은 다른 소리 주파수 8,15 SGNs을 나타내는 다수의 활성화 전극 7,9 각 자극에서 널리 전류 흐름이다. 이제한 다극 자극을 ​​사용하지만 높은 소비 전력 16,17의 비용을 개선 할 수있다. 소리 강도에 대한 그들의 출력 동적 범위는 일반적으로 6-20dB 4,18 이하로 제한된다. 이러한 이유로, 개선 빈도와 강도 해상도는 시끄러운 환경, 운율 이해와 음악 인식에서 음성 인식을 개선하기 위해 CI 성능을 향상시키기위한 중요한 목표입니다. 청각 신경을 자극하는 다른 옵션은 광 자극이다. 빛은 편리하게, 더 나은 공간 감금을 약속 주파수 해상도를 증가시키고 또한 더 나은 강도 해상도의 결과로, 동적 범위를 확대, 작은 SGN 인구를 대상으로 집중 될 수있다. 실제로, 적외선 빛을 가진 인공 와우 자극은 동물 모델 10,11,19 우수한 주파수 해상도를 보여 주었다. 자극이 종류의 한 단점은 전기 자극보다 높은 에너지를 필요로한다는 것이다 <sup&gt; 10, 11. 또한, 직접 청신경을 자극하는 방법의 능력에 대한 우려는 12,20 제기되어왔다. 적외선 자극에 대한 대안으로, 우리는 SGNs 민감한 빛을 렌더링하는 optogenetics를 사용합니다. Optogenetics 비 침습적으로 유전 및 광학 기술을 결합하고 특히 높은 시간 정밀도 (리뷰 21 - 23)와 세포를 제어하는 새로운 접근 방법이다. 현재 가장 많이 사용되는 양상은 인 Chlamydomonas reinhardtii에서의 미생물 channelrhodopsin 2 (ChR2) 유전자의 발현을 고용하고 빛 게이트 양이온 채널 24을 인코딩, 이들의 변종. ChR2는, 뉴런으로 형질 도입 및 청색 광에 의해 활성화 될 때, 이와 같이 세포를 24 - 27 탈분극 같은 비 선택적 양이온 채널을 작용 7 - 막 관통 나선 단백질이다. ChR2 잘 특징되었습니다 24,28- 31 많은 변종이 actio을 수정하기 위해 개발되었습니다n 개의 스펙트럼, 게이트 및 투과성 특성 (32, 33). 우리 연구의 목적은 청각 경로의 활성화를 위해 인공 optogenetics을 확립하는 것이다. 우리는 청각 신경을 자극하는 optogenetic 접근 방식은 channelrhodopsin의 발현에 나선 신경절의 유전자 조작을가 있어야한다는 사실을 명심해야합니다. 마우스 및 쥐와 함께 작업하는 것은 tonotopic 축을 따라 동물 36에서 약간의 변화와 함께 channelrhodopsin의 발현을 제공 사용할 수 형질 전환 동물 13,34,35의 사용을 할 수 있습니다. 적절한 Cre 호텔 라인과 조건부 대립 유전자 37을 결합하여 세포 고유의 표현을 제공한다. 다른 동물의 나선 신경절에 유전자 전달은 optogenetics 38 표준 방식 인 아데노 - 연관 바이러스와 같이 우리가 마우스 (36)에서 잘 작동하는 것을 보여 주었다 바이러스의 사용을 필요로한다. 유전자 조작과 같은 글로불린 등의 부작용에 ​​대한 외국인 단백질에게 곰 위험을 코딩하는 유전자의 발현북동 응답 및 / 또는 증식, 손상 상태 나 유 전적으로 조작 된 세포의 죽음. 이 데모의 목적을 위해 우리는 광학적으로 청각 경로를 자극하는 네-1 프로모터 13에서 나선 신경절 신경 세포에 ChR2을 표현 형질 전환 마우스를 사용합니다. 우리는 우리가 SGNs 39로 변형 캐치 14의 바이러스 매개 전송을 사용하여 설명 된대로 다른 channelrhodopsin 변종이 같은 목적을 위해 이용 될 수 있습니다. 인공 optogenetics는 유전자 조작을 필요로하지만, 최적화 SGN 자극 분자에 대한 튜닝을 제공하고 전기 자극에 비해 약속 주파수 및 세기 해상도를 향상시켰다. 청각 경로의 Optogenetic 자극은 연구 청각에 매우 관련이있다. 예를 들어, 사운드의 스펙트럼 localizat 통합 요구 분석, 개발 중에 tonotopy의 활성에 의존하는 정제의 연구 발전을 약속이온 및 중앙 청각 시스템의 주파수 별 심성 돌기 사이의 상호 작용의 정도.

