Name: 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 펩타이드 배열 기법을 활용한 단백질-단백질 상호작용 부위 매핑 방법을. still과 CHFR 단백질의 결합 부위를 식별하여 암 치료 표적 발굴에 활용할 수 있습니다.

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AF는 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램에서 유럽 연구위원회에서 시작 기금에 의해 지원되었다 (FP7 / 2007-2013) / ERC 부여 계약 N 203413을 ° 복잡한 systems.HA 바이오 하이브리드 및 AI에 대한 미네르바 센터가 지원됩니다 예루살렘의 히브리 대학에서 고급 학위 학생을위한 달리아 댄 Maydan 원정대에 의해.

1. 펩타이드 어레이 설계 <ol><li> 부분적으로 10 ~ 20 잔기 펩티드 겹치는에 표적 단백질의 서열을 나눈다. 특정 실험에 오버랩 량과 행하는 실험실 자원 있지만 원칙적 긴 오버랩을 더 다양하다. 펩타이드의 상호 작용에 대한 책임을 질 수있는 단백질 계정 알려진 이차 구조 요소를 고려 설계 할 때. </li><li> 상업 업체를 통해 설계 펩타이드 배열을 주문. 여기서, 사용 펩티드 공유 C 말단을 통해 어레이에 결합. </li></ol> 바인딩 2. 차단 비 특정 <ol><li> 0.05 % 트윈 -20 (TBST / PBST)를 함유하는 50mM 트리스 또는 포스페이트 완충액을 확인하고 (정확한 이온 강도를 알기 위해)의 HCl 또는 NaOH를 측정 된 양 및 NaCl을 사용하여 원하는 이온 강도와 원하는 pH로 조정 . 여기에서, 7.5의 pH 및 150 mm의 이온 세기를 사용한다. </li><li> 의 블로킹 용액을 만들기2.5 %는 (W / v)의 TBST / PBST에서 탈지유 분말. </li><li> 비특이적 결합을 방지하기 위해, 차단 용액 5ml에 배열 몰입. 2-4 상온에서 시간 또는 하룻​​밤 진탕 4 ºC에서의 배열을 품어. </li></ol> 3. 단백질과 배양 <ol><li> 실온에서 진탕 기에서 5 분 동안 5 ㎖를 TBST / PBST 회 30 초 동안 차단 용액과 5 ml의 제 배열을 씻는다. </li><li> (v가 ​​/ w) 비특이적 결합을 방지하기 탈지유 분말 2.5 %를 함유하는 그의 태그 된 단백질 용액 5 ㎖로 세척하고 어레이를 부화. 여기서, 설명 블로킹 용액에 용해 된 단백질 용액의 4.5 μM (STIL 500-650)을 사용한다. NOTE : 보통 5-10 μM 단백질은 선별을 위해 사용되지만, 단백질 농도는 결합 친화력과의 로컬 어레이에 결합 된 펩타이드의 농도 (효율에 따라, 심지어 낮은 2-3 μM 일 수있다 합성). 버퍼있는 단백질다양 할 수 있지만, 상술 한 용해 같은 차단 용액을 사용하여 단백질을 희석하는 것이 일반적이다. </li><li> 실온에서 밤새 또는 4 ºC에서 3-8 시간 동안 단백질 용액을 인큐베이션 어레이. </li></ol> 4. 항체와 함께 배양 <ol><li> 5 ml의 TBST / PBST로 배열을 세 번 씻으십시오. 처음 세탁은 실온에서 진탕에 두 5 분 세척 한 다음 30 초입니다. </li><li> 실온에서 쉐이커상에서 1 시간 동안 블로킹 용액과 동일한 농도에서 동일한 성분을 함유 배양 완충액 : 희석 된 HRP 컨쥬 게이트 된 항체 5 ㎖ (1500 1)로 세정 배열 부화. 항체는 표적 단백질 또는 태그 중 하나를 결합 할 수있다. </li><li> 인트없이 동일한 프로토콜을 반복함으로써 배열 표적 단백질 (예를 들어, 올리고머 화를위한 연구)로부터 펩티드를 포함 특히 어레이 펩타이드 항체의 상호 작용을 시험 대조 실험을 수행P (3), 단백질과 인큐베이션. </li><li> 5 ml의 TBST / PBST로 배열을 세 번 씻으십시오. 처음 세탁은 실온에서 진탕에 두 5 분 세척 한 다음 30 초입니다. </li></ol> 5. 배열을 읽기 <ol><li> ECL 웨스턴 블로 팅 기판 키트와 함께 발광 개발을 수행하십시오. </li><li> 발광 이미지 분석기로 검출을 수행. </li><li> 결과를 분석합니다. 어레이의 두 중복이 같은 신호를 보여, 그래서 결과를 신뢰할 수 있는지 확인합니다. 파트너 단백질의 구조가 알려지면, 결합 펩티드 구조에서 검색하고 결합 부위를 찾는다. 순서에 멀리있다하더라도 펩타이드는 차 구조에 가깝게하고 구속력있는 사이트를 만들 수 있습니다. </li></ol>

