Name: 불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 배우세요 낭포성 섬유증 환자의 가래 샘플에서 바이러스와 미생물 군집을 연구하는 메타게놈 및 메타트랜스크립톰 분석 방법을. 이 워크플로우는 복잡한 숙주 관련 샘플 처리에 필수적입니다.

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이 작품은 숲 Rohwer에게 수여 국립 보건 연구소 (1 R01 GM095384-01)에 의해 지원되었다. 우리는 리보 제로 역학 키트 조기 액세스를 제공하기위한 Epicentre, Illumina의 회사를 감사합니다. 우리는 초 원심 튜브 홀더의 설계 및 생산에 대한 마크 하타 감사합니다. 우리는 촬영 과정을 지원을위한 중요한 판독하고 원고의 토론 안드레아스 하스와 베냐민 놀즈 감사, 로렌 폴.

저자는 공개할 것이 없습니다.

바이러스 성 메타 지노믹스 바이러스 입자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 석출이나 소량 농축기를 이용하여 농축된다. 일부의 경우, 농도는 필요하지 않을 수도 있지만, 미리 여과 또는 저속 원심 분리 단계가 진핵 미생물 세포를 제거하는데 사용된다. 바이러스 성 용 해물을 더욱 풍부하고 밀도 구배 초 원심 9,41 또는 작은 크기의 필터 (예를 들면 0.45 μm의)가 진핵 미생물 및 대형 셀 (25)을 제거하기 위해.하여 정제 될 밀도 구배 초 원심 분리는 일반적으로 바이러스 성 입자 (41)를 집중 수크로오스 또는 세슘 클로라이드와 같은 조밀하지만 불활성 해법 행한다. 물리적 분리는 바이러스 입자 크기와 밀도의 부력에 기초한다. 따라서, 필터의 기공 크기를 적절히 선택과 구배 엄격한 제제의 물리적 회복 성공으로, 특정 바이러스 커뮤니티를 분리하는 데 필수적인VLP를 41 (추출 밀도 내에서 필터 또는 가을에 통과하지 않는 즉, 바이러스 입자 metagenome에서 검출되지 않습니다)을 고립 지역 사회를 결정합니다. 바이러스의 분리 및 농축 후에, 무료 핵산 미생물 및 진핵 세포의 형태 모두 샘플 비 바이러스 게놈 물질 본 오염이있을 수있다. 따라서 시료에서 바이러스 입자의 순도 (도 1a 및도 1b)을 확인하는 것이 중요하다. 클로로포름 처리는 일반적으로 종래의 핵산 추출법 자유 핵산을 저하 클레아 처리하여 잔여 세포를 용해하기 위해 사용된다. 제시된 워크 플로우에 대한주의는 웹 기반 협동 학습 그라데이션를 입력 너무 낙관적 일 수있다 포락선 바이러스 입자를 제외 할 수 있으므로 바이러스 입자를 분리하는 밀도 기울기 분리를 사용했다. 대안은 &quot;포괄&quot;방법은 밀도 구배 separ를 생략하는 것입니다ATION는 0.45 μm의에서 지역 사회 DNA 분리 및 - 클로로포름의 DNase I.이 방법으로 처리 여과 액을 같은 면봉 또는 혈장에서 그와 같은 작은 샘플 볼륨을 수용하는 것이 적절하다. 그러나,이 클로로포름 내성 세균 오염과의 DNase I-내성 세포 DNA의 양이 더 발생할 수 있습니다. 높은 DNA 수율은 시퀀싱 옵션의 폭 넓은 선택을 제공함으로써 현재 시퀀싱 프로토콜은 1 NG 시퀀싱 라이브러리 준비를위한 핵산의 μg의 1이 필요합니다. 생성 viromes의 DNA 농도는 종종 200 이상 NG / μL로 검출 한계 이하의 범위. 회수 된 바이러스 핵산의 양은 직접 염기 서열 라이브러리 제조에 불충분 할 수있다. 이러한 경우, 핵산 증폭은 필수적이다. 링커 증폭 산탄 라이브러리 (LASLs) 2,42,43 복수 변위 증폭 (MDA)에 기초하여 전체 게놈 증폭 두 아르방법은 가장 일반적으로 충분한 DNA 시퀀싱을 생성하기 위해 사용될. 이러한 Phi29 DNA 폴리머 라제에 기초한 것과 MDA 방법은 증폭 바이어스 겪을 공지되어 있으며, 비 정량적 우선적 분류 학적 및 기능적 특성화 44,45 결과, ssDNA를 원형 DNA를 증폭 할 수있다. LASLs 접근법의 최적화 된 버전은 최소한의 바이어스를 소개 도시 (출발 물질이 소량에 대해) 더 높은 민감도를 촉진하고, 용이하게 다른 시퀀싱 플랫폼 (43)하도록되어있다. 그러나, 방법은 많은 단계가 DNA 손상을 최소화하기 위해 특수 장비를 필요로하고, dsDNA 템플릿에 한한다. 우리 연구실에서는이 방법이 성공적으로 기관지 lavage-, coral-과 바다 물에서 파생 된 VLP를 (미 출판과 Hurwitz의 등. 46)에서 추출 된 DNA의 검출 및 탐지 양을 증폭하도록하고있다. 데이터 분석 파이프 라인을 개발하는 것은 CLA를 가지고ssically 인해 바이러스 성 지역 사회의 매우 다양하고 대부분 알 수없는 특성으로 바이러스 메타 지노믹스 분석의 가장 어려운 문제 중 하나가되었습니다. 날짜 현재 바이러스 데이터베이스에 생물권에 약 10 8 바이러스 유전자형이가 있지만,이 대략 전체 바이러스 성 다양성의 약 1 / 100,000입니다 ~ 4000 바이러스 게놈가 포함되어 있습니다. 따라서, 바이러스 성 metagenomes의 분류 및 기능 할당 (예 : BLAST 47) 유사성 기반 검색은 고유의 과제를 가지고있다. 많은 서열은 게놈 데이터베이스의 상당한 유사성을 실패하고, 그러므로, 미지로 분류된다. 상동 기반 검색이 분류법을 할당을위한 가장 중요한 애플리케이션은 데이터 시퀀스를 작동하더라도, 데이터베이스 분석에 근거하여 독립적 인 대안 적 방법은 48 (50)이 개발되었다. Fancello 등. (51)은 비라에 사용되는 계산 도구와 알고리즘의 전체 리뷰를 제공리터의 메타 지노믹스. 미생물 메타 지노믹스 일반적으로, 저장성 용해 처리 된 미생물 군집 (HL-DNA)에서 추출 된 DNA의 총량은 20 ng의 5 μg의 범위. 수율은 환자의 건강 상태 및 본 연구 (표 2)에 추출 된 HL-DNA의 총 수율에 변화를 보이는 설명 수집 객담 시료의 양에 크게 의존한다. 중요한 단계는. 양질 시퀀스 데이터 생성 순서 라이브러리의 질에 의존 생성 2 효소 기반 DNA 단편화 절차를 이용하여 CF 객담 유래의 미생물 DNA로부터 생성 순서 라이브러리의 전형적인 크기 범위를 도시도. 최적 라이브러리 크기는 시퀀싱 플랫폼 및 애플리케이션의 선택에 의존하며, 따라서, 필요한 경우, 단편화와 같은 절차를 초음파 분무 같은 대체 방법을 통해 최적화 될 수있다. 이외에도제시된 대표적인 결과는, 여러 시점에 걸쳐 다수의 환자에서 수집 CF 객담에 제시된 방법의 성공은 또한 (2012) 9. 