Name: 전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 배우세요 제브라피시 배아 심장의 신속한 수동 해부법을 통해 심장 특이적 RNA를 추출하고 전사체 분석을 수행하는 방법을. 이 기술은 심장 발달 유전학 연구에 활용됩니다.

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이 정제 프로토콜의 기본 원리를 설명해 준 C. Burns, C. McRae, 그리고 우리 실험실에서 이 방법을 처음 구현한 F. Priller에게 감사드립니다. S.A.-S. 는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)의 하이젠베르크 교수직의 지원을 받습니다. 이 작업은 DFG 보조금 SE2016/7-1의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 독일과 베를린 주법의 동물 보호 지침을 다음과; 제브라 피쉬의 처리는 동물 보호 (LaGeSo, 베를린 - 브란 덴 부르그)에 대한 지방 자치 단체에 의해 모니터링 하였다. 1. 심장 추출을위한 Zebrafish의 배아를 얻기 <ol><li> 형질 전환 라인 9 twu34 마음 별 GFP 발현과 배아를 얻기 위해 : 같은 Tg는 (EGFP myl7)와 같은 크로스 심장 기자 제브라 피쉬. </li><li> 원하는 배아 단계 10, 11까지 28.5 ° C에서 계란 물 배아를 유지한다. 수집 된 배아 인구는 유전자 발현의 변화를 제한하는 두 유전자와 발달 단계에 의해 균일 있는지 확인하십시오. </li><li> 수동으로 배아를 Dechorionate. </li></ol> 2. 해부 Zebrafish의 배아 마음 참고 : 얼음의 모든 솔루션을 보관하십시오. 가능하면, 팀워크를 수행 한 사람이 EMB에서 마음을 해부한다ryos 다른 사람이 형광 실체 현미경 마음을 정렬한다. 이 작업은 몇 시간에서 배아의 수백의 처리를 할 수 있습니다. <ol><li> 1.5 ㎖의 원심 분리 관에 약 100 배아를 전송합니다. tricaine와 배아 (E3​​ 매체에 0.16 ㎎ / ㎖)을 마취. 배아가 명확하게 마취 일단 시험 (그들은 수영 튜브의 바닥에 침전물, 그러나 그들의 마음은 여전히​​ 치고있다하지 않음). </li><li> tricaine / E3 솔루션을 제거하고 1 ml의 L-15 / 10 % FBS 배지로 한 번 배아를 씻어 얼음에 유지한다. 참고 : L-15 / 10 % FBS 매체는 마음 RNAlater 또는 트리 졸에 전송 될 때까지 전체 해부 과정에서 살아 장기와 세포를 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> 노른자가 완전히 중단 될 때까지 라운드 젤로드 팁과 위아래로 배아 및 피펫에 5-8 시간을 1 ml의 L-15 / 10 % FBS 매체를 추가합니다. 배아 드롭 현명한 용액의 표면에, 드롭 버스트 수 있도록 피펫배아는 부드럽게 중단된다. 참고 : 최대 피펫 아래로, 즉 더 피펫 팅이 후반 단계 (예를 들어 56 HPF에서)에 필요, 태아의 발달 단계에 따라하는 방법을 적극적으로 얼마나 자주 배아가있다. </li><li> 너무 부드럽게 피펫 경우 어떤 마음이 배아에 부착 남아있을 수 있기 때문에 해부 배아의 첫 번째 일괄 들어, 배아의 무결성과 실체 현미경을 해부 마음의 비율을 평가합니다. 이에 따라 절개의 다음 라운드 피펫의 방식을 조정합니다. 참고 : 플라스틱에 집착 마음을 최소화하기 위해 낮은 유지 피펫 팁과 마이크로 원심 튜브를 사용합니다. </li><li> 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 배치 된 100 ㎛ 필터 상에 시료를 적용; 1ml의 L-15 / 10 % FBS 배지를 1.5 ml의 튜브 헹구어 낸 후 (일부 하트 튜브의 벽에 달라 붙을 수있는) 샘플의 손실을 최소화하기 위해 필터에 이것을 적용한다. 1 ml의 L과 필터를 2 회 세척-15 / 10 % FBS. 이 단계에서는 마음이 필터를 통과하고 50 ML 튜브에 수집됩니다. </li><li> 15 ml의 원심 분리 튜브에 배치 된 30 μm의 필터로 관류를 적용하고 1 ㎖의 L-15 / 10 % FBS 배지로 한번 필터를 헹군다. 이 초 여과 공정에서, 하트 필터에 보유되고, 작은 먼지는 세척된다. </li><li> 거꾸로 필터를 켜고 1 ml의 L-15 / 10 % FBS와 세 개의 연속 세척을 적용하여 1 % 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에 필터 중 마음을 세척하십시오. </li><li> 수동 형광 실체 현미경 포셉 쌍 비 형광 배아 파편 (예 : 아이 렌즈)로부터 GFP 양성 하트 분리 접시의 중앙에이를 농축시킨다. 