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펩타이드 어레이 스크리닝 파트너에서 표적 단백질의 결합 부위를 식별하기위한 훌륭한 도구이다. 상기 분석을 수행하기 쉽고 빠르게 결과는 하나 또는 두 개의 일 얻을 수있다. 펩타이드 어레이 스크리닝 다재다능 많은 목적을 위해 사용될 수있다. 그것은 예컨대 인산화와 같은 번역 후 변형을 특성화하고 키나제의 기판을 식별하는데 사용될 수있다. 예 : 급성 골수성 백혈병 관련이 FLT3 키나제, 펩티드 배열 (6) 스크리닝에 의해 발견 티르 - 함유 기질 펩티드를 인산화. 티로신 키나제 억제제의 파 조파 닙과 라파티닙의 억제 특성은 23 스크리닝 펩타이드 어레이를 사용하여 테스트 하였다. 펩티드 배열은 단백질 - 단백질 상호 작용을 중개 사이트를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 방법을 사용하여 우리의 실험실에서 연구 단백질의 예는 다음과 같습니다 HIV-1 VIF 단백질 및 세포 A3G 단백질 사이의 상호 작용이 우리를 특징으로했다펩타이드 어레이 (24)를 보내고; 펩타이드 ...

단백질 - 단백질 상호 작용은 살아있는 세포에서의 처리의 대부분을 매개한다. 장애인 단백질 상호 작용은 단백질 상호 작용에게 중요한 약물 표적을, 질병의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 분자 레벨에서의 이러한 상호 작용을 이해하는 것이 매우 중요하다. 단백질 상호 작용은 세포의 생화학 적 분석에서 양적 생물 리 학적 분석법에 이르는 다양한 기술을 이용하여 연구하고 있으며, 이들 도메인은 단백질 또는 펩타이드와, 전체 길이 단백질과 중 수행 될 수있다. 펩타이드는 단백질 상호 작용을 연구하는 우수한 도구를 제공합니다. 펩티드는 쉽게 합성 한 손과 반면 1,2에 고 스루풋 방식으로 다수의 표적 단백질에 특이 적 상호 작용 부위에 초점을 허용 할 수 있기 때문이다. 펩타이드 어레이 스크리닝은 빠르고, 단시간 (3)에 다수의 파트너와 표적 단백질의 상호 작용에 관한 많은 양의 데이터를 획득하기위한 방법을 수행하기 쉬운. 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 분석하기위한 다른 생화학 또는 생물 물리학 적 방법과 달리, 펩티드 배열 선별은 단백질의 매우 낮은 농도를 필요로하며, 매우 약한 결합 검출 할 수있다. 펩타이드 배열이 효소의 활동 (6)과 높은 처리량을 연구, 단백질 - 단백질 또는 수용체 - 리간드 상호 작용 사이트 4, 동종 또는 이종 올리고머 인터페이스의 매핑과 같은 펩타이드 - 단백질 상호 작용에 많은 응용 프로그램의 특성 항체를 5 항원 사용할 수있는 구조 - 활동 관계 (SAR)는 7 연구. 펩타이드 배열 검사에 대한 심도있는 검토를 위해 카츠 등을 참조하십시오. 4 펩타이드 어레이의 여러 유형 현재 존재한다. 펩타이드의 합성을 주로 SPOT 기법 4,8를 사용하여, 직접 고체 지지체에 펩티드의 고체 지지체, 또는 합성을 부착하기 전에 : 펩타이드 어레이를 만들기위한 두 가지 주요 합성 전략이있다.펩티드는 9- 플루 오레 닐 옥시 카보 닐 (Fmoc) 화학 (8)에 의해 일반적으로 고체 지지체 상에 합성된다. 일반적인 합성 기법 중 C 말단을 통해 펩타이드 N 말단을 통해 첨부 파일 (예를 들어, JPT의 pepstar 배열 9) 및 펩타이드 첨부 파일은 (예를 들어, PEPSCAN의 pepchip 어레이 (10), JPT의 pepspot 배열 9 INTAVIS의 celluspot 어레이 (11)) 4. 고체 지지체는 다양하며, 그래서 그것에 펩타이드 결합의 화학적 성질을 수행 할 수 있습니다. Cys 또는 말단 펩티드는 티올 기 (12)를 통해 유리 슬라이드에 부착 될 수있다. 펩티드의 N 말단이 공유 결합 된 아미노산의 에스테르 화를 통해 셀룰로오스 막에 수산기에 결합 될 수있는 8 첨부. 여기서 우리는 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하기위한 방법으로 펩타이드 어레이 스크리닝 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리가 사용하는 배열은 큰 AMO를 포함하는 마이크로 어레이 인 Celluspots 배열입니다유리 슬라이드에서 지원하는 작은 셀룰로오스 막에 점 (384 점 중복)의 UNT. 이 낮은 단백질의 볼륨과 항체 작업과 하나의 실험 당 데이터의 상당한 양을 획득 할 수 있습니다. 이 배열은 또한 바인딩 선호도가 낮은 검출 할 수 있습니다 높은 펩타이드 밀도가 포함되어 있습니다. 어레이는 정상 세포 증식 (13)을 제어하기에 매우 중요하다 STIL-CHFR 상호 작용을 매핑하기 위해 사용되었다. 두 단백질 사이의 상호 작용은 제어되지 않은 암의 발생을 초래할 수있다. 이 상호 작용을 매핑하여 우리는 특정 결합 부위와 잔여 14 바인딩을 발견했다. 이것은이 단백질 - 단백질 상호 작용을 억제하는 억제제 합리적 설계를위한 길을 열어.

