청각 신경의 자극 Optogenetic

이 절차의 전반적인 목표는 광유전학적으로 변형된 나선형 신경절 뉴런을 가진 동물의 청각 신경을 광학적으로 자극하는 것입니다. 이것은 먼저 청색 마이크로 LED 자극기 또는 청색 레이저에 결합된 광섬유를 준비함으로써 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 후향 귀 미세수술 접근법을 사용하여 달팽이관을 평가하는 것입니다.

세 번째 단계는 광학적으로 유발된 뇌간 반응을 기록하기 위해 광학 자극기를 배치하는 것입니다. 마지막 단계는 하대장에 접근하여 광학적으로 유발된 활동을 기록하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 청각 뇌간 반응 및 국소 장 전위의 기록을 통해 청각 시스템의 성공적인 자극을 보여줄 수 있습니다.

하구(inferior colliculus)에서 auditor nerve의 광유전학적 자극(Optogenetic stimulation). 전기의 대안으로, 인공와우는 더 나은 주파수와 강도 분해능을 약속합니다. 이것은 감사인 연구에서 큰 관심사이지만, 이 기술의 함의는 청각 장애인의 청력 회복을 개선하는 데까지 확장됩니다.

이 방법은 정형외과 발달을 개선하기 위한 패턴 활동의 역할, 세포 국소화에서 스펙트럼 통합에 대한 요구 사항, 주파수 특정 프레임 투영 간의 상호 작용 범위와 같은 청각 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중앙 청각 시스템에서는 마이크로 LED 또는 광섬유의 적절한 위치와 방향을 배우기 어렵기 때문에 절차의 시각적 시연이 중요합니다. 마이크로 LED 자극기는 200제곱 미크론 활성 표면이 있는 파란색 LED를 사용하여 마이크로 LED에 첫 번째 솔더 와이어를 연결합니다.

다음으로, 에폭시를 사용하여 LED와 그 연결을 캡슐화하고 밤새 건조시킵니다. 경화되면 1mm 외경을 통해 와이어를 공급합니다. 규산염 유리 모세관을 빌리십시오.

유리는 기계적 안정성과 전기 절연성을 제공합니다. 모세관과 에폭시 코팅된 LED의 접합부를 더 많은 에폭시 위치로 밀봉하여 모세관을 매니퓰레이터에 장착할 수 있도록 합니다. 이제 전기 연결을 확인하십시오.

먼저 구리선 3개를 준비합니다. 각각의 한쪽 끝을 0.9% 염화나트륨 수조에 담그십시오. 그런 다음 다른 쪽 끝을 A BR 증폭기에 연결합니다.

오실로스코프로 신호를 모니터링합니다. 그런 다음 테스트를 위해 마이크로 LED를 맞춤형 자극기에 연결합니다. 자극기에 연결된 마이크로 LED를 수조에 담그고 LED에 최소 20분 동안 전원을 공급합니다.

LED를 자극하는 동안 오실로스코프에 아티팩트가 있는지 모니터링합니다. 결함이 있는 LED는 폐기합니다. 4주에서 10주 된 생쥐를 마취합니다.

이 마우스는 허벅지 아래 채널 옵신 2 1.2 프로모터 10 분을 표현합니다. 마취제를 주입한 후 동물의 금단 반사를 확인하여 마취 수술 평면을 확인합니다. 그런 다음 눈에 연고를 바르고 수술을 시작합니다.

먼저, 복고풍 귓바퀴 부위를 조심스럽게 면도하여 공기로 채워진 중이강인 불라(bullah)에 접근합니다. 마이크로 집게를 사용하여 수술 쪽의 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 목 근육, 즉 platysma, sternocleidomastoid 및 scalenes를 조심스럽게 절개합니다.

이제 bulla를 노출하십시오. 그것은 고막이 위치한 표면에 고리가 있는 구형의 뼈 구조입니다. 인슐린 바늘을 사용하여 구멍에서 고리 바로 아래에 구멍을 뚫습니다.

수포를 덮고 있는 뼈를 제거합니다. 가는 론(Ron)과 마이크로 집게(micro possessps)를 사용하여 이 과정에서 달팽이관의 프로 강당을 노출시킵니다. 다음으로, 달팽이관을 시작합니다. 장루.

먼저 막질 미로를 방해하지 않고 뼈낭을 면도합니다. 이제 두 번째 달팽이관 회전에서 500-800미크론의 작은 창을 열고 스테이드 동맥과 정점 개구부에서 멀리 떨어져 있습니다. 정점은 달팽이관을 파열시키고 달팽이관을 골절시킬 수 있습니다.

