Name: 생체 내 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 배우세요 생체 외에서 CD8+ T세포가 희소돌기아교세포를 공격하여 탈수초화와 신경세포 사멸을 일으키는 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 신경면역학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) 및 Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB 및 SGM)의 지원을 받았습니다.

생쥐를 사용하는 모든 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되어야한다. 마우스 실험 1. 일반 댓글 <ol><li> 무균 상태에서 마우스를 유지하고 그들에게 음식과 물을 임의로에 액세스 할 수 있습니다. 참고 : 면역 학적 패턴은 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹의 나이와 성별 일치 마우스를 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> (2)의 제조 및 활성화 OVA 특이 CD8 + T 세포 (OT-I) <ol><li> 뇌 조각을 준비하기 전에 오일 후술 OT-I T 세포의 자극을 수행한다. 주 : 5 × 5 활성화 효과기 CD8 + OT-I T 세포 (CD8 + T 세포 MHC-I 분자의 컨텍스트에서 유일한 OVA 257-264 펩티드를 인식하는 트랜스 제닉 마우스)를 슬라이스마다 필요한 농도 5 × 10 5 실험을 선택했다세포가 동시에 슬라이스로 이주 시동 한번 좋은 세포 - 세포 상호 작용을 선호하는 최적 하나로 우방 세포의 양이 하나의 셀 (8, 18)를 계산하는 허용 과잉 반응을 유도하기 위해 너무 높지 않다. </li><li> OT-I T 세포를 배양 매체를 준비합니다. 5 % 소 태아 혈청 (FCS), 10 mM의 HEPES, 2 mM L- 글루타민 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 1 % 비 필수 아미노산 및 25 ㎍ / ml의 겐타 마이신을 500 ㎖의 DMEM을 보완. 사용할 때까지 4 ° C에서 매체를 저장합니다. </li><li> 참조 (16)에 따라 OT-I 형질 전환 마우스의 비장을 제거합니다. 준비된 매체로 전송합니다. </li><li> 5 분, 4 ° C 300 XG에 70 μm의 여과기 및 원심 분리기 서스펜션을 통해 비장를 매쉬업하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. </li><li> 적혈구를 용해시키기 위해 5 분 동안 5 ㎖ 암모늄, 염화 칼륨 (ACK) 완충액 (150 mM의 CL NH 4, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA, pH를 7.3)와 세포 현탁액을 배양한다. </li><li> incubati 중지다시 10 ml의 배지를 원심 분리기에 함께 전술 한 바와 같이. </li><li> 매체에 세포 현탁액을 희석 수를 계산합니다. 판 3 × 10 7 세포의 밀도로 세포 / 웰에서 12 웰 플레이트 프라임 그들을 배양하여 OVA 257 - 264 (SIINFEKL 1 ㎚) 및 인터루킨 -2 (IL-2) (500 IU / ml)에 대한 오일. </li><li> 사일 후, 500 IU의 농도 / ㎖를 다시 IL-2를 추가한다. </li><li> 자극에이어서, 제조업 자의 지시에 따라 음성 선별 계 마우스 CD8 + T 세포 단리 키트를 사용하여 세포 현탁액으로부터 OT-I-T 세포를 정제. 정제는 CD4, CD11b를, 중 CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC 클래스 II, 테르-119 및 TCRγ에 대한 항체의 칵테일을 사용하여 모든 비 CD8가 + 세포의 고갈을 기반으로 / δ 후 정제 된 CD8 + T 세포의 용출 자석 열을 사용하여 폐기되는. 참고 :이 procedu에서 중요한 단계재를 제조하고 의해 표시된다 : 그것은 덩어리의 존재가 용출 단계 동안 열을 차단할 수 있기 때문에, 반응은 단 하나의 셀을 포함하는 것이 중요하다; Byotin 칵테일을 추가하기 전에 셀의 계산은 시료의 청정도에 중요하고 절차는 비특이적 항체 바인딩을 최소화하기 위해 얼음을 수행하여야한다. </li></ol> OT-I T 세포 급성 뇌 조각 및 공동 문화의 3. 준비 <ol><li> 급성 뇌의 제조에 앞서 19, 200 mM의 수크로오스로부터 20㎜ PIPES, 2.5mM의 KCL, 1.25 mM의의 NaH 2 PO 4, 10mM의 황산, 0.5 CaCl2를 10 mM의 덱 스트로스를 사용 placedine 차가운 생리 식염수 용액을 조제을 슬라이스 화 인공 뇌척수액 (ACSF), 125 mM의 염화나트륨, 2.5의 KCl을 사용하여 1.25의 NaH 2 PO 4, 24 mM의 NaHCO3을, 2 mM의 황산, 10 mM의 포도당 2 mM의 CaCl2를. 저기서으로 7.35에 각 솔루션의 산도를 조정g의 NaOH. ACSF의 pH를 조정하기 전에, 용액은 95 % O 2 및 5 % CO 2의 혼합물로 버블 링되어야한다. </li><li> 솔루션을 사전 냉각. </li><li> 8 마취 - (10 주 된 쥐를 예를 들면, C57BL 5.0 %의 이소 플루 란, 5.0 %의 할로 탄 또는 대기 IP를 통해 100 ㎎ / kg 케타민과 10 mg / kg 체중의 자일 라진 (xylazine)을 주사를 사용하여 제어 또는 흡입과 형질 전환 ODC-OVA 마우스 (17) / 6 마취. 마취의 수준을 평가하고, 한 번에 목을 벨 수있는 발가락 핀치를 사용하고 제도적 동물 보호에 따라 쥐를 안락사와 안락사에 대한위원회의 기준을 사용합니다. </li><li> 복부 위치에 마우스를 넣습니다. 소독 및 sagittally 두피를 잘라. , sagitally 두개골 뼈를 열고 국자의 도움으로 신속하게 뇌를 제거하고 접착제를 사용하여에 vibratome의 판에 끼 웁니다. </li><li> 준비된 placedine 얼음처럼 차가운 생리 식염수와 함께 접시를 채 웁니다. </li><li> 에 vibratome 300 μm의 관상 조각을 잘라. 참고 :이 절차는 알고있다n은 적어도 8 시간의 19 ~ 21 시간 내에 세포의 기능적 연구에 적합한 실행 가능한 그대로 티슈 시편을 얻었다. 사실, 이미 6 시간 후에 시작이 기간 후에, 준비는 품질 저하, 활동 전위 생성 및 전파 같은 기본적인 기능적인 특성, 즉 변화를 보여준다. </li><li> 절편 한 후, ACSF 가득 12 웰 플레이트의 각 웰에 즉시 한 조각을 전송합니다. </li><li> 조각 당 신중 5 × 10 5 OT-I T 세포를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터에서 최대 8 시간 (37 ° C, 5 % CO 2)에 대한 슬라이스를 품어. </li><li> 잠복기, 수확 조각과 후의 OCT 화합물 조직-TEK를 사용하여 그것들을 포함하고 액체 질소에서 그들을 동결. 평가, 예를 들면에 더 조직 학적 연구를위한 -20 ° C에서 신경 세포의 구조 (예를 들어, 사용 방지 MAPII 또는 방지 synaptophysin에 항체) 또는 세포 사멸을 (를 저장 예를 들어, 안티 카스파-3 항체 및 안티 NeuN 안티를 사용하여시체) 표준 절차에 따라. </li></ol>