임 등의 알에서 설명하고 임 외. (2014) 10. 이전의 연구 9,10 모든 환자가 변동으로 인해 이러한 항생제 치료 등의 섭동 가능성시키면서 지역 사회 내 주요 선수의 지속성을 반영, 시간이 지남에 따라 이동 미생물 군집의 고유 한을 품고있는 것이 좋습니다. 이러한 변동도 외부 교란하지 않거나 인해 샘플링 절차 및 샘플 처리에 매일 발생 여부, 질문에 아직도있다. HL-DNA의 metagenomic 및 16S rDNA의 증폭 물 분석에 기초하여, 7 일 종 샘플링 보여준다 항생제 섭동없이 미생물 프로필 일일 변동 (주 1, 2, 3) 하였다 최소 (도 3a 및도 3b). 소개시항생제 시프로플록사신은 P.으로 알려진 세균성 병원균의 광범위한 스펙트럼을 대상으로하는 동안 경구 용 항생제의 duction 즉시 3 일 샘플링 한 후, 지역 사회 프로파일의 변화는 일 4. 명백하게되었다 녹농균, 황색 포도상 구균, 폐렴 구균 및은 치료 P.의 상대적인 농축 증가 녹농균은 연쇄상 구균 종을 감소한다. 및 P. melaninogenica. 6 일함으로써, 지역 사회 천천히 초기 시작 사회 구조에 회복되었다. 결과는 한 명의 환자 내에서 미생물 프로파일의 변동으로 인해기도에 지역 사회의 동요에 더 많은 가능성이 있음을 시사한다. HL-유도 된 DNA로부터 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes의 미생물 프로파일 사이의 일관성을 감안할 때, 우리는이 연구에서 사용 된 16S rRNA 유전자 프라이머에서 발생하는 편견을 배제. 16S rDNA 염기 분류에 걸쳐 본의 차이점에 대한 한 가지 가능한 설명총 DNA 및 HL-유래 DNA (그림 3B)에서 생성 된 알 프로파일은 슈도모나스 종 다량의 존재 일 수있다. 항생제 치료 후 세포 DNA. 이것은 이러한 차이는 7 일에서 가장 명백한 있다고 연구 결과에 의해 지원됩니다, 삼일 슈도모나스 종을 대상으로 항생제 치료 후. 다른 이외에. 시프로플록사신 일반적 만성 P. CF 환자에서 제 치료제로서 사용 활동의 스펙트럼이 가장 CF-관련된 병원체를 포함하더라도 녹농균 감염. 우리는 항생제 치료가 연쇄상 구균 종을 포함하여 취약 지역 사회를 근절한다는 가설을 세웠다. 따라서 내성 P.에 의해 채워 틈새를 만들어 녹농균. 녹농균은 생물막 지역 사회를 증가를 통해 저항을 얻을 수 있으며, 세포 외 DNA는 생물막 구조 (52)의 주요 구조 지원 될 것으로 나타났다. 심지어 t으로그는 사회 구조는 세포 외 DNA는 CF 객담에 남아있을 수있다, 회복되었다. 따라서 이러한 데이터는 저장성 용해 잠재적으로 만 인간 유래 DNA를 제거하지에 도움이 워크 플로에 제시된 세척 단계뿐만 아니라, 미생물 유래의 세포 외 DNA는 실제 미생물 프로파일을 잘못 수 있음을 시사한다. Metatranscriptomics 고품질 metatranscriptome는 상대적으로 적은 리보솜 RNA (rRNA의) 시퀀스를 포함하고 지역 사회 성적 증명서 (의 mRNA)의 편견 샘플링을 대표한다. 인해 mRNA를 짧은 반감기 및 제한된 양으로, 이는 프로토콜이 여기에 제시된 바와 같이, 회수 된 전 사체의 수를 최대화하기 위해 시료 처리를 최소화하는 것이 중요하다. 최근, rRNA의 고갈을위한 여러 접근법이 개발되어 시판 키트에 장치. 이들은 MICROB 풍부하게, 리보 제로 및 샘플 별 감산 시간을 포함ybridizations 올리고 뉴클레오티드 하이브리드 화, 및 5 &#39;모노 포스페이트를 함유하는 엑소 뉴 클레아 제 효소 활성 표적 RNA에 기초-ONLY mRNA의 키트에 기초 53아르. 또한, 이러한 우선적으로 선형 RNA를 polyadenylates 및 증폭 MessageAmp II-박테리아 키트와 같은 mRNA의 부화에 대한 몇 가지 접근 방식도 사용할 수 있습니다. 이러한 방법 (예를 들면, mRNA의 전용 MICROB E의 XPRESS 및 MessageAmp)의 일부는 최적의 효율을 동시에 사용된다. 그러나 이러한 접근 방법 모두의 효능은, 부분적으로 저하 rRNA의 작업을 자주 CF 샘플에서 추출 된 총 RNA에서 관찰 특히, 제한된다. 폴리아 데 닐화 - 의존성 RNA 증폭 원핵 및 진핵 세포 모두에의 mRNA 이루어진 metatranscriptomes을 생성하기 위해 사용될 수 없다. 또한, 폴리 (A) 꼬리에 유용 시퀀스 데이터의 양을 줄일 수있는 서열에 첨가 하였다. 단독 뻗어와 지역의 품질이 저하 점수를하는 경향이, C상당수를 ausing 것은 폴리을 트리밍 한 후 시퀀싱 및 후 시퀀싱 소프트웨어, 평균 판독 유용한 길이에 의해 여과 될 판독한다 (A) 꼬리 (54)가 크게 감소 될 것이다. 복잡한 CF 미생물 지역 사회와 부분적으로 저하 RNA (도 4A 및 4C) 다루기, 우리의 이전 연구는 리보 제로 골드 키트에 의한 하이브리드 캡처 방법을 사용하여 결합 치료에 비해 인간과 미생물 rRNA를 모두 제거에 더 효과적인 것으로 나타났다 다른 키트 9 (표 3). 결과 데이터는 인간 숙주와 미생물 성적 증명서 모두를 동시에 분석 할 수 있습니다. 수율 및 RNA의 질뿐만 아니라 시퀀싱 플랫폼의 최종 선택에 따라 cDNA를 합성하는 단계를 포함하여 이들 공정 중 많은 시퀀싱 라이브러리 생성하여 간소화 될 수있다. 예를 들어, 리보 제로 처리 된 RNA는 metatranscriptome 시퀀싱 천칭을 만들기 위해 사용될 수있다RIES ScriptSeq RNA-SEQ 도서관 준비 키트를 사용하여. 동물 관련 커뮤니티의 Metagenomic 분석은 호스트와 관련된 지역 사회를 포함하는 전체 기능 엔티티의 포괄적 인 표현을 제공합니다. 여기에 제시된 플로 특히, 원하는 바이러스 및 미생물에 더하여 두꺼운 점액 세포 파편, 세포 DNA, 단백질 및 당 단백질 복합체의 높은 양뿐만 아니라, 숙주 세포를 포함하는 것과 복잡한 동물 연관된 다양한 시료에 적용 할 수있다 입자. 미생물 및 바이러스 성 입자는 모든 단계에서 손실 될 수있다하더라도, 분리 및 정제가 숙주 DNA의 양을 최소화하는 것이 필수적이다 입자. 메타 지노믹스 데이터가 조사 된 지역 사회의 대사 잠재력을 제공하지만, 인코딩 기능 9의 발현 차이를 공개하여이를 보완 metatranscriptomics. 유전체 및 전 사체 데이터의 포괄적 인 평가는 새로운 기능을 나왔고지역 사회 상호 작용의 역학에 ights 및 개선 치료 9,10,55의 개발을 용이하게한다.