<table><tbody><tr><td>우레탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>U2500-100G</td><td>마취제</td></tr><tr><td>자일라진 HCl</td><td>RXV</td><td></td><td>진정제 및 진통제</td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>레킷 벤키저</td><td></td><td>진통제</td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-10</td><td>뼈나 물질과 같은 단단한 조직을 잡는 데 사용됩니다. 절대로 부드럽고 섬세한 조직을 잡는 데 사용하지 마십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 - 세밀한 펜치</td><td>세밀한 과학 도구</td><td>11254-20</td><td>연조직을 잡는 데만 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>세밀한 가위 - 날카로운</td><td>세밀한 과학 도구</td><td>14060-09</td><td>피부를 열고 근육 해부를 돕기 위해</td></tr><tr><td>Lempert Rongeurs&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>16004-16</td> 그들은 bulla 473 nm 레이저<td>에서 뼈를 쉽게 제거하는 데 매우 유용합니다&</td></tr><tr><td>nbsp;</td><td>Changchun New Industries</td><td>MLL-III473</td><td>100 mW 솔리드 스테이트 473 nm 레이저</td></tr><tr><td>드라이버&nbsp;</td><td>장춘 새로운 산업</td><td>DPSSL MLL 100 mW</td><td>TTL 운영 레이저 드라이버</td></tr><tr><td>250 &마이크로; m 광섬유</td><td>모든 상업 ; 예: Thorlabs</td><td>M42L05</td><td></td></tr><tr><td>음향 광학 변조기</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>PCAOM VIS</td> 음향 광 변조기용 <td>레이저 컨트롤러에서 광섬유로 결합되는 빛의 양을 제어합니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>160T1-8SAR-24-0.8</td><td>음향 광학 변조기</td></tr><tr><td>제어 Solo2 레이저 출력 및 에너지 미터</td><td>Gentec-EO</td><td></td><td>LED 및 광섬유 결합 레이저 Blue & micro의 광도를 측정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. LED</td><td>Cree</td><td>C470UT200</td><td>여러 &mu를 구축해야 합니다. LED 장치는 쉽게 손상되거나 절연이 충분하지 않기 때문에</td></tr><tr><td>TDT 시스템&nbsp;</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td>RZ6-A-P1</td><td>이것은 자극 생성&nbsp; 프레젠테이션 및 데이터 수집을 위한 어떤 시스템이든 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>단일 샹크, 16-채널 실리콘 프로브</td><td>Neuronexus</td><td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&nbsp;</td><td>이것들은 깨지기 쉬운 장치이므로 조심스럽게 다루고 사용 후에는 청소해야 합니다</td></tr><tr><td>Omnidrill</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>503598 IC 기록 및 참조 나사 이식을 위한 개두술을 수행합니다.</td></tr><tr><td>Micro Drill Steel</td>은 <td>모든 상업적인 것을 버링합니다. e. Fine Science Tools</td><td>19007-07</td><td></td></tr><tr><td>자체 탭핑 뼈 나사</td>는 <td>상업용> </em<> Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>참조 나사</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>모든 광고; 예: Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4축</td><td></td><td>레코딩 프로브 위치</td></tr></tbody></table> 지정