광유전학적 청각 뇌간 반응 또는 OABR을 측정할 준비를 합니다. 먼저 귓바퀴 아래, 꼭지점, 다리 근처 뒤쪽의 다음 위치에 전극을 삽입하고 전극을 증폭기에 연결합니다. 꼭짓점과 유양돌기 피하 바늘 사이의 차이 전위를 증폭시킵니다.

50킬로헤르츠에서 샘플링하고 트랜스 달팽이관 자극을 위해 1에서 10,000헤르츠 사이의 반응을 필터링합니다. 기계식 매니퓰레이터로 잡은 마이크로 LED와 결합된 마이크로 LED 또는 광섬유를 장착합니다. 조심스럽게 제자리에 놓습니다.

오실로스코프의 차이 전위를 시각화합니다. 광학 자극기의 위치를 쉽게 최적화할 수 있도록 녹음 설정 근처에 두십시오. 신호 평균화를 사용하고 오프라인 분석을 위해 데이터를 컴퓨터에 저장합니다.

이제 1 - 5 헤르츠에서 3 - 10 밀리초 펄스의 전류에 대한 응답을 사용하여 마이크로 LED의 위치와 방향을 최적화합니다. 또 다른 옵션은 250마이크로미터 광섬유에 부착된 473나노미터 연속파 레이저에 의한 레이저 자극입니다. 이를 위해서는 레이저 출력 또는 al 광학 장치의 빠른 아날로그 제어가 필요합니다.

빠른 셔터를 사용하여 마이크로 매니퓰레이터가 있는 섬유를 달팽이관 장루에 직접 배치하고 달팽이관 내 자극을 위해 치과용 시멘트로 고정합니다. 둥근 창을 통해 광섬유를 Scala.Tempe에 삽입합니다. 1-5 헤르츠에서 10-30 밀리와트의 3-10 밀리초 펄스로 응답을 유도하여 광섬유의 위치와 방향을 최적화합니다.

자극기의 위치 지정은 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. 마이크로 ED 또는 광섬유는 OABR이 분명해질 때까지 참을성 있게 재배치해야 합니다. 양호한 광유전학적, 청각적 뇌간 반응이 이루어지면 시아노아크릴레이트 접착제나 치과용 시멘트로 섬유를 고정합니다.

이 프로토콜의 경우 입체성 프레임을 사용하고 하부 대장 위의 두개골을 열어 마우스를 준비합니다. 현미경을 사용하여 기록 프로브를 하결장 위에 놓고 가장 높은 채널이 표면에서 보이도록 삽입합니다. 이제 recording array의 개별 채널과 reference screw 및 parietal bone 사이의 차이 전위를 증폭시킵니다.

32kHz의 샘플 레이트와 300Hz 저역 통과 필터를 사용하여 데이터를 저장합니다. 최적의 달팽이관 장루는 매우 중요하며 성공적인 실험의 가능성을 높입니다. 이것은 창문이 규칙적이고 작으며 내부 달팽이관 구조의 손상이 없음을 의미합니다.

예를 들어, 출혈은 채널 Rodin 2개의 형질전환 마우스를 사용하여 STR ssis의 손상을 나타냅니다. 채널 로댕 2는 마이크로 LED 또는 레이저에 의해 달팽이관 블루 라이트 조명 내의 나선형 갱 뉴런으로 표현되며, 이는 진폭 및 파형 광유전학에서 음향 A BR과 다른 큰 광유전학 A BR을 이끌어냅니다. BR은 음향 A BR 광유전학보다 진폭이 더 큽니다.

따라서 BR은 전기 A BR과 더 유사합니다. 둘 다 더 많은 나선형 신경절 뉴런을 모집하거나 나선형 신경절 뉴런의 보다 동기화된 활성화를 유도할 수 있습니다. 청각 경로를 통한 활동의 전파는 중추 청각 시스템의 세포 외 기록에 의해 확인되었습니다. 예를 들어, 달팽이관의 광유전학적 자극은 청각 중뇌의 신경 활동을 유도했습니다.

마이크로 LED 자극기의 기계적 안정성과 안전한 전기 절연, 과도한 탄소 흐름 방지는 모두 달팽이관 광유전학의 성공적인 사용에 중요한 요소입니다. 이 프로를 시도하는 동안 에볼라에서 원부 동맥을 손상시키지 않도록 기억하는 것이 중요합니다. 일단 마스터링되면 하구의 녹음은 제대로 수행되면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차 a에 따라, 하구(inferior colliculus)에서 단일 단위 기록과 같은 방법을 수행할 수 있습니다. 청각 경로의 광유전학적 자극은 청각 신경 과학 연구가 이전에는 음향 또는 전기 자극으로 해결할 수 없었던 질문을 할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 우리는 또한 이 기술이 청각 장애의 임상 재활에 적용되기를 희망합니다.