일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

이 절차의 목표는 전기천공법을 기반으로 하는 방법을 사용하여 살아있는 미생물 내부에 유기 Fluor로 표지된 DNA 또는 단백질과 같은 생체 분자를 내부화하고 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 전기천공법으로 전환하기 전에 형광 표지된 생체 분자로 전기 역량 세포를 배양함으로써 이루어집니다. 수맥에 고전압을 가함으로써 세포벽과 세포막 모두에 일시적인 기공 형성이 있어 생체 분자가 세포로 확산될 수 있습니다.

다음으로, 세포는 과도하게 내재화되지 않은 생체 분자가 제거되기 전에 회복할 수 있도록 풍부한 배지에서 배양됩니다. 마지막으로, 세포를 낮은 형광 최소 영양소 발생 패드로 옮긴 다음 유리 커버 슬립을 위에 덮어 유리 그로 샌드위치를 형성합니다. 궁극적으로, essence microscopy는 살아있는 세포 내부에서 표지된 생체 분자의 위치, 확산 패턴 및 동적 특성을 분석하는 데 사용됩니다.

이 방법에 대한 아이디어는 라이브 셀 이미징의 한계를 깨달았을 때 처음 떠올랐습니다. GFP와 같은 광형광 단백질의 빠른 결함으로 인해, 우리는 유기 형광력으로 표지된 생체 분자로 살아있는 세포를 적재함으로써 살아있는 미생물에 이식할 것이라고 추론했습니다. 이 힘의 주요 장점은 밝기, 사진 안정성 및 작은 크기입니다.

그런 다음 우리는 훨씬 더 긴 시간 척도로 원래 환경에서 DNA 또는 단백질의 국소화 및 확산을 추적하기를 희망하며, 이는 많은 중요한 생물학적 과정과 일치할 것입니다. 미세주입과 같은 기존 방법에 비해 이러한 기술의 주요 장점은 일반적인 미세주사 바늘의 직경보다 작은 미생물에도 적용할 수 있다는 것입니다. electroporation의 또 다른 이점은 많은 수의 세포가 형광성 유생분자로 동시에 적재되고 electroporation를 특히 눈 처리량 기술 시키는 그들을 평행하게 구상할 수 있다 입니다.

이 방법은 생체 내에서 형광 표지된 생체 분자의 확산 및 역학 거동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 표지되지 않은 전극 생체 분자와 같은 다른 상황에서도 적용할 수 있지만, 예를 들어 세포에 의해 내부화될 때 생리학적 반응을 유발할 수 있습니다.박테리아 또는 효모 형광 현미경을 위한 aros pad를 구성하려면 약 2개의 낮은 형광 배지를 준비하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 실험실 전자 레인지로 증류수에 2 % aros의 용액을 즉시 녹입니다. 뜨거운 HA 장미의 일치하는 부피 하나를 매체에 추가하고 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 기포 형성을 피하고 즉시 약 200 마이크로 리터의 발생 혼합물을 표준 크기의 현미경 커버 슬립에 피펫으로 넣으십시오.

겔이 굳을 때까지 또는 임시 보관할 때까지 커버 슬립을 실온에서 1분 동안 벤치에 두고, 두 번째 청소된 커버를 새 패드 위에 올려 놓고 낮은 이온 강도 완충액에서 준비된 형광 생체 분자 스톡부터 시작하여 달걀 장미의 플라스까지 위에서 부드럽게 압력을 가합니다. 최대 5마이크로리터의 생체 분자를 20마이크로리터의 유익한 박테리아 분취량 또는 50마이크로리터의 유익한 효모 세포로 전달합니다. 세포와 함께 배양된 형광 생체 분자의 양은 세포당 내재화된 생체 분자의 양과 직접적인 상관

전기천공(electroporation) 후, 혼합물을 얼음 위에서 최대 10분 동안 배양합니다. 동시에 적절한 전극 간격의 electroporation vete를 선택하고 얼음에서 식힙니다. 세포 혼합물을 미리 냉각된 vete로 옮깁니다.