청각 신경의 자극 optogenetic

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

인공 와우 (CI에)에 의해 나선 신경절 신경 세포 (SGNs) 직접 전기 자극을 이식 청각 장애인 과목 1-6 대부분의 오픈 음성 이해를 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재의 CI와 사운드 코딩으로 인해 달팽이관 7-9의 tonotopic 축을 따라 SGNs의 큰 숫자를 활성화하는 각 전극 접촉에서 폭 넓은 전류 확산 가난한 빈도와 강도의 해상도를 가지고있다. 광 자극은 공간적으로 더 따라서 SGNs의 활성화를 밀폐과 약속 전기 자극, 부호화 높은 주파수 해상도의 대안으로서 제안되었다. 최근, 달팽이관 직접 적외선 조명 청신경 (10)에 응답을 연상하는 데 사용되어왔다. 전기 자극 10, 11 및 불확실성이 기반이되는기구 12로 남아보다 그럼에도 불구하고 더 높은 에너지를 필요로한다. 여기에서 우리는 SGNs을 자극하는 optogenetics를 기반으로하는 방법을 설명channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 ChR2 변종 캐치 14의 바이러스 매개 표현의 신경 식으로 형질 전환 마우스를 사용하여 낮은 강도 푸른 빛과 함께. 우리는 작은 인공 개구부 (cochleostomy) 또는 둥근 창을 통해 ChR2 - 표현 SGNs을 자극하는 다이오드 (μLEDs) 및 광섬유 결합 발광 레이저 마이크로 빛을 사용했습니다. 우리는 빛을 유발 전위 (optogenetic 청성 뇌간 반응 : oABR)의 두피 녹음하여 응답을 정량 또는 청각 경로에서 미세 전극 기록에 의해 음향 및 전기 자극으로 그들을 비교했다.

최적 cochleostomy은 중요하고 성공적인 실험의 확률을 증가시킨다.이 윈도우가 일정한 작은 것을 의미하고, 내부 인공 구조물의 어떠한 손상도 없다. 예를 들어, 출혈은 강선 vascularis의 손상 될 수 있음을 나타냅니다. 좋은 예는 그림 (b)에 표시됩니다. ChR2 - 형질 전환 마우스를 사용하여, ChR2은 달팽이관 (그림 1C) 내에서 SGNs 표현된다. , 하나, μLED 또는 레이저에 의해 푸른 빛 조명은 진폭과 파형 음향 ABR (aABR)과 다른 대형 oABR을 이끌어. oABR (그림 1 층)은 aABR (그림 1E)보다 큰 진폭을 가지고 있지만.이 oABR 및 eABR 더 SGNs의 반영 모집 및 / 또는 SGNs보다 동기화 활성화로 해석 될 수있는 전기 ABR (eA...

인공 와우 (CI를) 청각 신경에 직접 전기 자극으로 청각 수 있습니다. 그러나 가난한 빈도와 강도 해상도의 CI와 청각의 품질을 제한합니다. 여기에서 우리는 청각 연구와 미래의 CI 개발을위한 대안 전략으로 생쥐에서 청각 신경의 optogenetic 자극을 설명합니다.

