SPOT 펩타이드 배열을 사용하여 단백질 리신 Methyltransferases의 특이성 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질 라이신 메틸 전이효소 또는 PK mts의 기질 특이성을 조사하는 것입니다. 이는 초기 기질을 식별하고 서로 다른 위치에서 단일 아미노산 교환을 포함하는 이 기질의 여러 변형체를 가진 펩타이드 어레이를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 펩타이드 어레이는 방사성 메틸기 공여체의 존재 하에서 PKMT와 함께 배양되며, 이를 통해 방사능이 해당 펩타이드 스폿으로 전달되어 펩타이드 메틸화를 검출할 수 있습니다.

다음으로, 어레이를 X선 필름에 노출시키고 각 펩타이드의 메틸화 활성을 측정하기 위해 정량적으로 분석합니다. 그리고 PKMT의 특이성 프로파일을 정의하기 위해 결과는 기질 펩타이드의 어떤 아미노산이 PKMT에 의한 메틸화에 중요한지 보여줍니다. 이 기법 또는 개별 펩타이드의 메틸화와 같은 기존 방법의 주요 장점은 비용 효율적인 방식으로 한 번의 실험에서 여러 가지 다른 펩타이드를 테스트할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 이전에 알려지지 않은 PK mtss의 새로운 기질의 사양과 같은 단백질 림(lym) 메틸화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 방법은 PK mts의 특이성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 단백질 키나아제, 다른 단백질 방법, 전이효소와 같은 다른 시스템에 적용하거나 전이효소에 추가할 수 있습니다.

펩타이드 스펩타이드 합성을 사용하여 합리적인 비용으로 대형 맞춤형 펩타이드 어레이를 준비할 수 있는 가능성에 익숙해졌을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.이 절차를 시작하려면 다중 펩 스포터 소프트웨어를 사용하여 합성을 위한 펩타이드 염기서열을 설계합니다. 펩타이드 염기서열을 단일 문자 코드로 입력하며, 각 문자는 이 사전 팽창 후 특정 아미노산을 정의하고, 아미노 페그 기능화된 스폿 멤브레인을 말단에 넣고, 디메틸포름아미드 또는 DMF를 10분 동안 입력합니다. 완료되면 기포나 주름이 없는 스팟 합성기 프레임에 젖은 멤브레인을 놓습니다.

합성 프로그램을 시작하기 전에 최소 10분 동안 멤브레인을 완전히 건조시킵니다. 멤브레인을 100% 에탄올로 세 번 세척하여 멤브레인의 유리 아미노산기와 아미드 결합을 생성합니다. 아미노산 유도체에 DIC와 에틸 하이드록시 아미노 시노 아세테이트를 첨가하여 유입되는 아미노산의 카르복시기를 활성화합니다.

활성화 후, 프로그래밍 가능한 로봇을 사용하여 아미노 페그 기능화된 멤브레인에서 원하는 부피의 활성 아미노산을 찾아냅니다. 첫 번째 활성 아미노산의 더 나은 결합을 보장하기 위해 이전 단계를 세 번 반복합니다. 멤브레인을 20분 동안 배양한 후 DMF로 세척하여 건조 및 유리 아미노산을 차단한 후 미결합 아미노산을 제거합니다.

DMF로 멤브레인을 4회 세척한 다음 DMF에 20%피페린을 20분 동안 배양하여 FM 보호 그룹을 제거합니다. 멤브레인을 세척하고 건조시킨 후 원하는 펩타이드 길이에 도달할 때까지 스포팅 및 F MOC 제거 단계를 반복합니다. 마지막 F MOC 그룹 D 보호 후 DMF와 100% 에탄올로 멤브레인을 세척합니다.

그런 다음 DMF에서 멤브레인을 0.02% 브롬 페놀 블루로 완전히 파랗게 변할 때까지 최소 5분 동안 처리합니다. 멤브레인을 세척하고 건조시킨 후 합성기에서 멤브레인을 제거하고 내화학성 상자에 넣습니다. 20-25 밀리리터의 곁사슬 D 보호 혼합물로 처리하십시오., 95 % 트리클로로 아세트산으로 구성되어 곁사슬 보호 그룹을 절단하고 아미노산 곁사슬을 변형으로부터 보호하기 위해 청소제 시약을 절단하십시오.