<ol><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+in+PML+and+MS%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences.</a> Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).</li>
<li>Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transected+neurites%2C+apoptotic+neurons%2C+and+reduced+inflammation+in+cortical+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).</li>
<li>Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpial+demyelination+in+the+cerebral+cortex+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).</li>
<li>Babbe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansions+of+CD8%28%2B%29+T+cells+dominate+the+T+cell+infiltrate+in+active+multiple+sclerosis+lesions+as+shown+by+micromanipulation+and+single+cell+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction.</a> J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).</li>
<li>Junker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+T-cell+receptor+expression+in+distinct+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions.</a> Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).</li>
<li>Skulina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+brain-infiltrating+CD8%2B+T+cells+persist+as+clonal+expansions+in+the+cerebrospinal+fluid+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).</li>
<li>Friese, M. A., Fugger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+multiple+sclerosis%3A+a+new+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy.</a> Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).</li>
<li>Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+and+neuronal+damage%3A+direct+and+collateral+mechanisms+of+cytotoxicity+and+impaired+electrical+excitability%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability).</a> FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).</li>
<li>Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+analysis+of+T+lymphocyte+subsets+in+the+central+nervous+system+in+chronic+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+the+cellular+infiltrate+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).</li>
<li>Hoftberger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules+on+the+different+cell+types+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions.</a> Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+neuronal+apoptosis+in+CNS+gray+matter+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%28%2B%29+T+cell+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack.</a> Glia. 58, 469-480 (2010).</li>
<li>Melzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+cell+death+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%2B+T+cell+attack+in+the+CNS+gray+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter.</a> J Neuroinflammation. 10, 121(2013).</li>
<li>Huseby, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenic+role+for+myelin-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis.</a> J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).</li>
<li>McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+killing+of+neurons+by+cytotoxic+T+cells+specific+for+a+glial+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen.</a> Glia. 53 (5), 457-466 (2006).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76 (1), 17-27 (1994).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+transgenic+mice+expressing+ovalbumin+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes.</a> Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+CD25%28%2B%29+FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+cytotoxicity+of+CD8%28%2B%29+effector+T+cells%3A+implications+for+their+capacity+to+limit+inflammatory+central+nervous+system+damage+at+the+parenchymal+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level.</a> J Neuroinflammation. 9, 41(2012).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Meuth, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+TWIK-related+acid-sensitive+K%2B+channel+1+%28TASK1%29+and+TASK3+channels+to+the+control+of+activity+modes+in+thalamocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons.</a> J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).</li>
<li>Misgeld, U., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+viability+of+neurons+in+hippocampal+slices+on+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply.</a> Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).</li>
<li>Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+activation+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+presence+of+antigen+in+organotypic+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices.</a> J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