3 단계에 따라이를 수집합니다. 참고 : 배아 나이가 24 HPF 경우, 마음, 구타 조직이 아직도 생리 학적으로 정상을 나타내는해야한다. </li></ol> 3. Dissec에서 mRNA의 격리를테드 마음 <ol><li> (얼음) 0.75 ㎖의 RNAlater를 포함하는 1.5 ML 튜브에 가장 작은 부피의 마음 (예를 들어 10 μL)과 펫을 수집합니다. 더 마음 형광 실체 현미경을 보면서 피펫 팁에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 대안 적으로, 화학적 후드 형광 현미경의 바로 근처에서 사용할 경우, 화학 후드 트리 졸 (주)에 수집 된 하트 옮긴다. 이 피펫 팁과 또한 마음의 원심 분리 동안 고집 마음의 가능한 손실을 회피 (3.4, 3.5 및 3.7 단계). 트리 졸와 같은 튜브에 격리 몇 차례의 마음을 풀 3.8 단계로 바로 이동; 최종 부피는 트리 졸 원래 부피의 10 %를 초과하지 않아야한다. 참고 : 사용하기 전에 트리 졸 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 후드 아래 트리 졸 시약을 처리하고 개인 보호 장비를 권장 착용하십시오. 피부, 눈, 및 clothi과의 접촉을 피할 것NG. 모든 점화원을 제거 할 것. </li><li> RNA 분리의 효율이 수집 된 조직의 양의 향상으로, (얼음) RNAlater와 같은 튜브에 격리 몇 차례의 마음을 풀. 총 샘플 부피 RNAlater 원래 부피의 10 %를 초과하는 경우, (얼음) 저장 RNAlater 0.75 ㎖를 추가로 관을 사용한다. </li><li> 마음을 침전 4 ° C에서 20 분 동안 15,700 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 형광 실체 현미경을 이용하여, 3 ㎖ L-15 / 10 % FBS 배지를 함유하는 1 % 아가로 코팅 된 배양 접시에 최대한 신중만큼 상등액을 수집하지만, 원심 분리 튜브 바닥에 침강 마음을 방해하지 않는다. 마음의 최대 15 % 인해 RNAlater의 높은 점도에 뜨는에 남아있을 수 있기 때문에 단계 3.7에 설명 된대로, 그들을 검색 할 수 있습니다. </li><li> 화학 후드에서 침전 마음이 들어있는 튜브에 0.5 ml의 트리 졸을 추가하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 형광 microsco에서PE, 희석 3 ㎖ L-15 / 10 % FBS와 다른 1 % 아가 로스 코팅 접시에 RNAlater / L-15 / 10 % FBS 용액을 함유하는 1 % 아가 로스 코팅 접시에서 (단계 3.5)에서 하트 전송할 RNAlater 아웃. 페트리 접시의 중앙에 마음을 수집하고 화학 후드 트리 졸에 침전 된 마음의 튜브에 작은 볼륨을 전송합니다. </li><li> 소용돌이는 트리 졸에 마음을 포함하는 1.5 ML 튜브는 마음에 혼란을 실온에서 5 분 동안 품어합니다. </li><li> 화학 후드에서 100 μl의 클로로포름 (주의)를 추가, 철저하게 혼합하고 (사용하기 전에 최대 속도로 원심 분리기 30 초)를 1.5 ml의로 미리 회전 PLG 튜브를 트리 졸 / 클로로포름 용액을 전송합니다. 실온에서 3 분 동안 배양한다. 참고 : 사용하기 전에 클로로포름 MSDS를 참조하십시오. 후드 클로로포름 시약을 처리하고 개인 보호 장비를 권장 착용하십시오. 피부, 눈, 및 의복에 접촉하지 않도록 할 것. 알칼리 금속과 멀리 혼합 위험성에서 보관하십시오. </li><li> CentrifuGE의 4 ° C에서 15 분 동안 15,700 XG에 샘플 및 새로운 1.5 ML 튜브로 수성 단계를 전송합니다. </li><li> 5 ~ 10 μg의 글리코겐과 이소프로판올 (-20 ° C에서) 예비 냉각 25​​0 μl를 추가; 잘 혼합 및 -20 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 4 ° C에서 30 분 동안 15,700 XG에서 샘플을 원심 분리기 상층 액을 버린다. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 15,700 XG에 1 ml의 75 % 에탄올, 원심 분리기와 펠렛을 세척하고 상층 액을 제거한다. </li><li> 그것은 (예를 들면 10 ~ 15 분 동안)의 백색이 될 때까지 상온에서 펠렛을 건조하여 에탄올을 증발하자. </li><li> 펠렛 20 μL RNA 분해 효소가없는 DDH 2 O를 추가하고 RNA를 용해 55 ° C에서 10 ~ 15 분 동안 배양; 다음 얼음에 보관하십시오. </li><li> 흡광도를 측정하여 RNA 농도와 순도를 평가합니다. 1 % 아가 로스 겔상에서 샘플을 실행하여 RNA 무결성을 평가. </li></ol>