청각 신경의 자극 Optogenetic

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

이 절차의 전반적인 목표는 광유전학적으로 변형된 나선형 신경절 뉴런을 가진 동물의 청각 신경을 광학적으로 자극하는 것입니다. 이것은 먼저 청색 마이크로 LED 자극기 또는 청색 레이저에 결합된 광섬유를 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 후향 귀 미세수술 접근법을 사용하여 달팽이관을 평가하는 것입니다.세 번째 단계는 광학적으로 유발된 뇌간 반응을 기록하기 위해 광학 자극기를 배치하는 것입니다. 마지막 단계는 하대장에 접근하여 광학적으로 유발된 활동을 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 청각 뇌간 반응 및 국소 장 전위의 기록을 통해 청각 시스템의 성공적인 자극을 보여줄 수 있습니다.하구(inferior colliculus)에서 auditor nerve의 광유전학적 자극(Optogenetic stimulation). 전기의 대안으로, 인공와우는 더 나은 주파수와 강도 분해능을 약속합니다. 이것은 감사인 연구에서 큰 관심사이지만, 이 기술의 함의는 청각 장애인의 청력 회복을 개선하는 데까지 확장됩니다.이 방법은 정형외과 발달을 개선하기 위한 패턴 활동의 역할, 세포 국소화에서 스펙트럼 통합에 대한 요구 사항, 주파수 특정 프레임 투영 간의 상호 작용 범위와 같은 청각 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중앙 청각 시스템에서는 마이크로 LED 또는 광섬유의 적절한 위치와 방향을 배우기 어렵기 때문에 절차의 시각적 시연이 중요합니다. 마이크로 LED 자극기는 200제곱 미크론 활성 표면이 있는 파란색 LED를 사용하여 마이크로 LED에 첫 번째 솔더 와이어를 연결합니다.다음으로, 에폭시를 사용하여 LED와 그 연결을 캡슐화하고 밤새 건조시킵니다. 경화되면 1mm 외경을 통해 와이어를 공급합니다. 규산염 유리 모세관을 빌리십시오.유리는 기계적 안정성과 전기 절연성을 제공합니다. 모세관과 에폭시 코팅된 LED의 접합부를 더 많은 에폭시 위치로 밀봉하여 모세관을 매니퓰레이터에 장착할 수 있도록 합니다. 이제 전기 연결을 확인하십시오.먼저 구리선 3개를 준비합니다. 각각의 한쪽 끝을 0.9% 염화나트륨 수조에 담그십시오. 그런 다음 다른 쪽 끝을 A BR 증폭기에 연결합니다.오실로스코프로 신호를 모니터링합니다. 그런 다음 테스트를 위해 마이크로 LED를 맞춤형 자극기에 연결합니다. 자극기에 연결된 마이크로 LED를 수조에 담그고 LED에 최소 20분 동안 전원을 공급합니다.LED를 자극하는 동안 오실로스코프에 아티팩트가 있는지 모니터링합니다. 결함이 있는 LED는 폐기합니다. 4주에서 10주 된 생쥐를 마취합니다.이 마우스는 허벅지 아래 채널 옵신 2 1.2 프로모터 10 분을 표현합니다. 마취제를 주입한 후 동물의 금단 반사를 확인하여 마취 수술 평면을 확인합니다. 그런 다음 눈에 연고를 바르고 수술을 시작합니다.먼저, 복고풍 귓바퀴 부위를 조심스럽게 면도하여 공기로 채워진 중이강인 불라(bullah)에 접근합니다. 마이크로 집게를 사용하여 수술 쪽의 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 목 근육, 즉 platysma, sternocleidomastoid 및 scalenes를 조심스럽게 절개합니다.이제 bulla를 노출하십시오. 그것은 고막이 위치한 표면에 고리가 있는 구형의 뼈 구조입니다. 인슐린 바늘을 사용하여 구멍에서 고리 바로 아래에 구멍을 뚫습니다.수포를 덮고 있는 뼈를 제거합니다. 가는 론(Ron)과 마이크로 집게(micro possessps)를 사용하여 이 과정에서 달팽이관의 프로 강당을 노출시킵니다. 다음으로, 달팽이관을 시작합니다. 장루.먼저 막질 미로를 방해하지 않고 뼈낭을 면도합니다. 이제 두 번째 달팽이관 회전에서 500-800미크론의 작은 창을 열고 스테이드 동맥과 정점 개구부에서 멀리 떨어져 있습니다. 