<table><tbody><tr><td>펩타이드 어레이</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-probe 항체 (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Biological industries</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 camera&nbsp;</td><td>후지 필름</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

단백질 - 단백질 상호 작용은 유기체의 살아있는 세포의 항상성 및 제어 공정의 대부분을 매개한다. 장애인 단백질 상호 작용은 단백질 상호 작용에게 중요한 약물 표적을, 질병의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 분자 레벨에서의 이러한 상호 작용을 이해하는 것이 매우 중요하다. 단백질 상호 작용은 세포의 생화학 적 분석에서 양적 생물 리 학적 분석법에 이르는 다양한 기술을 이용하여 연구하고 있으며, 이들 도메인은 단백질 또는 펩타이드와, 전체 길이 단백질과 중 수행 될 수있다. 펩타이드는 펩타이드가 용이하게 합성 할 수 있기 때문에 단백질의 상호 작용을 연구하고, 특정 상호 작용 사이트에 집중 할 수 있도록 우수한 도구를 제공합니다. 펩타이드 어레이는 치료 목적 표적 단백질에 결합 펩티드 두 단백질 사이의 상호 작용 위치의 식별뿐만 아니라 스크리닝을 가능하게한다. 그들은 또한 높은 처리량 SAR 연구를 할 수 있습니다. 결합 부위, typi의 식별을위한학적 펩타이드 어레이는 일반적으로 부분적으로 원하는 타겟 단백질의 하나 또는 그 이상의 파트너 단백질의 전체 서열로부터 유도 된 10 내지 20 잔기 펩티드 겹치는 포함. 표적 단백질을 바인딩 어레이 스크리닝 단백질 만 소량 사용 쉽고 빠른 방법에서 파트너 단백질의 결합 부위에 대응하는, 펩티드 결합을 보여준다. 이 문서에서 우리는 목적 단백질과 파트너 사이의 상호 작용 사이트를 매핑하는 펩타이드 배열을 선별하기위한 프로토콜을 설명합니다. 펩티드 배열은 고려 그들의 이차 구조를 고려 파트너 단백질의 서열에 기초하여 설계된다. 이 프로토콜에 사용되는 배열은 INTAVIS 바이오 어낼 리티 컬 인스트루먼트 준비 Celluspots 배열했다. 이 배열은 바인딩 불특정 한 후 연구 단백질 배양 방지하기 위해 차단됩니다. 항체를 이용하여 검출 단백질 간의 특이 적 상호 작용 부위에 대응하는 펩타이드 결합을 보여준다.