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</ol>

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이 프로토콜은 유전자 발현 용 제브라 피쉬 배아 심장 조직의 신속한 분석을 보충한다. RNA 정제 할수있는 충분한 작동하기 때문에, 하트 손실 프로토콜의 모든 단계에서 방지 할 경우에는 먼저, 시료의 수량이 크게 향상된다 : 심장 특이 RNA 샘플의 양과 질을 크게 몇 결정적인 단계에 따라 출발 물질. 둘째, 실험에 전적으로 의존하는 샘플의 순도는, 정렬 및 엄격하게 다른 조직을 제외한 동안 배양 접시 내 마음을 수집하여 결정된다. 셋째, 샘플 품질은 비판적으로 배아의 파괴에 따라 발생할 수있는 RNA의 분해를 제한에 따라 달라집니다; 이것은 세포 죽음을 피하기 위해 세포 배양 배지를 사용하여 얼음에 샘플을 유지함으로써 달성된다. 마음이 RNAlater 또는 트리 졸에 전송 된 후 RNA 분해가 중지됩니다. 마음 페트리 접시에 치는 것을 강력하게 보여주는 심장 t문제는 절개 후 생리 학적으로 정상입니다. 우리는 충분히 RNA 안전하게 (함께 5 ~ 10 μg의 글리코겐으로) ...

제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))는 널리 때문에 작은 크기와 형광 단백질의 조직 특이 적 발현과 유전자 변형 기자 라인의 가용성과 결합의 빠르고 투명하고 자궁 외 배아 발달로 생체 내에서 기관 형성을 연구하기 위해 발달 생물학에서 사용된다. 이 작은 척추 동물은 특히 초기 제브라 피쉬 배아의 산소가 심장 박동, 혈액 흐름에 의존하지 않기 때문에 심장 개발을 연구하기에 적합하다; 이러한 기능은 심장 혈관 돌연변이 1,2 많은 수의 특성을 허용하고 제브라 피쉬는 이제 심장 질환 (3) 연구 널리 알려진 모델 생물이다. 배아 개발하는 동안 유전자 발현을 연구하기 위해, 성적 증명서는 일반적으로 전체 마운트 현장 하이브리드에 (WISH) 4 분석, RT-qPCR에 5, 마이크로 어레이 (6), 또는 차세대 시퀀싱 (RNA-SEQ) 7. 동안WISH 전체 배아 내의 유전자 발현의 시공간적 분석, 전사 레벨은 일반적으로 RT-qPCR에, 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ 접근법에 의해 평가되어 있습니다. 그러나 이러한 방법은 특정 유전자 발현 프로파일 링에 대한 조직 농축이 필요합니다. 제브라 피쉬 배아 심장이 전체 배아의 작은 부분을 나타 내기 때문에, 심장 개발하는 동안 사체 연구는 해부과 마음의 농축을위한 프로토콜이 필요합니다. 또한, 생리 학적으로 관련 데이터를 얻기 위해, 그것은 RNA 추출까지 완전히 기능 심장 조직을 유지하는 것이 중요하다. 여기서 우리는 신속하게 생리 학적으로 정상 분리하고 효율적으로 추가 분석을위한 고품질의 RNA 샘플을 얻기 위해 제브라 피쉬 배아의 수백 마음을 구타하기위한 프로토콜을 설명합니다. 본 발명의 방법은 화상 및 맥레이 2006 년 8 의해보고 된 프로토콜을 기반으로합니다. 심장 조직의 농축의 경우, 두 가지 방법은 형질 전환 심근 기자 행을 사용하여및 다른 조직에 비해 제브라 피쉬 배아 마음의 차동 접착 특성을 활용. 간단히, 좁은 피펫 팁을 통해 아래로 많은 배아를 피펫으로, 마음이 동시에 배아의 몸에서 해제되고 순차적으로 두 개의 빠른 여과 단계에서 배아 파편 분리; 형광 표지 된 마음은 수동으로 남아있는 파편에서 분류 및 추가 처리를 위해 수집됩니다.

