토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

이 절차의 목적은 장 병원성 선충의 토양 샘플링 및 분리에 일반적으로 사용되는 방법과 기술을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 transect 접근 방식으로 토양 샘플을 수집하거나 무작위 샘플링 접근 방식으로 시연하여 수행됩니다. 다음으로, 토양 샘플은 곤충과 함께 감소하여 장 병원성 선충을 선택적으로 회수했습니다.

마지막 단계는 변형된 흰색 트랩을 사용하여 감염된 곤충에서 선충을 수집하는 것입니다. 궁극적으로 이러한 기술은 실험실에서 장 병원성 선충 배양을 성공적으로 확립하기 위한 핵심 단계를 나타내며 다운스트림 생물학적 분석의 기초를 형성합니다. 토양 샘플링 기술의 장점은 현장에 가서 병원성 선충의 성숙 단계를 수집할 수 있다는 것입니다.

나는 거의 만나지 않는 이 선충에 감염된 곤충을 샘플링하는 것보다는. 우리가 사용하는 무작위 표본 전략은 일반적으로 큰 지리적 지역 또는 지역에서 병원성 선충의 다양성을 평가하는 데 사용됩니다. 이 기술은 1975년 Accur의 베팅에 의해 처음 설명되었습니다.

그것은 자유로운 생활 단계가 곤충 숙주에 끌려 기생한다는 전제에 기초한 선택적 절차입니다. 시연 절차는 Rue Orozco 대학원생과 내 실험실의 Ming Mingle 연구 기술자가 될 것입니다. 실험실. 샘플을 채취하는 장소의 면적은 최소 2제곱미터여야 하며, 가능하면 4제곱미터 이상이어야 합니다.

각 토양 샘플에 대해 DM a C 샘플 영역 내에서 최소 3개의 더 작은 하위 샘플을 채취합니다. 하위 표본은 연구의 목적을 충족하는 경우 결합할 수 있습니다. 토양 샘플을 0에서 15cm 깊이로 수집합니다.

각 샘플은 250g에서 1kg이어야 합니다. 토양 CORA 트로우, 손 삽 또는 이와 유사한 도구를 사용하고 선택한 각 샘플링 영역 내에서 최소 5개의 무작위 사이트에서 수집합니다. 각 샘플은 이중 포장되어야 하며 방수 마커로 표시되어야 합니다.

라벨에는 부지, 위치, 고도, 날짜 및 부지의 관련 식생 및 온도와 함께 서식지 설명과 같은 환경 변수에 대한 정보가 포함되어야 합니다. 지역 곤충 및 기타 무척추 동물 종을 기록하십시오. 수집 장소 간 실험실에서 나중에 식별하기 위해 즉시 식별할 수 없는 수집 종을 수집하고, 수집 도구를 물로 철저히 세척한 다음 70% 에탄올 또는 0.5% 표백제를 사용하여 소독합니다.

토양 샘플을 섭씨 8도에서 15도의 쿨러에 보관하여 운송합니다. CES는 샘플의 한 부분을 분리하여 토양의 구성, 질감, 전도성 등과 같은 토양의 전체적인 특성을 분석합니다. 각 토양 샘플에서 seic 미생물 오염으로 이어질 수 있는 파편을 제거합니다.

그런 다음 토양에 물을 적셔 그 안에 있는 선충이 쉽게 이동할 수 있도록 합니다. 200-250g의 축축한 흙을 뚜껑이 있는 플라스틱 용기에 넣습니다. 그런 다음 곤충 미끼를 추가하십시오.

5-10마리의 곤충으로 충분합니다. 뚜껑을 닫고 용기를 뒤집어 어두운 곳에 두십시오. 2-3일에 한 번씩 실온에서 죽은 곤충을 제거하고 필요에 따라 건강한 곤충으로 교체하여 체중을 늘리십시오.

곤충 사체가 갈색 또는 황토색이면 Stein과 Nema가 parit에 기생하고 있음을 암시합니다. 반면에 시체가 벽돌 빨간색에서 짙은 자주색이면 이종을 예상하십시오. 변형된 흰색 덫을 사용하여 곤충 미끼에 기생한 선충을 수집하십시오.

먼저 50mm 또는 60mm 페트리 접시의 뚜껑을 100mm 접시의 바닥에 놓습니다. 그런 다음 원형 와트만 시트를 놓습니다. 작은 접시에 있는 첫 번째 여과지.

곤충 사체를 살균 된 물로 헹구고 여과지에 옮깁니다. 서로 접촉하지 않도록 흩어져 있습니다. 더 큰 접시에만 약 20ml의 증류수를 채우고 더 큰 접시로 어셈블리를 덮습니다. 뚜껑.

요리에 선충 이름, 곤충 미끼 날짜 및 날짜를 표시하십시오. 트랩이 설치되었습니다. 트랩을 실온에 유지하고 곤충 사체에서 나오는 감염성 어린 선충 또는 IJ를 모니터링합니다.

이 작업은 10일에서 25일이 소요될 수 있으며 트랩이 보관되는 곳의 온도와 수분 수준에 따라 다릅니다. 트랩의 수위가 증발한 경우 IJ가 있는 접시에 다시 채워야 합니다. 선충이 들어있어야 하는 더 큰 접시에서 물을 수확합니다.

선충을 몇 분 동안 가라앉힌 다음 천천히 물을 디캔팅합니다. 선충이 소량의 물에 남아 있으면 물을 다시 추가한 다음 조심스럽게 부어 몇 번 더 헹굽니다. 그런 다음 선충 개체군을 추정하기 위해 연속 희석을 수행합니다.

250ml 배양 플라스크에서 선충의 농도를 밀리리터당 1개에서 3000개 사이로 조정합니다. 이 서스펜션은 섭씨 10도에서 20도 사이에 보관하십시오. 일반적으로 자연에서 장 병원성 선충에 기생하는 곤충을 찾을 가능성은 매우 낮습니다.

따라서, G 흑색종 유충을 미끼로 사용하는 개략적인 프로토콜은 훨씬 더 효율적인 속도로 이러한 선충을 분리하는 데 사용되었습니다. 5일 후, 곤충은 감염되어 붉은 색을 띠었습니다. 변형된 흰색 덫은 선충의 흔적을 보여주었습니다.

이 덫에서 15일이 지나자, 선충은 물에 모여서 깨끗한 모습을 보였고 곤충 조직도 없었습니다. 갈륨 멜라니아 유충을 사용한 단일 추출 주기는 토양 샘플에 있는 모든 오마 병원성 선충을 회수하는 데 충분하지 않을 수 있습니다. 따라서 이 작업을 여러 번 수행하는 것이 좋습니다.

또한 사용자는 갤러리아보다 다른 곤충을 고려하는 것이 좋으며, 이는 회복 가능성도 높일 것입니다. 곤충과 토양 샘플에 대한 토론은 박테리아나 곰팡이와 같은 다른 곤충 병원체를 분리하기 위해서도 고려할 수 있는 기술입니다.