펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

이 절차의 전반적인 목표는 두 단백질 또는 단백질 도메인 간의 상호 작용을 매핑하는 것입니다. 이 경우, 암 관련 단백질 도메인 스틸과 CHFR을 연구합니다. 이 절차의 전반적인 목표는 두 단백질 또는 단백질 도메인 간의 상호 작용을 매핑하는 것입니다.

이 경우, 암 관련 단백질 도메인 스틸과 CHFR을 연구합니다. 두 번째 단계는 CHFR 펩타이드 어레이를 결합 파트너인 스틸 단백질과 함께 배양하는 것입니다. 다음으로, 어레이를 세척하고 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 접합 항체로 배양합니다.

그런 다음 어레이는 결합을 감지하기 위해 화학 발광 감지를 받습니다. 마지막 단계는 결과를 분석하고 단백질 사이의 결합 부위를 식별하는 것입니다. 이 연구는 통제되지 않은 상호 작용이 암 발병으로 이어질 수 있는 여전히 CHFR 결합의 합리적인 억제제를 설계하기 위한 길을 열었습니다.

이 방법은 단백질 상호 작용 연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 명상하는 특정 영역은 무엇입니까 두 단백질 간의 상호 작용, 표적 단백질의 염기서열을 10-20개의 잔류 펩타이드로 나눕니다. 부분적으로 겹칩니다. 겹치는 정도는 다양할 수 있지만 원칙적으로 겹치는 부분이 길수록 좋습니다.

펩타이드를 설계할 때 상호 작용을 담당할 수 있는 단백질의 알려진 2차 구조 요소를 고려합니다. 설계된 펩타이드 어레이는 상용 공급업체를 통해 주문할 수 있습니다. 이 실험에서는 CHFR 도메인 잔기 4 24 - 6 62의 펩타이드가 C 말단을 통해 어레이에 공유 결합됩니다.

설계된 어레이를 받은 후, 비특이적 결합을 방지하기 위해 먼저 차단하여 실험을 준비합니다. 부피당 2.5%중량의 차단 용액을 만드십시오. 0.05%Tween 20 또는 TBST를 함유한 트리스 완충 용액에 분유를 탈지하여 비특이적 결합을 방지합니다.

어레이를 5ml의 차단 용액에 담그십시오. 어레이를 실온에서 2-4시간 동안 또는 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 먼저 5ml의 차단 용액으로 어레이를 30초 동안 세척합니다.

그런 다음 TBST 5ml로 어레이를 실온의 셰이커에서 5분 동안 두 번 세척합니다. 다음으로, 세척된 어레이를 부피당 2.5%중량을 함유하는 5ml의 폴리 히스티딘 태그가 지정된 단백질 용액으로 배양합니다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 분유를 탈지합니다.

여기서, 정지 단백질 잔기(500 내지 650)의 4.5 마이크로몰 용액이 사용된다. 그런 다음 단백질 용액에 어레이를 실온에서 3-8시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 단백질 용액에서 배양 후.

TBST 5ml로 어레이를 실온의 셰이커에서 30초 동안 세척한 다음 5분 동안 두 번 더 세척합니다. 이제 실온에서 셰이커에서 1 시간 동안 차단 용액과 동일한 농도로 동일한 성분을 포함하는 배양 버퍼에 희석 된 무 과산화 효소 접합 항체 5 밀리리터로 세척 된 어레이를 배양하고, 항체는 표적 단백질 또는 태그를 결합하고, 대조 실험을 수행하고, 별도의 어레이에서 동일한 프로토콜을 반복하여 어레이에서 펩타이드와 항체의 상호 작용을 테스트 할 수 있습니다 어레이를 읽기 전에 단백질과 함께 배양하지 않고 미끄러집니다. 이전과 같이 TBST 5ml로 씻으십시오.

향상된 화학발광 웨스턴 블로팅 기판 키트로 화학발광 개발을 수행하십시오. Fuji 필름 LAS 3000 카메라와 같은 발광 이미지 분석기를 사용하여 검출을 수행합니다. 결과를 분석하고, 결과의 신뢰성을 위해 배열의 두 중복 항목이 동일한 신호를 나타내는지 확인합니다.

단백질 파트너의 구조를 알고 있는 경우, 결합 펩타이드의 구조를 검색하고 결합 부위를 찾습니다. 염기서열에서 멀리 떨어진 펩타이드는 3차 구조에서 함께 존재할 수 있으며 결합 부위를 생성할 수 있다는 점을 명심하십시오. 이 예에서 여전히 정상적인 세포 분열과 세포 증식을 조절하는 매우 중요한 Centro Somal 단백질은 본질적으로 무질서한 영역을 통해 여러 단백질과 상호 작용합니다.

설계된 펩타이드 어레이를 사용하여 종양 억제 인자 CHFR의 여전히 결합 부위를 밝혔습니다. 배열에 있는 각 검은 점은 각 펩티드가 중복으로 존재하기 때문에 아직도 두번 나타난다는 것을 주의하기 위하여 바운드하는 A-C-H-F-R 유래한 펩티드를 대표한다, 이는 결과의 신뢰성을 검증한다. 펩타이드 어레이 스크리닝은 여전히 본질적으로 무질서한 영역 잔기 500 내지 6 50에 결합하는 7개의 CHFR 유래 펩타이드를 밝혔습니다.

이러한 결과를 통해 CHFR에서 증류기의 결합 부위를 매핑할 수 있었습니다. CHFR 1차 염기서열에서 이 7가지 펩타이드의 거리에도 불구하고. 그들은 CHFR 3차 구조에서 여전히 잘 정의된 결합 부위를 생성합니다.

이 방법은 이 절차에 따라 모든 단백질 단백질 상호 작용을 특성화하는 데 적용할 수 있습니다. 형광 및 동위원소 또는 ITC와 같은 정량적 방법을 사용하여 펩타이드 도입을 정량화하기