<table><tbody><tr><td>물고기를 기르고 알을 모으는 장비&nbsp;</td><td></td><td></td><td>자세한 내용은 Zebrafish Book11 참조</td></tr>: <tr><td>형광 실체현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-분광 광도계</td><td></td><td></td><td>e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>핵산 전기영동 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 4cm &Oslash;, E3 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 및 팁(P20, P100, P1000)</td>에 1% 아가로스로 코팅1.5ml <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15ml 및 50ml 원심분리 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 겸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자 쌍ExactaCruz&trade; 멸균 랙에 있는 라운드 젤 로딩 팁, 1-200&mu; 엘&nbsp;</td><td>산타 크루즈</td><td>sc - 201732</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m 필터 (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m 필터 (Pre-Separation Filters-30 &micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>위상 잠금 젤, 무거운, 1.5 ml 튜브&nbsp;</td><td>프라임</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>계란 물 매체</td><td></td><td></td><td>60 &mu; g/ml 인스턴트 해양 바다 소금(ddH2O), 0.00001%(w/v) 메틸렌 블루</td></tr><tr><td>E3 매체&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td></tr><tr><td>1% 아가로스(E3 매체)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 아가로스 젤(TBE 완충액)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&acute; s L-15 미디엄&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>1559606</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td>20 &마이크로; g/&마이크로; l RNase-free 물에서</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% 에탄올 (DEPC-ddH2O에서)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>뉴클레아제가 없는 물 또는 멸균된 DEPC는 ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>핵산 로딩 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris/Borate/EDTA) 전기 영동</td><td></td><td></td><td>을 위한 버퍼를 처리했습니다.</td></tr></tbody></table>

전사 분석을위한 대규모 zebrafish의 배아 심장의 해부

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

제브라 피쉬 배아 심장은 전체 배아의 작은 부분을 나타내는, 몇백 세포로 구성된다. 따라서, 글로벌 배아 사체에 의해 마스크되는 심장 사체를 방지하기 위해, 상기 분석 하트 충분한 수를 수집 할 필요가있다. 제브라 피쉬 심장 개발이 급속히 진행 더욱이, 심장 수집 및 RNA 추출 방법은 샘플의 균일 성을 확보하기 위해서는 신속한 있어야한다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아에서 기능 / 꺾고 마음을 수집하기위한 빠른 매뉴얼 해부 프로토콜을 제시한다. 이것은 전 사체 분석에서는 이들 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR에)와 같은 심장 특이 유전자 발현 수준을 결정하기 위해 후속 심장 특이 RNA 추출을위한 필수 조건이다. 방법은 다른 조직에 비해 제브라 피쉬 배아 심장의 접착 성 차이에 기초한다; 이것은 빠른 PHY 허용유체 전단력 중단, 단계적 여과 및 형질 전환 형광 표지 된 마음의 설명서 모음의 조합에 의해 심장 외 조직에서 심장의 이외에도 클래식 분리.