다양한 동물 모델은 MS와 같은 염증성 탈수 초성 질환의 병리학 적 특징을 해결하기 위해 지난 수십 년에 걸쳐 설명되었다. 비보 마우스 및 래트 모델은 광범위 질환의 병태 생리 학적 특징을 모방하는 데 사용된다, 즉, 탈수 초화 및 재유 수화 처리의 결과 분석 염증 및 신경 퇴행의 섞일 에피소드. 그럼에도 불구하고, 단지 생체 방법은 정확한 기본 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 급성 뇌 조각의 제조는 널리 배포 모델이고 신뢰성있는 반복 가능한 것으로 간주 될 수있다. 셀 상호 - 분리 및 희소 돌기 아교 세포 - 특이 적 면역 세포의 배양과 조합에서, 특히기구와 면역 세포와 공격 세포의 동력학 연구의 관점에서, 특정 실험 문제를 해결하는데 사용될 수있다. 기타 생체 외 접근법은 널리 공지되어있다22 사용하지만 즉 OT-I T 세포에 노출 노출 여부 WT의 Caspase3 면역 반응을 확인, 다른 &quot;...

뉴런과 축삭의 소실을 동반한 희소돌기아교세포의 사멸과 수초의 파괴는 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 개인의 회백질 병변에서 전형적인 병리학적 소견입니다1,2. 피질 병변은 지금까지 세 가지 하위 유형 2으로 나눌 수 있습니다: 피질하 병변, 피질 내 병변 및 백혈 피질 병변. 백질 플라크와 비교했을 때, 침투는 CD8+ T-세포가 우세한 것이 특징이며, 이는 회백질 염증에서 결정적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다3. 또한, 혈액, 뇌척수액(CSF) 및 염증성 병변 내 올리고클론 확장은 CD8+ T 세포 자체에서 발견될 수 있습니다4-6. 
이에 따라 CD8+ T-세포는 다른 미엘린 단백질에 특이적일 수 있다고 가정합니다7,8. 실제로, CD8+ T-세포는 MHC I 발현11을 보이는 희소돌기아교세포와 미엘린초(myelin sheath)9,10 근처에서 발견되며, 따라서 수초(myelin sheath)의 손실에 책임이 있을 수 있습니다. 이 과정은 종종 중추신경계(CNS) 회백질1,2 내의 광범위한 '부수적' 신경 및 축삭 손상과 함께 볼 수 있습니다. 사실, 희소돌기아교세포와 뉴런의 직간접적인 사멸은 두 가지 다른 메커니즘을 통해 CD8+ T 세포에 의해 유도됩니다: (i) 퍼포린과 그랜자임의 방출에 따른 세포독성 과립의 형성으로 인한 세포막 팽창 및 파열, 그리고 (ii) Fas 수용체에 대한 결찰 또는 FasL의 표면노출 8,12,13.
언급된 과정의 기본 메커니즘을 연구하기 위해 다양한 유형의 동물 모델이 확립되었습니다. 이와 관련하여, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 또는 성상세포(astrocyte)와 같은 중추신경계(CNS) 신경교세포에서 유도 발현되는 자가항원에 특이적인 프라이밍된 CD8+ T-세포는 회백질에서 ''담보적'' 뉴런 및 축삭 사멸을 분석하기 위해 채택적으로 전달될 수 있습니다14,15. 이러한 생체 내 실험을 수행하는 것은 다발성경화증의 일부 병태생리학적 측면을 모방하는 데 큰 도움이 되지만, 이 접근법은 축삭 손상 및 신경 세포 사멸의 기본 메커니즘과 동역학을 해결하는 데 적합하지 않습니다.
이러한 제한을 극복하기 위해 희소성 수지 세포가 지시하는 CD8+ T 세포 공격 후 신경 세포 사멸의 메커니즘과 시간 경과를 연구하기 위한 생체 외 접근법이 확립되었습니다. 희소돌기아교세포와 그에 따른 미엘린 수초 생산만이 면역 세포에 의해 표적화되어야 하기 때문에, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-반응성 OT-I Tcell이 사용된다16. 이 세포는 이후에 희소돌기아교세포(ODC-OVA 마우스)에서 OVA를 선택적으로 발현하는 마우스에서 얻은 뇌 절편으로 전달됩니다(17).