<html> 인체와 관련된 바이러스 및 미생물 군집은 1,2- 시퀀싱 기술의 적용을 통해 지난 10 년간 광범위하게 연구되었다. 결과는 인간의 건강과 질병의 중요성 미생물의 인식으로 이어졌다. 주요 사업은 인간의 피부에있는 세균을 설명하는 인간 마이크로 바이 옴 프로젝트 (일부 고세균)에서 온, 구강 충치,기도, 비뇨 기관, 위장관 3 내. 기관지 폐포 세척액 (BAL) 4,5 인두 면봉 4을 통해 건강한 사람의기도의 또 마이크로 바이 옴의 연구는 폐 환경 샘플링 장치,기도에 과도 미생물 식민지의 결과로 역할을 할 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 장애인기도 표면의 미생물 식민지의 영향은 낭포 성 섬유증 (CF) 환자에서 본 것과 같은 심각한 만성 폐 감염으로 이어질 수 있습니다. t는 &quot;&gt; CF는 낭포 성 섬유증 막 횡단 레귤레이터 (CFTR)의 돌연변이 유전자 (6)에 의한 치명적인 유전 질환이다. 이러한 돌연변이가 차례로 상피 세포의 꼭대기의 표면을 가로 질러 transepithelial 이온 수송에 영향을 미치는 결함이있는 CFTR 단백질에 상승을 제공합니다.이 질환에 영향을 미칩니다 여러 기관 시스템,하지만 사망률과 이환율의 대부분은 CF 폐 질환 (7) 때문이다. CF 폐 미생물 식민지의 고유 한 생태계를 제공한다. 이온 수송에 결함이 호기성으로 구성된 미세 환경을 생성, CF기도에 구축하는 점액의 원인 정적 영양이 풍부한 점막 표면에 의해 고정 호기성 및 혐기성 구획.이 환경은 바이러스, 박테리아, 곰팡이를 포함한 식민지 미생물의 증식을 촉진한다. 급성 및 만성 폐 미생물 감염의 결과로 일정하지만 효과가 면역 반응으로 이어질 광범위한기도 개형, 폐 용량 감소, 궁극적 pulmo어림 실패. CF 폐와 관련된 세균 지역 사회는 물론 16S 리보솜 RNA (rRNA 유전자) 유전자 염기 서열 8 산탄 총 메타 지노믹스 (9, 10)를 사용하여 포함 모두 문화에 의존하는 문화 독립적 인 접근 방식을 사용하여 설명 하였다. 16S rRNA의 중심 접근법은 미생물 종의 다양한 특징 및 커뮤니티 다양성 넓은 변화를 포착 할 수있다. 그러나, 지역 사회를 정의의 해상도로 제한된다. (Claesson 등 2010 년 11 요약) 및 신진 대사에 영향을 미치는 잠재력의 예측은 확인 된 분류군에 대한 공지 된 일반적인 기능으로 제한됩니다. 따라서, 16​​S rRNA의 유전자 시퀀싱 방법은 CF 폐에 존재하는 다양한 미생물 지역 사회의 필요 분류 학적 및 기능적 분석의 정확성에 대한 불충분하다. 여기에 설명 metagenomic 접근은 그 한계를 극복, 16S rRNA 유전자 기반 접근법을 보완하고, 상대적으로 효율적인 방법을 가능하게미생물 군집의 분류 및 CF 폐 유전 적 내용을 모두 분석합니다. 동물 샘플들로부터 격리 관련된 미생물 DNA는 종종 숙주 DNA를 다량 포함. 14 - CF 객담 또는 폐 조직 샘플은 일반적으로 면역 반응에 의해 방출 인간 호중구 DNA 다량의 DNA (12)의 총 종종 99 % 초과를 함유한다. 일부 본래 인간 세포가 존재하더라도,이 DNA 용액의 대부분은 무료 또는 미생물의 표면에 흡착된다. 또한, 매우 점성 점액 플러그, 세포 잔해 및 다른 오염 물질이 미지의 존재는 상기 균체 분리 복잡. 여러 가지 방법을 선택적으로 인간의 DNA (16), 및 MolYsis 키트, 제한적인 성공에 모든 저하 에티 디움 브로마이드 모노 아자 미생물 균체 (15)에서 분리 된 인간의 DNase I 치료에 퍼콜 그라디언트를 포함하여 인간 DNA의 이러한 샘플을 파괴 시험 하였다.<html> CF 객담에 가장 효과적인 미생물 DNA 정제 과정을 최신 것은 Breitenstein 등에 의해 기술 된 방법의 변형이었다. (1995) 17. 본원 저장성 용해 (HL)로 알려진 방법이 방법은, 점액 이황화 결합, 진핵 세포의 저장성 용해하고, 수용성 DNA의 DNase I (9)의 처리를 줄이기 위해 β 머 캅토 에탄올의 조합을 사용한다. 대안의 부족에도 불구하고 HL 방법으로 인해 (I)에 대한 몇 가지 우려 원치 않는 미생물의 분해 및 화상으로 인한 가능한 편견을 제기 (II) 지역 사회 조성 (9, 10)의 관찰 변동이 샘플 가공과 관련이 변화의 이슈인지. 샷건 metagenomes의 생성 외에, 우리는 전체 DNA 및 연속 7 일에 걸쳐 단일 환자로부터 수집 객담 샘플들의 동일한 세트를 사용하여 HL 방법에서 추출 미생물 DNA의 16S rRNA 유전자 프로파일을 비교함으로써, 이러한 문제를 해결한다. 