독점적으로 심근. (그림 1)에서 twu34 형질 전환 라인 (9), 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현한다 : 여기서 우리는 제브라 피쉬의 Tg (GFP myl7)를 사용하여 대표적인 심장 해부 실험을 설명합니다. 우리는 해부 하트 그들이 심장 시료의 순도를 평가하기 위해 유도 된 배아로부터 모두 모았다. 간단히, 동형 접합의 Tg (myl7 : GFP) twu34 제브라 피쉬 (9)는 모든 배아 마음이 GFP가 표시되도록되어 야생형과 outcrossed했다. 일부 500 배아 (56 HPF)를 1.5 ml의 튜브에 옮겼다 (약. 100 배아를 각) (그림. 1A1, 1B). 프로토콜 부분 (2 단계)과 그림 1A에 기술 된 바와 같이, 각각의 튜브 처리되었습니다. 마음이 아래로 여러 번 (그림. 1A2)를 피펫 팅에 의해 발표 후 100 μm의 필터 (그림. 1A3)에 적용되었다. ...

제브라 피쉬의 심장 개발하는 동안 심장 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해, 총 RNA는 고립 된 마음에서 추출해야합니다. 여기서 우리는 심장 별의 mRNA를 얻기 위해 제브라 피쉬 배아에서 빠른 설명서를 해부하여 기능 / 구타 마음을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

