불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

이 절차의 전반적인 목표는 낭포성 섬유증 가래와 같은 복잡한 숙주 관련 샘플을 수집 및 처리하여 메타유전체학(metatagenomic) 및 메타전사체(meta transcriptomic) 접근법을 사용하여 바이러스 및 미생물 군집을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 피험자가 분무기를 통해 7%의 고긴장 식염수를 흡입하게 한 다음 30분 동안 유도된 가래 샘플을 수집함으로써 수행됩니다. 다음으로, 샘플은 즉시 균질화되어 바이러스 메타게놈, 미생물 메타게놈, 메타 전사체 및 여분의 객담으로 분류된 4개의 튜브에 균등하게 분포합니다.

다음으로, 메타 전사체 튜브를 밀봉하고 수평으로 놓고 가래를 10분 동안 중간 속도로 균질화합니다. 마지막으로, 개별 부분 표본은 메타유전체학(metagenomic) 연구를 위해 핵산을 분리하기 전에 바이러스 또는 박테리아 세포를 분리 및 정제하기 위해 별도로 처리됩니다. 궁극적으로, 분리된 핵산은 메타유전체학(metagenomics) 및 메타 전사체학(meta transcriptomics) 라이브러리를 생성하기 위한 고처리량 염기서열분석 라이브러리 준비에 사용됩니다.

이 절차의 주요 장점은 DNA 및 RNA 수준에서 바이러스 및 박테리아 군집 연구를 위해 복잡한 숙주 관련 샘플을 처리할 수 있는 포괄적인 워크플로우를 제공한다는 것입니다. 바이러스 및 미생물 세포 정제 단계를 배우기 어려운 동안 샘플의 적절한 취급을 보장하기 위해 샘플 전처리 단계가 중요하기 때문에 이 절차의 시각적 시연이 중요합니다.샘플이 수집되기 전에 샘플당 4개의 15ml 튜브에 다음과 같이 라벨을 부착하며, 첫 번째는 바이러스 메타게놈으로 표시합니다. 두 번째는 메타 전사체를 가진 미생물 메타게놈 3번과 여분의 가래 튜브 4번입니다. 메타 트랜스크립톰이라고 표시된 튜브에 0.1mm 실리카 비드 2ml를 추가한 다음 기인 이소티오시아네이트 기반 RNA 용해 완충액 또는 GITC 용해 완충액 6ml를 추가합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 샘플 수집 절차에 따라 pre wade 샘플 컵을 사용하여 샘플 수집 후 컵의 무게를 측정하여 샘플 부피를 추정하고 빈 컵의 무게를 뺍니다. 나머지 무게의 경우 1g은 샘플 1ml에 해당합니다. 샘플의 부피가 8 밀리리터 미만인 경우 0.02 마이크로미터 여과 1 XPBS의 적절한 부피를 추가하여 최종 부피를 최대 8 밀리리터로 가져옵니다.

그런 다음 즉시 3ml 주사기를 사용하여 동일한 주사기를 사용하여 객담 내에 눈에 보이는 덩어리가 남지 않을 때까지 샘플을 균질화한 다음 즉시 2ml의 가래를 추출하여 실리카 비드와 GITC 용해 완충액이 들어 있는 마이크로 전사체 튜브에 주입합니다. 뚜껑을 닫고 파라 필름을 사용하여 뚜껑을 단단히 밀봉하십시오 누출을 방지하려면 와류를 사용하십시오. 동일한 주사기 분취액을 사용하여 각각 2ml의 가래를 vira metagenome 및 microbial metagenome이라고 표시된 튜브에 넣고 가래 컵에 남은 가래를 extra sputum이라고 표시된 튜브로 옮깁니다.

모든 튜브를 섭씨 4도 또는 얼음 위에 보관하고 필요한 경우 실험실로 운반하여 바이러스 메타게놈을 생성합니다. 완충액 및 용액 준비 후. 총 부피 6ml에 0.02마이크로미터의 여과된 식염수 마그네슘 완충액을 추가하여 샘플을 전처리합니다.

점액 용해를 돕기 위해 각 샘플에 6.5밀리몰의 DTT 6ml를 첨가합니다. Vortex는 섭씨 37도에서 1시간 동안 혼합하고 배양합니다. 샘플을 격렬하게 소용돌이친 후 다시 3056Gs와 섭씨 10도에서 15-20분 동안 회전합니다.

각 상등액을 새로운 15ml 튜브에 모읍니다. 다음으로, 주사기에 장착된 포인트 45마이크로미터 필터를 사용하여 상층액을 새로운 15ml 튜브로 여과합니다. 100마이크로리터의 샘플을 마이크로 퍼지 튜브에 넣은 다음 클로로포름 처리를 수행합니다.