미생물 군집에 비해 ENT는 &quot;&gt;, 동물과 관련된 바이러스 성 지역 사회의 특성은 제한 (18, 19)이다 CF기도의 바이러스 성 사회는 최소한 20 특성화되었다 -.. 22 CF기도의 바이러스 성 지역 사회의 DNA를 특징 짓는 첫 번째 metagenomic 연구 CF 폐와 관련된 대부분의 바이러스는 파지 20 있음을 보여 주었다. CF와 비 CF 개인의 파지의 대사 가능성이 크게 달랐다. 특히, CF 개인의 파지 사회가 CF기도의 생리에 박테리아 숙주 적응의 반사 유전자를 실시, 및 CF 폐 조직에서 바이러스의 세균 독성 (20). 이후 metagenomic 연구는 해부학 적 영역 (22) 사이의 바이러스 성 지역 사회의 고유 한 공간 이질성을 보여 주었다. 또한, CF 폐 조직은 어떤 생태계 22 일에 관찰 된 가장 낮은 바이러스 성 다양성을 숨겨. 확인 된 대부분의 바이러스는 파지했다가능성 CF 병원균에 감염. 그러나, 헤르페스 바이러스, 아데노 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (HPV)와 같은 진핵 세포 바이러스도 검출되었다. 폐 조직에 낭종 해부 동안 관찰 한 경우에서는, 인간 유두종 바이러스 게놈의 99 % 이상이 환자는 폐 암 또는 유두종으로 진단되지 않았다하더라도, 회수 하였다. 이것은 바이러스 다이버 시티는 본 조직 손상의 정도를 반영 할뿐만 아니라 노출 및 하부지지 않은 질환을 설명 할 수있을뿐만 아니라 것을 나타낸다. 여기에 설명 된 프로토콜은 두꺼운 점액, 호스트와 균체, 자유 DNA뿐만 아니라 세포 파편 다량으로 구성 샘플로부터 바이러스 - 유사 입자 (VLP를)를 분리하기 간단하지만 강력한 방법을 제공한다. 메타 지노믹스 보완, metatranscriptomics는 미생물 지역 사회와 호스트 9,23에서 유전자 발현의 역학을 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 경우, 모두 미생물 및 호t mRNA를 우선적으로 선택해야합니다. 세균의 mRNA가 폴리아 데 닐화되지 않기 때문에, 올리고 dT를 기반 mRNA의 풀다운 방법으로 악용 할 수 없습니다. 샘플 진핵 mRNA를 다량 함유하는 것으로 알려진 경우, 폴리아 데 닐화 - 의존성 RNA 증폭 호스트 관련된 샘플에서 사용될 수 없다. CF 객담 포함한 많은 동물 연관된 샘플은, RNases 포함 높은 세포 파편의 양 및 클레아 외에도 세포의 높은 농도를 포함한다. 따라서, 또 다른 도전 과제는 metatranscriptome 처리 중에 광범위한 RNA 분해를 방지하는 것이다. 대부분의 경우에, CF 객담에서 추출한 총 RNA는 RNA 유래의 하류 어플리케이션 및 유틸리티를 제한 부분적으로 저하된다. 최근, rRNA의 고갈을위한 여러 접근법이 개발되어 시판 키트에 장치. 이러한 방법의 효능은 그러나 특히 부분적으로 저하 rRNA의 9,24 작업을 할 때, 제한된다. 여기에 사용 된 방법은 허용효율적인 하류 총 rRNA의 제거에 적합 부분적으로 성능이 저하 된 총 RNA의 검색을 위해 에디션. 두 개의 서로 다른 키트를 비교 부분적으로 성능이 저하 된 총 RNA에서 rRNA 유전자 제거의 효율을 직접 비교는 임 등의 알에 의해 설명되었다. (2012) 9. 전반적으로,이 원고의 목적은 예를 들어 객담 샘플을 사용하여, 하나의 동물 연관된 샘플로부터의 프로토콜 세트 바이러스 및 미생물 샷건 metagenomes를 생성한다 (도 1), 및 metatranscriptome를 제공하는 것이다. 분자 실험실 워크 플로는 교차 오염을 최소화하기 위해 별도의 사전 및 사후 증폭 영역을 포함해야한다. 방법은 조직 (22), 인두 및 구강 인두 면봉 (25), 기관지 폐포 세척액 (BAL)와 산호 (게시되지 않은 데이터)와 같은 다른 종류의 시료에 쉽게 적응할 수 있습니다. 각 샘플 수령시 즉시 처리, 특히 미생물 메타 지노믹스와 만족하여야한다atranscriptomics 연구가 요구된다. 샘플을 동결하면 잠재적 셀 무결성을 방해로 동결 metagenomes 속담 미생물 균체의 분리를 제한한다. 그러나, 동결 metatranscriptomics과 바이러스 분리되지만, 동결 - 해동 과정을 통해 영향을받을 수있는 회수 된 바이러스 입자의 RNA의 질과 양을 배제하지 않는다. 그것은 그 객담이 BAL이 너무 침입 할 수있는 성인 CF 환자와 만성 폐 질환 (26, 27)과 관련된 많은 연구에서 샘플의 기본 소스 역임했다 주목하는 것이 중요하다. 우리의 연구에서, 객담 샘플을 구강 및 최소 객담 내 구강 미생물 오염을 유지하는 멸균 생리 식염수를 사용하여 구강 헹굼 다음 신중하고 일관된 샘플링 방법, 즉, 함께 수집 하였다.