베트를 몇 번 부드럽게 두드려 용액에서 거품을 제거합니다. 종이 타월로 수의에서 수분을 제거하고 수의사를 전기 장치에 넣습니다. 이 과정 직후에 세포에 고전압 펄스를 가하십시오.

전기 장치에 표시되는 시간 상수가 4밀리초에서 6밀리초 사이인지 확인합니다. 낮은 시간 상수는 종종 qve 내에 과도한 염 또는 기포가 존재하기 때문이며, 이는 세포로의 생체 분자 흡수를 감소시키거나 완전히 억제할 수 있습니다. 더 높은 전압 펄스는 세포 부하를 개선하지만 전기천공법 직후 세포 생존력에 영향을 미칠 수도 있습니다.

500마이크로리터의 리치 배지를 추가하고 세포를 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도의 박테리아 또는 섭씨 29도의 효모를 2분에서 10분 동안 배양하여 세포막이 회복되도록 합니다. 생체 분자 통합 및 성장 회복 후 섭씨 4도의 사전 냉각 원심분리기에서 1분 동안 세포를 회전시키고 앙와위 제제 Reese를 버립니다.

펠릿을 500마이크로리터의 완충액에 현탁시키고 스핀 다운 세이트 및 제거 및 완충 현탁액 회수 과정을 반복합니다. 세 번 더. 이러한 세척 단계는 세포 현탁액에서 내재화되지 않은 생체 분자의 모든 흔적을 제거합니다.

표지된 단백질의 경우, 세포 현탁액을 상단에 0.22 미크론 멤브레인 필터가 장착된 1.5 ml 튜브에 피펫팅하여 추가 정제 단계를 수행합니다. 원심분리를 통해 완충액에서 세포를 분리하는 동시에 세포 건조를 방지하고 유동 분획을 버리기 위해 필터 위에 충분한 액체가 남아 있는지 확인합니다. 필터 아래에서 세포 위에 500마이크로리터의 새 PBS를 추가하고 스핀 다운과 새 PBS 에디션의 조합을 반복합니다.

두 번 더. 3, 300G에서 1분 동안 최종 스핀다운을 수행합니다. 이전 PBS 세척을 제거하려면 150마이크로리터의 PBS로 셀을 다시 현탁합니다.

마지막으로 미리 만든 아로스 패드에서 상단 커버 슬립을 제거합니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 떨어뜨려 패드에 세포를 로드합니다. 어로즈 패드 위에 세척된 새 커버 슬립을 놓으면 샌드위치 셀이 이제 형광 현미경을 사용할 준비가 된 것입니다.

전기 등급이나 배양되지 않은 라벨링된 생체 분자 또는 빈 세포로 배양된 비정격 대조군과 같은 음성 대조군도 로드된 샘플과 병렬로 준비해야 하며, 로드된 세포는 적절한 형광 현미경에서 이미징할 수 있습니다. 광시야 이미징 모드를 사용하면 세포 수준 이미징 및 분석이 가능하지만, 잔디 또는 높은 저조도 또는 단일 분자 관찰 및 추적에 최적입니다. 생체 분자의 과도한 광표백을 방지하기 위해 샘플을 로딩하기 전에 모든 무대 위의 레이저 조명을 끄거나 불투명 필터로 차단하십시오.

또한 E-M-C-C-G 카메라 게인을 꺼서 카메라의 과다 노출 손상을 방지하십시오. 도립 현미경 설정의 경우 Aris 패드 샌드위치를 현미경 s에 놓습니다.tage 셀로 덮인 면이 하단 대물렌즈를 향해 아래쪽을 향하도록 합니다. 그런 다음 윗면 할로겐 광을 켜고 레이저를 켜기 전에 투과된 백색광 현미경 모드에서 세포에 초점을 맞추고 백색광 투과 모드에서 세포를 사진으로 찍습니다.

이 사진은 생체 분자 형광 영역과 동일한 시야 내에 있는 세포의 실제 위치 간의 상관 관계를 나타내는 위치 참조 맵으로 사용됩니다. 생존력 측정을 위해 최적의 온도로 설정된 대물 히터를 사용하고 스테이지를 이동하지 않고 30분마다 백색광 조명 아래에서 동일한 시야의 순차적 이미지를 기록하고, 상단 조명을 끄고, 실험실의 다른 모든 주변 광원으로부터 샘플을 보호하십시오. 그런 다음 CCD 카메라를 켜고 데이터 수집을 시작합니다.