STIL은 매우 중요 centrosomal 단백질이다. 19 - 그것은 정상적인 세포 분열 및 세포 증식을 13, 15를 제어합니다. STIL 여러 단백질 18,20,21과 상호 작용하고 상호 작용의 대부분은 본질적으로 무질서 지역 (IDR) (14) 자사의 중앙 부분을 통해 발생합니다. 우리는 STIL 결합 단백질 CHFR에서 유래 펩타이드로 구성된 배열을 설계했습니다. CHFR 스트레스 22 유사 분열에 응답하여 유도되는 종양 억제이다. CHFR의 STIL 결합 도메인의 구조가 시간에 알려지지 않았다 때문에 프로토콜의 단계 1.1에 기재된 바와 같이, 우리는 7 잔기의 오버랩으로 15 잔기 긴 펩티드 단백질 도메인을 분할. 전술 한 프로토콜에 설명하고도 1에 도시 된 바와 같이 우리는 CHFR-STIL 결합 부위를 식별하기위한 스크리닝 펩티드 배열을 수행. 우리를 제공 할 수 중복 384 펩티드 ...

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

이 절차의 전반적인 목표는 두 단백질 또는 단백질 도메인 간의 상호 작용을 매핑하는 것입니다. 이 경우, 암 관련 단백질 도메인 스틸과 CHFR을 연구합니다. 이 절차의 전반적인 목표는 두 단백질 또는 단백질 도메인 간의 상호 작용을 매핑하는 것입니다.이 경우, 암 관련 단백질 도메인 스틸과 CHFR을 연구합니다. 두 번째 단계는 CHFR 펩타이드 어레이를 결합 파트너인 스틸 단백질과 함께 배양하는 것입니다. 다음으로, 어레이를 세척하고 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 접합 항체로 배양합니다.그런 다음 어레이는 결합을 감지하기 위해 화학 발광 감지를 받습니다. 마지막 단계는 결과를 분석하고 단백질 사이의 결합 부위를 식별하는 것입니다. 이 연구는 통제되지 않은 상호 작용이 암 발병으로 이어질 수 있는 여전히 CHFR 결합의 합리적인 억제제를 설계하기 위한 길을 열었습니다.이 방법은 단백질 상호 작용 연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 명상하는 특정 영역은 무엇입니까 두 단백질 간의 상호 작용, 표적 단백질의 염기서열을 10-20개의 잔류 펩타이드로 나눕니다. 부분적으로 겹칩니다. 겹치는 정도는 다양할 수 있지만 원칙적으로 겹치는 부분이 길수록 좋습니다.펩타이드를 설계할 때 상호 작용을 담당할 수 있는 단백질의 알려진 2차 구조 요소를 고려합니다. 설계된 펩타이드 어레이는 상용 공급업체를 통해 주문할 수 있습니다. 이 실험에서는 CHFR 도메인 잔기 4 24 - 6 62의 펩타이드가 C 말단을 통해 어레이에 공유 결합됩니다.설계된 어레이를 받은 후, 비특이적 결합을 방지하기 위해 먼저 차단하여 실험을 준비합니다. 부피당 2.5%중량의 차단 용액을 만드십시오. 0.05%Tween 20 또는 TBST를 함유한 트리스 완충 용액에 분유를 탈지하여 비특이적 결합을 방지합니다.어레이를 5ml의 차단 용액에 담그십시오. 어레이를 실온에서 2-4시간 동안 또는 셰이커에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 먼저 5ml의 차단 용액으로 어레이를 30초 동안 세척합니다.그런 다음 TBST 5ml로 어레이를 실온의 셰이커에서 5분 동안 두 번 세척합니다. 다음으로, 세척된 어레이를 부피당 2.5%중량을 함유하는 5ml의 폴리 히스티딘 태그가 지정된 단백질 용액으로 배양합니다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 분유를 탈지합니다.여기서, 정지 단백질 잔기(500 내지 650)의 4.5 마이크로몰 용액이 사

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

이 동영상은 비오틴화된 세포 침투 펩타이드를 사용하여 세포 내 단백질-단백질 상호 작용을 감지하는 기술을 보여줍니다. 세포 침투 펩타이드는 접합 펩타이드가 세포에 들어가 상호 작용하는 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 용이하게 합니다. 비오틴은 아비딘(avidin)에 결합한 후 세포 용해물에서 상호 작용하는 단백질 복합체를 정제할 수 있습니다.

단백질과 단백질의 상호작용을 검출하기 위한 Biotinylated Cell-Penetrating Peptide 프로브

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

SPOT 방법으로 합성된 펩타이드 어레이는 단백질 라이신 메틸전이효소(PKMT)의 기질 특이성을 분석하고 PKMT의 기질 스펙트럼을 정의하여 생물학적 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 펩타이드 어레이를 합성하고, PKMT로 메틸화하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

배우세요 펩타이드 배열 기법을 활용한 단백질-단백질 상호작용 부위 매핑 방법을. still과 CHFR 단백질의 결합 부위를 식별하여 암 치료 표적 발굴에 활용할 수 있습니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

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