<table><tbody><tr><td>구아니딘 이소티오시아네이트 기반 RNA 용해 완충액</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS 시약이 이 연구에서 사용되었습니다</td></tr>. <tr><td>실리카 비드; 0.1 - 0.15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>지르코니아-실리케이트 비드가 이 연구에서 사용되었습니다</td></tr>. <tr><td>디티오트레이톨, 분자 등급(건조 분말)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>는 다른 회사에서</td></tr> <tr><td>구입할 수 있습니다.멸균 주사기 필터; 0.45 & 마이크로; m 기공 크기 친수성 PVDF 막</td><td>Millipore SLHV033RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I 효소&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터; 0.02 &마이크로; m 기공 크기</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>직경: 25mm</td></tr><tr><td>초투명 원심분리기 튜브</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &frac12; in. (14 x 90 mm), SW41 Ti Rotor 및 VLPs에 적합 밀도 구배 초원심분리</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 fixed angle rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA polymerase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Phi29 랜덤 헥사머</td><td>써모 사이언티픽</td><td>S0181</td><td>이전에 Fidelity Systems에서 구입</td></tr> 환<tr><td>형 폴리프로필렌 지지 링이 있는 알루미나 매트릭스 필터; 0.02 &마이크로; m 기공 크기</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>Whatman Anodisc 필터 멤브레인이 이 연구에서 사용되었습니다; 직경 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold 핵산 젤 염색</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>다른 회사에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>글리코겐, RNA 등급</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>다른 회사에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Oak Ridge 고속 원심 분리기 튜브</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>대용량 DNA 추출 절차의 경우 SS-34 고정각 로터에 적합</td></tr><tr><td>총 rRNA 제거 키트</td><td>진원지</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology)는 rRNA 제거와 염기서열분석 라이브러리 제제</td></tr><tr><td>Cesium chloride</td>를 결합하는 데 사용할 수 있습니다.<td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>헥사데시트리메틸-암모늄 브로마이드(CTAB)</td><td>시그마-알드리치</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