깊은 보호 혼합물이 멤브레인을 덮고 있는지 확인한 후 상자를 완전히 닫고 배양 후 부드럽게 흔들면서 1-2시간 동안 배양합니다. 20-25 밀리리터의 디 클로로 메탄으로 멤브레인을 각각 2 분 동안 6 번 씻습니다. 100% 에탄올로 두 번 세척한 후 멤브레인을 건조제로 하룻밤 동안 건조시킵니다.

다음으로, 효소가 없는 각각의 메틸화 완충액을 함유한 밀봉된 비닐 봉지에 펩타이드 어레이 멤브레인을 사전 배양하고 방사성 표지된 메틸기로 10분 동안 배양한 후 사전 인큐베이션 버퍼를 버리고 각각의 PKMT를 함유한 8ml의 메틸화 버퍼로 멤브레인을 1-2시간 동안 배양합니다. 그 후, 방사성 폐기물 용기에 메틸화 완충액을 버리고 100 밀리몰의 중탄산암모늄이 함유된 완충액 20 ml와 1% STS로 펩타이드 어레이를 5회 세척하여 결합된 단백질을 제거한다. 방사성 폐기물 용기에 마지막 세척 완충액을 버린 후 10ml의 증폭 용액에 멤브레인을 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 증폭 용액을 방사성 폐기물 용기에 버리고 유기 용매를 넣으십시오. 펩타이드 어레이를 비닐 봉지에 밀봉하고 자동 방사선 촬영 카세트에 넣습니다. 어두운 방의 펩타이드에 자동 방사선 촬영 필름을 놓습니다.

그런 다음 카세트를 조심스럽게 닫으십시오. 섭씨 영하 80도에서 필름을 노출시킨 후 현상하여 결과를 분석합니다. 마지막으로, 강한 메틸화 펩타이드 기질의 포화를 피하기 위해 다른 노출 시간으로 이미지를 몇 번 캡처합니다.

NSD 1과 펩타이드 어레이의 메틸화 반응의 예가 여기에 나와 있습니다. 수평축은 펩타이드의 순서와 수직 방향을 나타냅니다. 바뀐 아미노산은 NSD를 가진 나타난 메틸화, 1개는 그것의 특이적으로 H 3 K 36에 행동하고 NSD 1개의 3개의 펩티드 배열 실험의 표적 lysine 강화의 어느 쪽에나 3개에서 4개의 아미노산 잔기를 인식한다는 것을 보여준다.

펩타이드의 약 85%는 플러스 또는 마이너스 20%보다 작은 표준 편차를 나타내고 펩타이드의 97% 이상이 플러스 또는 마이너스 30%보다 작은 표준 편차를 나타냅니다.계산된 판별 계수 데이터는 NSD 1이 마이너스 2 위치에서 방향족 잔류물을 선호한다는 것을 보여줍니다. 마이너스 1 및 플러스 2 부위에서는 소수성 잔류물을 선호합니다. 그리고 플러스 원 사이트에서는 아르기닌, 라이신, 글루타민 또는 아스파라긴을 선호합니다.

잠재적인 새로운 펩타이드 기질은 인간 단백질체의 데이터베이스 검색을 통해 찾을 수 있습니다. 이러한 펩타이드 중 일부와 ome의 강력한 메틸화는 새로운 NSD one 펩타이드 기질로서의 정체성을 확인합니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차에 따라 가장 적절한 초기 기판을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

시험관 내 및 세포에서 해당 단백질의 메틸화와 같은 다른 방법은 단백질이 기질로 받아들여지는지, 또한 개발 후에 허용되는지 알아내기 위해 수행할 수 있습니다. 이 기술은 단백질 라이신 중간화(lysine mesylation) 분야의 연구자들이 많은 PK mts의 기질 특이성을 정의하고 몇 가지 새로운 기질을 식별할 수 있는 길을 열었습니다. 이는 PK mts의 중요한 생물학적 기능을 이해하는 데 도움이 되었습니다.

펩타이드 합성에서 방사능 및 유기 용매를 사용한 작업은 주장할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.