정점은 달팽이관을 파열시키고 달팽이관을 골절시킬 수 있습니다.광유전학적 청각 뇌간 반응 또는 OABR을 측정할 준비를 합니다. 먼저 귓바퀴 아래, 꼭지점, 다리 근처 뒤쪽의 다음 위치에 전극을 삽입하고 전극을 증폭기에 연결합니다. 꼭짓점과 유양돌기 피하 바늘 사이의 차이 전위를 증폭시킵니다.50킬로헤르츠에서 샘플링하고 트랜스 달팽이관 자극을 위해 1에서 10,000헤르츠 사이의 반응을 필터링합니다. 기계식 매니퓰레이터로 잡은 마이크로 LED와 결합된 마이크로 LED 또는 광섬유를 장착합니다. 조심스럽게 제자리에 놓습니다.오실로스코프의 차이 전위를 시각화합니다. 광학 자극기의 위치를 쉽게 최적화할 수 있도록 녹음 설정 근처에 두십시오. 신호 평균화를 사용하고 오프라인 분석을 위해 데이터를 컴퓨터에 저장합니다.이제 1 - 5 헤르츠에서 3 - 10 밀리초 펄스의 전류에 대한 응답을 사용하여 마이크로 LED의 위치와 방향을 최적화합니다. 또 다른 옵션은 250마이크로미터 광섬유에 부착된 473나노미터 연속파 레이저에 의한 레이저 자극입니다. 이를 위해서는 레이저 출력 또는 al 광학 장치의 빠른 아날로그 제어가 필요합니다.빠른 셔터를 사용하여 마이크로 매니퓰레이터가 있는 섬유를 달팽이관 장루에 직접 배치하고 달팽이관 내 자극을 위해 치과용 시멘트로 고정합니다. 둥근 창을 통해 광섬유를 Scala.Tempe에 삽입합니다. 1-5 헤르츠에서 10-30 밀리와트의 3-10 밀리초 펄스로 응답을 유도하여 광섬유의 위치와 방향을 최적화합니다.자극기의 위치 지정은 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 마이크로 ED 또는 광섬유는 OABR이 분명해질 때까지 참을성 있게 재배치해야 합니다. 양호한 광유전학적, 청각적 뇌간 반응이 이루어지면 시아노아크릴레이트 접착제나 치과용 시멘트로 섬유를 고정합니다.이 프로토콜의 경우 입체성 프레임을 사용하고 하부 대장 위의 두개골을 열어 마우스를 준비합니다. 현미경을 사용하여 기록 프로브를 하결장 위에 놓고 가장 높은 채널이 표면에서 보이도록 삽입합니다. 이제 recording array의 개별 채널과 reference screw 및 parietal bone 사이의 차이 전위를 증폭시킵니다.32kHz의 샘플 레이트와 300Hz 저역 통과 필터를 사용하여 데이터를 저장합니다. 최적의 달팽이관 장루는 매우 중요하며 성공적인 실험의 가능성을 높입니다. 이것은 창문이 규칙적이고 작으며 내부 달팽이관 구조의 손상이 없음을 의미합니다.예를 들어, 출혈은 채널 Rodin 2개의 형질전환 마우스를 사용하여 STR ssis의 손상을 나타냅니다. 채널 로댕 2는 마이크로 LED 또는 레이저에 의해 달팽이관 블루 라이트 조명 내의 나선형 갱 뉴런으로 표현되며, 이는 진폭 및 파형 광유전학에서 음향 A BR과 다른 큰 광유전학 A BR을 이끌어냅니다. BR은 음향 A BR 광유전학보다 진폭이 더 큽니다.따라서 BR은 전기 A BR과 더 유사합니다. 둘 다 더 많은 나선형 신경절 뉴런을 모집하거나 나선형 신경절 뉴런의 보다 동기화된 활성화를 유도할 수 있습니다. 청각 경로를 통한 활동의 전파는 중추 청각 시스템의 세포 외 기록에 의해 확인되었습니다. 예를 들어, 달팽이관의 광유전학적 자극은 청각 중뇌의 신경 활동을 유도했습니다.마이크로 LED 자극기의 기계적 안정성과 안전한 전기 절연, 과도한 탄소 흐름 방지는 모두 달팽이관 광유전학의 성공적인 사용에 중요한 요소입니다. 이 프로를 시도하는 동안 에볼라에서 원부 동맥을 손상시키지 않도록 기억하는 것이 중요합니다. 일단 마스터링되면 하구의 녹음은 제대로 수행되면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차 a에 따라, 하구(inferior colliculus)에서 단일 단위 기록과 같은 방법을 수행할 수 있습니다. 청각 경로의 광유전학적 자극은 청각 신경 과학 연구가 이전에는 음향 또는 전기 자극으로 해결할 수 없었던 질문을 할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 우리는 또한 이 기술이 청각 장애의 임상 재활에 적용되기를 희망합니다.