불순한 정화 : 연속 metagenomes 및 metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

높은 처리량 시퀀싱의 접근성은 생물학의 여러 분야를 혁명을 일으켰다. 더 나은 호스트 관련 바이러스와 미생물 군집을 이해하기 위해서는, DNA와 RNA 추출을위한 포괄적 인 워크 플로우를 개발 하였다. 플로 동시에 차세대 시퀀싱 단일 샘플로부터 바이러스 및 미생물 metagenomes뿐만 아니라 metatranscriptomes를 생성한다. 이러한 방식의 커플 링은 분류 학적 특성과 사회 인코딩 기능 모두의 개요를 제공합니다. 그것은 매우 점성과 점액의 높은 양, 무료 호중구 DNA 및 기타 알 수없는 오염 물질을 포함하고 있기 때문에 제시된 방법은, 낭포 성 섬유증 (CF) 가래, 문제 샘플 유형을 사용합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이러한 문제를 대상으로 성공적 최소 인간 DNA의 오염 미생물 및 바이러스 성 DNA를 회수. 메타 지노믹스 연구를 보완하기 위해, metatranscriptomics 프로토콜은 모두 미생물을 복구하기 위해 최적화 된상대적으로 적은 리보솜 RNA (rRNA의) 시퀀스를 포함하고 호스트의 mRNA. 데이터 특성의 개요는 방법의 성공 여부를 평가하기위한 기준으로서 역할을 제시한다. 추가 CF 객담 샘플은 (i) 단일의 환자 내에서 연속 7 일에 걸쳐 마이크로 바이 프로파일의 일관성을 평가하고, (ⅱ) 16S 리보솜 RNA 유전자 기반 시퀀싱 metagenomic 방법의 일관성을 비교하기 위해 수집 하였다. 결과는 항생제 교란하지 않고 미생물의 프로필 매일 변동이 최소이고 일반적인 CF-관련된 박테리아의 분류 프로파일 저장성 용해 (HL) 유래 DNA로부터 생성 된 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes 사이에 매우 유사한 것으로 나타났다. 저장성 용해 및 세척 단계는 오직 인간 유래 DNA를 제거하지 시킨다는 이점이 제안하지만, 16S rDNA 염기 분류 학적 프로파일 간의 차이가 전체 DNA 및 HL 유래 DNA로부터 생성뿐만 아니라 extracellul을 미생물 유래실제 미생물 프로파일을 잘못 할 수있다 아칸소 DNA.