이 절차의 전반적인 목표는 심장 특이적 Mr.NA를 얻기 위해 살아있는 제브라피시 배아에서 신속한 수동 해부를 통해 심장을 수집하는 것입니다.이것은 먼저 피펫팅을 통해 좁은 피펫 팁을 통해 많은 마취된 배아를 위아래로 수행하여 배아체에서 심장을 동시에 방출함으로써 수행됩니다. 다음으로, 절개된 심장은 두 가지 빠른 여과 단계를 통해 배아 파편에서 분리됩니다. 그런 다음 형광으로 표지된 심장은 남은 파편에서 수동으로 분류됩니다.마지막으로, 수집된 심장에서 심장 특이적 RNA를 추출합니다. 궁극적으로 심장 박리 프로토콜은 전사체 분석을 수행하기에 충분한 양의 배아 심장을 수집하는 데 사용됩니다. 이 방법은 서로 다른 발달 단계에서 심장 내에서 어떤 전사체가 발현되는지와 같은 좀벌레 심장 발달 분야의 핵심 질문을 하는 데 도움이 될 것이며, 또한 야생 심장 발현과 돌연변이 심장 발현을 비교하기 위해 심장 추출을 위한 제브라피시 배아를 얻기 위해 실체 현미경 아래에서 형질전환 마일 7 EGFP와 같은 심장에서 형광 단백질을 발현하는 성체 형질전환 물고기를 교차시킵니다.배아의 발달을 모니터링합니다. 심장이 실제로 형광 라벨이 붙어 있는지 확인하고 배아가 원하는 단계에 도달했을 때 배아를 수동으로 코팅합니다. 약 100개의 배아를 1.5ml 퍼지 튜브로 옮기고 E 3 배지에 트리카 1밀리리터당 16밀리그램을 첨가하여 마취시킵니다.튜브를 얼음 위에 올려 놓습니다. 트리카 용액을 제거하고 1ml의 얼음처럼 차가운 L 15 10%FBS 배지를 사용하여 배아를 세척하고 얼음 위에 보관합니다. 이 세척을 제거한 후 L 15 FBS 1ml를 넣고 둥근 젤 로딩 팁을 사용하여 배아를 위아래로 5-8회 피펫팅하여 노른자를 완전히 파괴하고, 배아를 용액 표면에 적셔 적혀 방울이 터지고 배아가 부드럽게 파괴되도록 합니다.실체 현미경으로 절개된 배아의 첫 번째 배치에 대해 배아의 무결성과 절개된 심장의 비율을 평가하고 그에 따라 피펫팅 방식을 조정합니다. 후속 배치의 경우 100마이크로미터 필터를 50ml 원심분리기 튜브에 놓고 배아 샘플을 적용합니다. 그런 다음 L 15 FBS 1ml를 사용하여 fuge 튜브를 헹구고 용액을 필터에 적용하여 필터에 남아 있는 심장을 씻어냅니다.L 15 FBS를 사용하여 두 번 세탁하십시오. 다음으로, 30 마이크로미터 필터를 15 밀리미터 원심분리 튜브에 놓고 심장이 들어있는 흐름을 적용합니다. L 15 FBS를 사용하여 이 필터를 헹구면 심장을 유지하고 더 작은 파편을 씻어낼 수 있습니다.그런 다음 30마이크로미터 필터를 아그로스로 코팅된 페트리 접시 위에 거꾸로 뒤집고 L 15 FBS 매체를 1밀리리터로 세 번 세척하여 필터에서 심장을 씻어냅니다.형광 현미경으로 한 쌍의 집게를 사용하여 비형광 조직에서 GFP 양성 심장을 수동으로 분리하여 접시 중앙으로 집중시킵니다. 심장의 생리학은 박리 후에도 여전히 박동하고 있기 때문에 정상으로 보입니다. 절차. 심장에서 mRNA를 분리하려면 가능한 가장 작은 부피의 매체에 모아 0.75ml의 RNA가 들어 있는 얼음 위의 1.5ml 튜브에 피펫으로 넣습니다.나중에 형광 현미경 아래에서. 파이펫 팁을 보고 파이펫 팁에 심장이 끼어 있지 않은지 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 여러 차례의 격리에서 심장을 RNA 튜브로 끌어낸 후 텍스트 프로토콜에 따라 원심분리기의 샘플을 15, 700Gs 및 섭씨 4도에서 20분 동안 채취합니다.다음으로, 형광 현미경으로 가능한 한 많은 염료를 조심스럽게 수집하고 3 밀리리터의 L 15 10 % FBS 배지가 들어있는 1 % agros 코팅 된 페트리 접시로 옮깁니다. 다음으로, 화학 후드 아래에서 침전된 심장이 들어 있는 튜브에 0.5ml의 트리올을 넣고 얼음에 보관합니다.형광 현미경 아래에서 상등액에 남아 있는 심장을 L 15 10%FBS가 함유된 신선한 1%그로스 코팅 접시에 옮겨 나중에 매우 점성이 있는 RNA를 희석합니다. 그런 다음 심장을 작은 부피로 모아 트리올 형태로 침전된 심장 튜브에 옮겨 심장을 파괴하고 튜브를 와류로 만들고 실온에서 5분 동안 배양합니다.그런 다음 화학 후드 아래에 100 마이크로 리터의 클로로포름 혼합물을 철저히 첨가하고 용액을 1.5 밀리리터 PrepU, PLG 튜브로 실온에서 3 분 동안 배양하고 15 분, 700 Gs 및 섭씨 4도에서 샘플을 원심 분리 한 다음 수성상을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 5-10마이크로그램의 글리코겐과 250마이크로리터의 사전 냉각된 이소프로판올을 추가합니다. 잘 섞어 다음날 영하 20도에서 하룻밤 동안 배양합니다.샘플을 15, 700Gs 및 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리하고 스내팅을 버립니다. 75% 에탄올 1ml를 바르고 팔레트 원심분리기를 세척하고 스내트를 버립니다. 펠릿이 하얗게 될 때까지 실온에서 펠릿에서 남은 에탄올이 증발하도록 합니다.20마이크로리터의 RNA가 없는 이중 증류수를 펠릿에 추가하고 55도에서 10-15분 동안 배양하여 RNA를 용해합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정하고 1% agros gel에서 샘플을 실행하여 RNAA의 무결성을 평가합니다: 수정 후 56시간과 수정 후 36시간에 배아 파편에서 분류하기 전에 심장 샘플의 비교가 여기에 나와 있습니다.수정 후 56시간의 배아는 여과 후 수정 후 36시간보다 더 많은 배아 파편을 산출했습니다.56 HPF 심장 샘플의 순도를 결정하기 위해 심장 대 여분의 심장 전사체의 발현 수준을 R-T-Q-P-C-R로 비교했습니다. 이 겔은 분리된 심장과 심장이 없는 파괴된 배아에서 추출한 RNA를 보여줍니다. 흡광도 측정은 300개의 심장에서 약 660 나노그램 RNA를 산출하는 것으로 밝혀졌습니다.즉, 20마이크로리터의 최종 부피에서 마이크로리터당 33나노그램입니다. 상대적인 유전자 발현 수준은 여기에 표시된 마커에 대한 R-T-Q-P-C-R 실험에 의해 계산되었습니다. 예상대로, 7마일은 여기에서 볼 수 있듯이 심장 샘플이 없는 배아에 비해 심장 샘플이 매우 풍부했습니다.내피 세포 마커인 KDRL은 심장에서 적당히 풍부했습니다. 적혈구 마커인 헤모글로빈 베타 배아 1.1은 심장에서 적혈구를 배출해야 하는 박리 후에도 심장이 여전히 박동하고 있었음에도 불구하고 심장 샘플에서 과대 대표되었습니다. 수정체 마커 알파 A 결정질과 CNS 마커의 대비 수준에서, GFAP는 심장 샘플에서 상당히 감소했습니다.이러한 결과는 심장 박리 프로토콜이 전체 제브라피시 배아에서 고품질 심장 특이적 RNA를 생성한다는 것을 보여줍니다. 이 실험에서는 해부 절차 중 심장을 잃지 않도록 샘플을 모니터링하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여러 발달 단계에있는 zebrafish 심장의 해부 및 격리에 대한 명확하고 표준화된 방법 설명되어 있습니다. 주석과 부량 기법도 설명합니다.