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

쥐에서 청각 보철 연구를위한 고전적인 공포 컨디셔닝 행동 패러다임의 응용 프로그램이 설명되어 있습니다. 이 패러다임은 모두 탐지 식별을위한 메커니즘 및 결과 조치로 심장 속도를 사용하여 서로 다른 음향 및 전기 자극 사이에 차별을 제공합니다.

고전 컨디셔닝 및 하트 속도 접근법을 사용 청각 음향과 전기 자극의 자극 페어 차별의 행동 결정

출처: Kozin, E. D., et.al. 청각 경로의 광유전학적 자극을 위한 쥐 등쪽 달팽이관 핵의 직접 시각화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 빛 유도 청각 자극을 가능하게 하기 위해 마우스 등쪽 달팽이관 핵(DCN)으로의 바이러스 매개 유전자 전달을 보여줍니다. 빛에 민감한 이온 채널인 옵신을 암호화하는 바이러스 벡터는 직접 접근을 위해 개두술 및 소뇌 흡인 후 DCN에 주입됩니다. 발현된 옵신은 뉴런이 빛에 의해 활성화될 수 있도록 하여 광유전학을 사용하여 청각 경로 반응을 연구하기 위한 모델을 제공합니다.

빛 유도 청각 자극을 위한 마우스 등쪽 달팽이관 핵으로의 바이러스 매개 유전자 전달

이 비디오는 청각 신경근을 자극하고 마우스 뇌 쐐기 슬라이스의 내측 올리보코클리 뉴런에서 시냅스후 전류를 기록하는 프로토콜을 보여줍니다.

청각신경근 자극 및 시냅스후 전류 기록(Auditory Nerve Root Stimulation and Postsynaptic Current Recordings in a Mouse Brain Wedge Slice)

출처: Badran, BW, et al. 경피적 귀 미주 신경 자극(taVNS)의 실험실 관리: 기술, 표적 지정 및 고려 사항. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 뇌 활동을 조절하는 비침습적 방법인 경피적 귀 미주 신경 자극(taVNS)을 보여줍니다. 전극은 미주 신경(ABVN)의 귓바퀴 가지를 표적으로 하는 외이도와 이주의 전벽에 배치됩니다. 자극을 받으면 생성된 신경 자극이 뇌간으로 이동하여 여러 뇌 영역과 그 기능에 영향을...

인간의 귀에 대한 경피적 귀 미주 신경 자극

출처: Akil, O., et al., 둥근 창막을 통해 마우스 내이에 바이러스 매개 유전자 전달을 위한 수술 방법. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 유전적 난청이 있는 쥐 강아지의 내이에 치료 유전자를 전달하는 절차를 보여줍니다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용하여 유전자를 둥근 창막을 통해 주입하여 바이러스 입자가 유모 세포에 들어가 글루타메이트 수송체 생성을 회복하고 뇌에 대한 소리 신호를 재설정할 수 있도록 합니다.

마우스 모델에서 청력 회복을 위한 바이러스 벡터 기반 유전자 치료

이 프로토콜의 목표는 쥐 모델에서 배측 달팽이관 핵에 직접 접근할 수 있도록 하는 수술적 접근 방식을 설명하는 것입니다.

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

청각 기관은 청각을 중재합니다. 여기에서는 발달 중인 닭 청각 기관에서 청각 전구 세포 증식 및 분화를 연구하기 위해 최적화된 수정된 in ovo micro-electroporation 방법을 제시합니다.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

우리는 달팽이 관에 트랜스 귀 경로 통해 약물의 지역화 된 관리 기법을 제시. Cisplatin 같은 화학요법 약물의 항 암 효능이이 경로 통해 약물 전달 방해 하지 것 이다.

Ototoxicity의 치료에 대 한 트랜스-귀 약물 전달

달팽이 관 임 플 란 트의 동물 모델 영구 난청 전기 자극 치료의 기술 기반 지식을 사전 수 있습니다. 이 연구는 급성 굉음을 쥐 청각 brainstem 응답 기능 평가 있는 전극 배열 인공 와우 이식 수술 프로토콜을 제공합니다.

인공 와우 수술 및 C57BL/6 마우스에 전기 evoked 청각 Brainstem 응답 기록

뉴런에 다양한 시냅스 입력의 통합은 자연 타이밍과 회로 가소성을 위해 모든 사전 시냅스 핵을 보존하는 준비에서 가장 잘 측정되지만, 뇌 슬라이스는 일반적으로 많은 연결을 끊습니다. 우리는 생체 외 실험 능력을 유지하면서 생체 내 회로 활동을 모방하는 수정 된 뇌 조각을 개발했습니다.

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

더 긴 전극을 사용한 전기 음향 자극(EAS)은 고주파 난청의 경우 더 넓은 달팽이관 범위와 다양한 유형의 맵을 제공할 수 있습니다. 덜 침습적인 수술, 유연한 측벽 전극 및 스테로이드 투여를 결합하면 외과적 외상이 거의 또는 전혀 없이 더 깊은 삽입이 가능하여 청력이 잘 보존됩니다.

더 긴 전극을 사용한 전기 음향 자극을 통한 고주파 청력 손실에서 향상된 달팽이관 적용 범위 및 청력 보존

배우세요 생쥐 청각 신경의 광유전학적 자극 방법을 통해 청각 연구의 새로운 접근법을 탐색하세요. 이 기술은 인공와우 이식의 한계를 극복하고 주파수 및 강도 해상도를 향상시켜 청각 장애 치료에 기여할 수 있습니다.

청각 신경의 자극 Optogenetic

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