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

이 절차의 전반적인 목표는 낭포성 섬유증 가래와 같은 복잡한 숙주 관련 샘플을 수집 및 처리하여 메타유전체학(metatagenomic) 및 메타전사체(meta transcriptomic) 접근법을 사용하여 바이러스 및 미생물 군집을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 피험자가 분무기를 통해 7%의 고긴장 식염수를 흡입하게 한 다음 30분 동안 유도된 가래 샘플을 수집함으로써 수행됩니다. 다음으로, 샘플은 즉시 균질화되어 바이러스 메타게놈, 미생물 메타게놈, 메타 전사체 및 여분의 객담으로 분류된 4개의 튜브에 균등하게 분포합니다.다음으로, 메타 전사체 튜브를 밀봉하고 수평으로 놓고 가래를 10분 동안 중간 속도로 균질화합니다. 마지막으로, 개별 부분 표본은 메타유전체학(metagenomic) 연구를 위해 핵산을 분리하기 전에 바이러스 또는 박테리아 세포를 분리 및 정제하기 위해 별도로 처리됩니다. 궁극적으로, 분리된 핵산은 메타유전체학(metagenomics) 및 메타 전사체학(meta transcriptomics) 라이브러리를 생성하기 위한 고처리량 염기서열분석 라이브러리 준비에 사용됩니다.이 절차의 주요 장점은 DNA 및 RNA 수준에서 바이러스 및 박테리아 군집 연구를 위해 복잡한 숙주 관련 샘플을 처리할 수 있는 포괄적인 워크플로우를 제공한다는 것입니다. 바이러스 및 미생물 세포 정제 단계를 배우기 어려운 동안 샘플의 적절한 취급을 보장하기 위해 샘플 전처리 단계가 중요하기 때문에 이 절차의 시각적 시연이 중요합니다.샘플이 수집되기 전에 샘플당 4개의 15ml 튜브에 다음과 같이 라벨을 부착하며, 첫 번째는 바이러스 메타게놈으로 표시합니다. 두 번째는 메타 전사체를 가진 미생물 메타게놈 3번과 여분의 가래 튜브 4번입니다. 메타 트랜스크립톰이라고 표시된 튜브에 0.1mm 실리카 비드 2ml를 추가한 다음 기인 이소티오시아네이트 기반 RNA 용해 완충액 또는 GITC 용해 완충액 6ml를 추가합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 샘플 수집 절차에 따라 pre wade 샘플 컵을 사용하여 샘플 수집 후 컵의 무게를 측정하여 샘플 부피를 추정하고 빈 컵의 무게를 뺍니다. 나머지 무게의 경우 1g은 샘플 1ml에 해당합니다. 샘플의 부피가 8 밀리리터 미만인 경우 0.02 마이크로미터 여과 1 XPBS의 적절한 부피를 추가하여 최종 부피를 최대 8 밀리리터로 가져옵니다.그런 다음 즉시 3ml 주사기를 사용하여 동일한 주사기를 사용하여 객담 내에 눈에 보이는 덩어리가 남지 않을 때까지 샘플을 균질화한 다음 즉시 2ml의 가래를 추출하여 실리카 비드와 GITC 용해 완충액이 들어 있는 마이크로 전사체 튜브에 주입합니다. 뚜껑을 닫고 파라 필름을 사용하여 뚜껑을 단단히 밀봉하십시오 누출을 방지하려면 와류를 사용하십시오. 동일한 주사기 분취액을 사용하여 각각 2ml의 가래를 vira metagenome 및 microbial metagenome이라고 표시된 튜브에 넣고 가래 컵에 남은 가래를 extra sputum이라고 표시된 튜브로 옮깁니다.모든 튜브를 섭씨 4도 또는 얼음 위에 보관하고 필요한 경우 실험실로 운반하여 바이러스 메타게놈을 생성합니다. 완충액 및 용액 준비 후. 총 부피 6ml에 0.02마이크로미터의 여과된 식염수 마그네슘 완충액을 추가하여 샘플을 전처리합니다.점액 용해를 돕기 위해 각 샘플에 6.5밀리몰의 DTT 6ml를 첨가합니다. Vortex는 섭씨 37도에서 1시간 동안 혼합하고 배양합니다. 샘플을 격렬하게 소용돌이친 후 다시 3056Gs와 섭씨 10도에서 15-20분 동안 회전합니다.각 상등액을 새로운 15ml 튜브에 모읍니다. 다음으로, 주사기에 장착된 포인트 45마이크로미터 필터를 사용하여 상층액을 새로운 15ml 튜브로 여과합니다. 100마이크로리터의 샘플을 마이크로 퍼지 튜브에 넣은 다음 클로로포름 처리를 수행합니다.상층액을 추출하고 DN one 시술을 실시합니다. 샘플을 고정하기 위해 동일한 부피의 포름 알데히드 4 % 파라를 첨가하십시오. epi 형광 현미경 검사의 경우, catch-all 바이러스 입자 농축 접근법에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.그렇지 않으면 갓 준비된 염화세슘 용액을 사용하여 각 튜브에 1밀리리터당 1.7그램의 염화세슘 용액을 1밀리리터씩 로드한 다음 밀리리터당 1.5그램의 1밀리리터, 1밀리리터당 35그램의 1밀리리터, 마지막으로 1밀리리터당 1.2그램의 염화세슘 용액 1밀리리터를 로드하여 염화세슘 구배를 설정합니다. 마지막으로, 6-8 밀리리터의 샘플을 개별 그래디언트 튜브에 로드합니다. 각 분수의 위치를 나타내기 위해 개별 레이어를 표시합니다.그런 다음 서로 반대되는 2쌍을 1mg 이내로 균형을 맞춥니다. 각 튜브를 스핀 버킷에 조심스럽게 잠급니다. 로터와 원심분리기에 82, 844Gs 및 섭씨 4도에서 2시간 동안 로드합니다.원심분리 후 3ml 주사기에 부착된 18게이지 바늘로 밀도 구배를 방해하지 않고 홀더에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 바늘의 열린 끝이 위를 향하도록 합니다. 밀리리터당 1.5g 밀도 층 바로 아래에 튜브를 뚫고 약 1.5ml의 용액을 주사기로 천천히 끌어들입니다.바늘을 천천히 제거하고 튜브에 남아 있는 조각이 구멍을 통해 새 15ml 튜브로 떨어지도록 합니다. 이것을 상부 분수 허리로 표시하십시오.V ps가 포함된 주사기의 용액을 두 개의 새로운 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다. 완충액과 용액이 준비되면 텍스트 프로토콜에 따라 포인트 22 마이크로미터 여과 1 XPBS의 5 부피를 첨가하여 화학 후드 아래에서 각 균질액을 희석하고 베타 MAR 캡타 에탄올을 부피 최종 농도의 2 % 부피로 첨가하고 배양 후 2 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔듭니다.3056GS 및 섭씨 10도에서 15분 동안 샘플을 회전시킵니다. 상등액을 버린 후 10ml의 분자 등급 물을 사용하여 펠릿을 재현탁시키고 실온에서 15분 동안 배양한 후 세척을 반복합니다. 마지막 회전 후 SUP natin이 폐기되면 15마이크로리터의 ds를 추가하기 전에 5ml의 XDNA 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.시료 1ml당 1개: 섭씨 37도에서 2시간 동안 반복해서 혼합하여 배양합니다. 샘플을 회전시키고 스내트를 버린 후 10ml의 SE 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 회전시키고 세척을 반복합니다.2ml의 SE 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁하고 현탁액을 두 개의 마이크로 fuge 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 16, 000 GS에서 실온에서 15 분 동안 튜브를 회전시킵니다. 마지막으로, 상층액을 제거한 후 그람 양성 박테리아에 대한 지침에 따라 게놈 DNA 추출 키트를 사용합니다.DNA를 분리하기 위해 바이러스 메타게놈을 생성하기 위한 이전 결과를 요약하면 다음과 같습니다. viromes는 인간 유래 염기서열을 거의 포함하지 않으며, 밀도 구배 초원심분리 단계에서 CCF 4 A가 생략된 70%의 인간 DNA 샘플을 포함하는 샘플이 하나뿐이며, 그 결과 97% 이상의 인간 유래 염기서열을 포함했습니다. 이 그림은 밀도 구배 초원심분리 전후의 일반적인 CF 객담 샘플의 형광 이미지를 보여줍니다.여기에서 볼 수 있는 밀도 구배 분리에 따라 큰 입자가 없는 경우 명확한 vlp가 관찰되었습니다. 경구용 항생제를 투여하기 시작한 낭포성 섬유증 환자 한 명으로부터 매일 7개의 가래 샘플을 채취했습니다. 채취 3일차 후, 각 샘플에서 수집된 하이토닉 용해 유래 또는 HL DNA의 총 수율은 각 샘플에 대해 생성된 Illumina 염기서열분석 라이브러리에서 210나노그램에서 5마이크로그램 이상까지 다양했습니다.하나의 라이브러리를 제외한 모든 라이브러리에서 100만 개 이상의 염기서열이 생성되었으며 데이터 사전 처리 시 85% 이상의 고품질 염기서열이 유지되었습니다. print seq 소프트웨어를 사용하여 인간 유래 염기서열의 총량은 14%에서 46%까지 다양했습니다.여기에 표시된 바와 같이, 하위 샘플의 미생물 프로필은 두 번의 저장성 용해 처리 후의 샘플과 매우 유사합니다. 또한, 두 번째 저장성 용해는 메타게놈 내에서 인간이 아닌 염기서열의 비율을 6-17% 증가시킵니다.임상 샘플 및 잠재적인 병원체를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 개인 보호 장비는 시료 취급 중 항상 사용해야 합니다. 오염이 없는지 확인하기 위해 이 절차를 수행하는 동안 우수한 분자 생물학 및 미생물학 기술이 필요합니다.이 절차를 따르면 바이러스 및 미생물 메타유전체학뿐만 아니라 CF 가래와 같은 복잡한 샘플에서 메타 전사체 연구를 수행할 수 있어야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 바닷물에서 수집한 미생물 바이오매스에서 단백질과 DNA를 추출 및 농축한 후 탠덤 질량 분석 기반 단백질체 분석에 적합한 트립틱 펩타이드를 생성하기 위한 것입니다.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