애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio</em

zebrafish 배아 심장의 immunostaining를 수행하는 빠른 방법이 설명되어 있습니다. 전체 마운트 immunostaining 접근 방식에 비해,이 방법은 크게 크게 감소 처리 시간 이내에 심장에 세포 / subcellular 구조를 공개 고해상도 이미지를 얻는 수있는 항체의 침투를 증가시킵니다.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

이 비디오는 심장 발달, 성숙 및 노화를 연구하기 위해 여러 발달 단계에서 제브라피시로부터 심장을 분리하는 기술을 설명합니다.

심장 박리: 제브라피시 심장 발달을 관찰하는 방법

심혈관 연구를 위한 제브라피쉬의 사용은 성인 심장에 대한 연구로 확장되고 있습니다. 이러한 응용 분야의 경우, 심장 조직을 빠르고 간단하게 분리하는 것이 사후 변화를 피하고 적절한 수의 샘플을 얻는 데 중요합니다. 여기에서는 성체 제브라피시 심장을 빠르고 재현 가능한 방법으로 해부할 수 있습니다.

높은 처리량 응용 프로그램에 대한 성인 Zebrafish의 마음의 복구

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

여기, 선물이 시각화 4 차원 (4d)에서 zebrafish에 마음을 개발 하는 프로토콜. 빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)를 통해 4 차원 영상, 3 차원 (3 차원) 이미지 개발 마음을 재구성 하는 시간 걸립니다. 우리 그 전단 응력 활성화 endocardial 노치 신호 챔버 개발, 심장 trabeculation를 승진 시키는 동안 질적 및 양적 보여줍니다.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

이 프로토콜의 목적은 생리적 및 병리학적 조건 모두에서 배아 제브라피시의 분절 심장 기능 평가를 위한 새로운 방법을 자세히 설명하는 것입니다.

심근 기계 변형의 변위 분석 (DIAMOND) 배아 제브라피시에 있는 심장 기능의 분할 이질성을 제시합니다

우리는 빛 시트 형광 현미경 검사법과 생체 내 제브라피시 심장을 연구하는 최적화 된 도구를 설명합니다. 특히, 우리는 밝은 심장 형질 전환선을 제안하고 발달과 심장 결함을 피하는 새로운 부드러운 임베드 및 고정 기술을 제시합니다. 심장 이미징에 적응된 가능한 데이터 수집 및 분석 파이프라인도 제공됩니다.

얼룩말 물고기 배아에서 빠른 심장 역학의 빛 시트 현미경 검사

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아의 심장 형태 및 기능을 평가하기 위한 저비용 광학 현미경 방법을 설명하여 고급 이미징 시스템 없이도 발달 심장 독성을 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

표준 현미경 및 비디오 분석을 사용한 제브라피쉬 배아의 기능적 심장 영상: 환경 및 생물 의학 연구에서의 응용

이 연구는 개별 제브라피시 배아 심장에서 전 세계 DNA 메틸화를 정량화하기 위한 민감한 면역형광 기반 영상 방법을 확립합니다. 이 방법은 제한된 조직 물질의 문제를 극복하고 비아황산염 변환의 필요성을 우회합니다.

제브라피시 유충 심장에서 전 지구적 DNA 메틸화 검출

배우세요 제브라피시 배아 심장의 신속한 수동 해부법을 통해 심장 특이적 RNA를 추출하고 전사체 분석을 수행하는 방법을. 이 기술은 심장 발달 유전학 연구에 활용됩니다.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

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