<table><tbody><tr><td>12-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 여과기</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>염화칼슘</td></tr><tr><td>CD8+-isolation kit</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-859</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>Merck</td><td>1.08337.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-151</td><td>태아 송아 혈청</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td>염화칼륨</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td>탄산수소칼</td></tr>륨 <tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td>황산마그네슘</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>염화나트륨</td></tr><tr><td>NaH < > 2 PO 4 * H 2 O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td>인산 수소 나트륨</td></tr><tr><td>NaHCO 3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>탄산 수소 나트륨</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>수산화 나트륨</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>시그마</td><td>213330</td><td>염화 암모늄</td></tr><tr><td>비 필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>OVA (257-264)</td> <td>Genscript</td><td>RP10611</td><td>ovalbumin</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>시그마</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>머크</td><td>1.07687.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 내 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 t 세포 공격의 모델

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

뉴런과 축삭돌기의 파괴를 동반한 희소돌기아교세포의 사멸은 다발성 경화증(MS)과 같은 염증성 탈수초 질환의 피질 및 피질하 회백질 병변에서 전형적인 조직병리학적 소견입니다. 이러한 질환에서는 주로 미엘린 및 희소돌기아교세포 관련 항원에 대한 추정 특이성을 가진 CD8+ T 세포가 발견되므로 회백질 병변의 신경 세포 사멸은 이러한 세포의 부수적 효과일 수 있습니다. 언급된 병태생리학적 과정의 기저에 깔린 메커니즘을 연구하기 위해 다양한 유형의 동물 모델이 확립되었습니다. 그러나, 그것들이 다발성경화증의 일부 측면을 모방한다 하더라도, "담보적" 신경세포 사멸의 정확한 메커니즘과 시간 경과를 해부하는 것은 불가능합니다. 이 과정을 다루기 위해 여기에서는 희소돌기아교세포가 지시하는 CD8+ T 세포 공격 후 신경 손상의 메커니즘과 시간 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 미엘린 수초(myelin sheath)와 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)만을 표적으로 하기 위해, 시험관 내 활성화 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 급성으로 분리된 뇌 절편으로 전달합니다. 정의된 잠복기 후, 미엘린과 신경 손상은 다른 관심 영역에서 분석될 수 있습니다. 이 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.

희소 돌기 아교 세포 지시 CD8 + T 세포와 뇌 조각의 배양 후, 희소 돌기 아교 세포뿐만 아니라 신경 세포 사멸 (도 2a 및도 1C, 각각을) 받다. 아폽토시스 학적 징후 (예, 카스파 제 -3, Tunel에)은 초기 배양은 3 시간 후에 검출 될 수있다. 부화 기간은 준비하고 재현 가능한 결과의 좋은 품질을 보장​​하기 위해 더 이상 8 시간 이하 여야한다. 사멸 세포는 모든 유수 지역에서 우세와 조각을 통해 찾을 수 있습니다. 구조적 무결성 및 세포 사멸 신경 세포의 조각의 대표적인 조직 학적 염색은 그림 1A-C에 도시되어있다. 결과 파라미터를 평가하기위한 관심의 인큐베이션 동안 상이한 시간 점들이있다. 본 연구실에서 수행되는 전형적인 시간 경과 후에는, 즉, 세포 - 세포 상호 작용이 시간 0에서, 다음 3, 4, 6 시간 (최대 상호 작용이 관찰) 분석 파라미터들을...