이 프로토콜은 인간 임상 분리물에서 바이러스 샘플의 편향되지 않은 RNA 염기서열분석을 위해 빠르고 광범위하게 적용 가능한 방법을 설명합니다.

임상 샘플에서 RNA 바이러스의 편견 깊은 시퀀싱

메타유전체학(Metagenomics)을 사용하여 사일리지 소 사료의 마이크로바이옴을 조사했습니다. 분석은 샷건 염기서열분석(shotgun sequencing)으로 수행하였다. 이 접근법은 소 사료 내 미생물 군집의 구성을 특성화하는 데 사용되었습니다.

목초의 군 유전체학 분석

이 프로토콜의 목적은 계산의 조합 및 벤치 연구를 사용 하 여 부분적 으로만 알려져 있을 수 있습니다 공동 정화 시퀀스에서 쉽게 분리 될 수 없는 새로운 시퀀스를 찾을 것입니다.

빼기 게놈에 의해 소설 시퀀스 검색

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

나노 기 공 시퀀싱은 원격 지에서 비용 효과적인 시퀀싱을 허용 하는 새로운 기술 이며 리소스 부족 설정입니다. 여기서, 우리는 이러한 조건과 호환 되는 전 혈에서 mRNAs의 시퀀싱을 위한 프로토콜을 제시 한다.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

이 방법은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) RNA 샘플로부터 얻을 수 있는 서열 데이터의 질 및 양을 개선하는 단계를 설명한다. 우리는 FFPE-RNA 샘플의 품질을 보다 정확하게 평가하고, 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, FFPE-RNA 샘플의 데이터를 분석하는 방법론을 설명합니다.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

MAPS 기술은 생체 내에서 특정 조절 RNA의 표적을 면밀히 조사하기 위해 개발되었습니다. 관심의 sRNA는 RNA 의 RNA 파트너의 공동 정화및 RNA 시퀀싱에 의한 그들의 식별을 가능하게 하는 MS2 aptamer로 태그됩니다. 이 수정 된 프로토콜은 특히 그램 양성 박테리아에 적합합니다.

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

임상 메타단백질체학(Clinical metaproteomics)은 인간 마이크로바이옴과 질병에 대한 기여에 대한 통찰력을 제공합니다. 당사는 Galaxy 플랫폼의 컴퓨팅 파워를 활용하여 복잡한 질량 분석 기반 메타단백질체 분석 및 질병 연구와 관련된 다양한 임상 샘플 유형의 특성화를 용이하게 하는 모듈식 생물정보학 워크플로우를 개발했습니다.

인간 질병의 기저에 있는 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 분석하기 위해 Galaxy Bioinformatics 플랫폼 내에서 구현된 임상 메타단백질체학 워크플로우

배우세요 낭포성 섬유증 환자의 가래 샘플에서 바이러스와 미생물 군집을 연구하는 메타게놈 및 메타트랜스크립톰 분석 방법을. 이 워크플로우는 복잡한 숙주 관련 샘플 처리에 필수적입니다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

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