상층액을 추출하고 DN one 시술을 실시합니다. 샘플을 고정하기 위해 동일한 부피의 포름 알데히드 4 % 파라를 첨가하십시오. epi 형광 현미경 검사의 경우, catch-all 바이러스 입자 농축 접근법에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

그렇지 않으면 갓 준비된 염화세슘 용액을 사용하여 각 튜브에 1밀리리터당 1.7그램의 염화세슘 용액을 1밀리리터씩 로드한 다음 밀리리터당 1.5그램의 1밀리리터, 1밀리리터당 35그램의 1밀리리터, 마지막으로 1밀리리터당 1.2그램의 염화세슘 용액 1밀리리터를 로드하여 염화세슘 구배를 설정합니다. 마지막으로, 6-8 밀리리터의 샘플을 개별 그래디언트 튜브에 로드합니다. 각 분수의 위치를 나타내기 위해 개별 레이어를 표시합니다.

그런 다음 서로 반대되는 2쌍을 1mg 이내로 균형을 맞춥니다. 각 튜브를 스핀 버킷에 조심스럽게 잠급니다. 로터와 원심분리기에 82, 844Gs 및 섭씨 4도에서 2시간 동안 로드합니다.

원심분리 후 3ml 주사기에 부착된 18게이지 바늘로 밀도 구배를 방해하지 않고 홀더에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 바늘의 열린 끝이 위를 향하도록 합니다. 밀리리터당 1.5g 밀도 층 바로 아래에 튜브를 뚫고 약 1.5ml의 용액을 주사기로 천천히 끌어들입니다.

바늘을 천천히 제거하고 튜브에 남아 있는 조각이 구멍을 통해 새 15ml 튜브로 떨어지도록 합니다. 이것을 상부 분수 허리로 표시하십시오.V ps가 포함된 주사기의 용액을 두 개의 새로운 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다. 완충액과 용액이 준비되면 텍스트 프로토콜에 따라 포인트 22 마이크로미터 여과 1 XPBS의 5 부피를 첨가하여 화학 후드 아래에서 각 균질액을 희석하고 베타 MAR 캡타 에탄올을 부피 최종 농도의 2 % 부피로 첨가하고 배양 후 2 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔듭니다.

3056GS 및 섭씨 10도에서 15분 동안 샘플을 회전시킵니다. 상등액을 버린 후 10ml의 분자 등급 물을 사용하여 펠릿을 재현탁시키고 실온에서 15분 동안 배양한 후 세척을 반복합니다. 마지막 회전 후 SUP natin이 폐기되면 15마이크로리터의 ds를 추가하기 전에 5ml의 XDNA 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.

시료 1ml당 1개: 섭씨 37도에서 2시간 동안 반복해서 혼합하여 배양합니다. 샘플을 회전시키고 스내트를 버린 후 10ml의 SE 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 회전시키고 세척을 반복합니다.

2ml의 SE 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁하고 현탁액을 두 개의 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 16, 000 GS에서 실온에서 15 분 동안 튜브를 회전시킵니다. 마지막으로, 상층액을 제거한 후 그람 양성 박테리아에 대한 지침에 따라 게놈 DNA 추출 키트를 사용합니다.

DNA를 분리하기 위해 바이러스 메타게놈을 생성하기 위한 이전 결과를 요약하면 다음과 같습니다. viromes는 인간 유래 염기서열을 거의 포함하지 않으며, 밀도 구배 초원심분리 단계에서 CCF 4 A가 생략된 70%의 인간 DNA 샘플을 포함하는 샘플이 하나뿐이며, 그 결과 97% 이상의 인간 유래 염기서열을 포함했습니다. 이 그림은 밀도 구배 초원심분리 전후의 일반적인 CF 객담 샘플의 형광 이미지를 보여줍니다.

여기에서 볼 수 있는 밀도 구배 분리에 따라 큰 입자가 없는 경우 명확한 vlp가 관찰되었습니다. 경구용 항생제를 투여하기 시작한 낭포성 섬유증 환자 한 명으로부터 매일 7개의 가래 샘플을 채취했습니다. 채취 3일차 후, 각 샘플에서 수집된 하이토닉 용해 유래 또는 HL DNA의 총 수율은 각 샘플에 대해 생성된 Illumina 염기서열분석 라이브러리에서 210나노그램에서 5마이크로그램 이상까지 다양했습니다.

하나의 라이브러리를 제외한 모든 라이브러리에서 100만 개 이상의 염기서열이 생성되었으며 데이터 사전 처리 시 85% 이상의 고품질 염기서열이 유지되었습니다. print seq 소프트웨어를 사용하여 인간 유래 염기서열의 총량은 14%에서 46%까지 다양했습니다.여기에 표시된 바와 같이, 하위 샘플의 미생물 프로필은 두 번의 저장성 용해 처리 후의 샘플과 매우 유사합니다. 또한, 두 번째 저장성 용해는 메타게놈 내에서 인간이 아닌 염기서열의 비율을 6-17% 증가시킵니다.

임상 샘플 및 잠재적인 병원체를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 개인 보호 장비는 시료 취급 중 항상 사용해야 합니다. 오염이 없는지 확인하기 위해 이 절차를 수행하는 동안 우수한 분자 생물학 및 미생물학 기술이 필요합니다.

이 절차를 따르면 바이러스 및 미생물 메타유전체학뿐만 아니라 CF 가래와 같은 복잡한 샘플에서 메타 전사체 연구를 수행할 수 있어야 합니다.