염증성 탈수초성 질환의 피질 병변에서 탈수초화 및 신경 세포 사멸의 메커니즘을 다루기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 여기에서는 뇌 절편에 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 사용하여 희소돌기아교세포 및 신경세포 사멸을 초래하는 생체 외 접근법을 설명합니다. 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.

생체 내 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 외 CD 8 T 세포의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 유도 공격을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 비장에서 CD 8 T 세포를 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 급성 뇌 절편을 준비하는 것입니다.그런 다음 뇌 절편을 활성화된 CD 8개의 T 세포와 함께 최대 6시간 동안 배양한 다음 냉동 보존 및 조직학적 연구를 수행합니다. 궁극적으로 면역형광 현미경 검사는 T 세포의 위치와 희소돌기아교세포의 세포사멸을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 가벼운 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염과 같은 기존 기술에 비해 이 방법의 주요 장점은 뉴런 손상입니다.CD 8 매개된 희소돌기아교세포 공격에 대해 자세히 연구할 수 있습니다. 이 방법은 조직 내 면역 세포 이동이나 뉴런 및 희소돌기아교세포의 변성과 같은 신경 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생인 Alexander Hamman이 할 것인데, 뇌 절편을 준비하기 5일 전에 OT one T 세포를 자극하여 세포를 활성화시킨다.먼저, 시력 프로토콜에 따라 여러 O OT one 형질전환 마우스의 비장을 제거합니다. 갓 준비되고 보충된 배지에 비장을 수집합니다. 다음으로, 70미크론 스트레이너를 통해 비장을 으깨서 단일 세포 현탁액을 만든 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 300Gs에서 현탁액을 원심분리합니다.원심분리 후 상등액을 붓고 5ml의 염화암모늄 칼륨 완충액에 세포를 재현탁합니다. 세포가 이 완충액에서 섭씨 4도에서 5분 동안 배양하여 적혈구를 용해시키도록 합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10밀리리터의 보충 매체를 추가하여 반응을 종료합니다.그런 다음 이전과 같이 세포를 회전시켜 다시 수집합니다. 그런 다음 펠릿화된 세포를 수집하고, 재생하고, 배지에 현탁시키고, 밀도가 알려지면 계수합니다. 세포를 well당 3,000만 개의 세포로 12 Well 플레이트로 옮깁니다.그런 다음 OVA와 인터루킨 2가 포함된 배지를 추가하고 4일 동안 세포를 배양합니다. 4일 후, 밀리리터당 500단위의 농도로 인터루킨 2를 더 첨가하십시오. 그런 다음 하루 더 세포를 배양합니다.이제 CD 8 positive T cell isolation kit를 사용하여 배양된 세포에서 O OT one T cell을 정제합니다. 간단히. CD가 아닌 8개의 양성 세포는 항체 칵테일을 사용하여 고갈되고 자기 컬럼을 사용하여 분리됩니다. 이 과정에서 얼음 위에서 샘플을 준비하고 반응에 단일 세포만 포함되도록 하여 컬럼이 막히지 않도록 합니다.그런 다음 셀을 세십시오. 이 실험의 경우. 8주에서 10주 된 유전자 변형, O-D-C-O-V-A, 생쥐 및 연령 및 성별이 C 57 블랙 6 대조군과 일치했습니다.평소와 같이 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 병원균이 없는 환경에 쥐를 수용합니다. 생쥐를 마취한 후 뒷발 꼬집음을 사용하여 마취 수준을 평가한 다음 즉시 안락사시킵니다. 이제 쥐를 복부에 배치하고 두피를 소독하고 목을 베십시오.다음으로, 재빨리 두피를 자르고 두개골을 열고 뇌를 퍼냅니다. 접착제를 사용하여 뇌를 제자리에 고정하고 비브람 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 접시에 얼음처럼 차가운 생리식염수를 채웁니다.준비가 되면 300미크론 조각을 자릅니다. 슬라이스를 A CSF로 채워진 12 또는 24 웰 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 각 슬라이스에 50만 개의 OT one T 세포를 조심스럽게 첨가합니다.50만 개의 활성화된 세포는 우수한 세포 상호 작용을 제공합니다. 세포가 생성되면 세포가 슬라이스로 이동하기 시작합니다. 동시에 세포의 양이 과잉 반응을 유발할 정도로 높지 않으므로 단일 세포 계수가 가능합니다.모든 웰을 적재 한 후, 배양 후 최대 8 시간 동안 공동 배양을 배양하고 슬라이스를 수확하여 OCT 화합물에 내장합니다. 그런 다음 포함된 조각을 액체 질소에 동결하고 추가 조직학적 연구를 위해 섭씨 영하 20도에서 보관합니다. 희소돌기아교세포가 유도한 CD 8개의 양성 T 세포로 뇌 절편을 배양한 후, 희소돌기아교세포는 세포사멸을 겪었습니다.뉴런도 세포사멸(apoptosis)을 겪었습니다. 세포사멸의 가장 초기 징후는 배양 3시간 후에 나타났으며 8시간 후에는 견고했습니다. 세포사멸은 다른 어떤 조건에서보다 OT one T 세포에 노출된 O-D-C-O-V-A 세포에서 더 두드러졌습니다.이 절차에 따라 T 세포 이동 행동 또는 실험실 안검하수에서 이온 채널의 관여에 관한 질문에 답하기 위해 추가 방법을 적용할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 급성 뇌 절편을 준비하는 방법과 T 세포와 공동 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

an-ex-vivo-model-an-oligodendrocyte-directed-t-cell-attack-acute

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 rhinal cortex-hippocampus organotypic slices에서 신경 세포 사멸을 평가하는 기술을 보여줍니다. 신경 세포 사멸은 생체 내 간질과 유사한 진화하는 간질 발작을 통해 발생하며, 프로피듐 요오드화물과 면역 형광을 사용하여 죽은 세포의 이중 염색을 통해 감지됩니다.

생체 외 간질 모델에서 세포 사멸을 평가하기 위한 신경 세포 사멸 분석

이 비디오는 세포독성 CD8+ T 세포를 통해 매개되는 뇌세포 사멸을 유도하는 생체 외 기술을 보여줍니다. 뇌 절편을 얻으면 활성화된 희소돌기아교세포 지향 CD8+ T 세포가 절편으로 전달되어 미엘린 수초와 희소돌기아교세포를 표적으로 합니다. 배양 후, 미엘린과 신경 세포 사멸에 대한 손상은 관심 영역에서 조직학적으로 평가할 수 있습니다.

희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 통해 신경 세포 사멸을 유도하는 생체 외 기술

우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

전뇌와 소뇌의 슬라이스 배양 시스템을 사용하여 NG2 세포와 희소돌기아교세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다.  이 방법을 사용하면 조직 세포 구조를 유지하면서 세포 외 환경을 쉽게 조작할 수 있는 희소돌기아교세포 계통 내에서 세포의 증식 및 분화 역학을 조사할 수 있습니다.

Organotypic 슬라이스는 문화 희소 돌기 아교 세포 역학 및 수초화을 공부하기

구형세포는 현재 효과적인 장기 치료법이 없는 백혈구이영양증인 크라베병의 특징적인 병리학적 특징입니다. 우리는 활성화된 미세아교세포의 선천적 생물학 및 병원성 잠재력과 구형세포로의 변형을 연구하기 위해 세포 배양 모델을 개발했습니다.

체외 Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

Myelinating oligodendrocytes는 급속 한 활동 전위 전파 및 신경 생존을 촉진합니다. 여기에 설명 된은 organotypic에 형광 단백질의 oligodendrocyte 특정 식에 대 한 프로토콜 후속 시간 경과 화상 진 찰과 뇌 조각입니다. 또한, 흠 없는 수 초를 시각화에 대 한 간단한 절차 제공 됩니다.

시각화 및 Adeno 관련 바이러스 및 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 Organotypic 뇌 조각에서 Oligodendrocyte 세포의 라이브 영상

선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

우리는 유기형 뇌 슬라이스 모델에서 유방암 뇌 전이성 세포의 실시간 약물 및 방사선 반응을 측정하기위한 프로토콜을 소개합니다. 상기 방법은 뇌 미세환경 계면 내에서 생체외 방식으로 유방암으로부터의 뇌 전이에 대한 다양한 치료법의 치료 효과를 조사하기 위한 정량적 검정을 제공한다.

유방암 뇌 전이성 종양 성장을 연구하고 표적으로 삼는 Ex Vivo 뇌 슬라이스 모델

배우세요 생체 외에서 CD8+ T세포가 희소돌기아교세포를 공격하여 탈수초화와 신경세포 사멸을 일으키는 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 신경면역학 연구에 활용됩니다.

생체 내 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

더 많은 동영상 탐색