레이저 조명을 켜기 직전에 형광 이온 기록을 시작하십시오. 형광 현미경 검사를 수행한 후 이미지 J와 같은 이미지 처리 소프트웨어로 모든 사진을 열어 데이터 분석을 시작하여 설정 버튼을 눌러 모든 이미지에서 밝기 또는 대비와 같은 모든 기본 이미지 매개변수를 정규화하기 시작하고 다른 모든 이미지로 전파를 선택합니다. 옵션 1은 로드된 셀이 주어진 이미지에 대한 음성 대조군으로 사용된 전기천공되지 않은 셀보다 훨씬 더 밝아야 하므로 셀 로딩이 성공적이었는지 정성적으로 확인할 수 있습니다.

자유형 선택 도구를 사용하여 손으로 그린 다각형으로 형광의 다른 영역을 둘러쌉니다. analyze(분석) 메뉴에서 measurement option(측정 옵션)을 선택하여 모든 관련 polygons 간의 형광 강도를 비교합니다. 이 과정을 수동으로 반복하거나 자동화된 스크립트를 사용하여 각 샘플과 음성 대조군에 있는 모든 세포의 픽셀당 강도를 추출합니다.

전기 등급 셀에 하나 또는 여러 개의 형광 생체 분자가 로드되면 평균 방출 강도는 음성 대조군 샘플의 평균 강도보다 커집니다. 세포 생존력을 평가하려면 분열하지 않는 세포와 손상된 세포가 손상되지 않은 세포로 온전하게 분열하는 비율을 수동으로 계산합니다. 여러 분할에 걸쳐 30분마다 데이터가 기록되는 동일한 시야에서, 특히 생체 분자가 빠르게 확산되거나 세포에 5개 이상의 표지된 생체 분자가 적재되어 있는 경우 세포당 내재화된 생체 분자의 수를 직접 계산하는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다.

세포 기반 광표백 분석을 통해 이러한 조건에서 세포당 표지된 생체 분자의 수를 평가할 수 있습니다. 자유형 선택 버튼을 사용하여 주어진 형광 세포의 윤곽을 추적하고 광표백 효과로 인한 시간 함수로 원시 세포 형광을 추출하고 플롯합니다. 강도 대 시간 그래프는 기하급수적으로 감소하는 곡선과 부하가 많은 세포가 될 것이지만 10개 미만의 생체 분자를 포함하는 세포의 경우 명확한 단계를 구별할 수 있어야 합니다.

타임랩스 시리즈의 마지막 50개에서 100개의 이미지 프레임이 될 수 있는 실험의 평평한 꼬리 끝 부분 근처의 원시 형광 강도 값을 평균화하여 광표백 후 평균 자가형광을 계산합니다. 기준선도 강도도 결정한 후 원시 형광 데이터에서 기준선 자가형광을 빼서 시간에 따른 광백화 강도를 계산한 다음 결과 광표백 강도 데이터를 차단하고 수동으로 또는 알고리즘을 사용하여 각 단계의 높이를 양자화합니다. 이 과정은 평균 단계 고도의 정확한 추정치를 얻기 위하여 전체적으로 100개 단계 이상을 나타내는 몇몇 세포를 위해 반복되어야 한다, 이 가치는 단 하나 fluoro four의 표백 때문에 unitary fluoro 4 강렬에 대응한다.

마지막으로, 세포당 내부화된 분자의 수는 시간에 기준선에서 뺀 세포 강도를 0으로 나누어 계산할 수 있습니다. 이 electroporation 프로토콜에 대한 4가지 강도. 박테리아 또는 효모로 내재화될 수 있는 형광 표지된 DNA 또는 단백질의 양은 전기천공법 완충액 내에 존재하는 DNA 프로브의 양을 조정하여 제어할 수 있습니다.

생체 분자 내재화 속도가 높을 때, 먼저 형광 강도를 시간 함수로 표시한 다음 지수 시간 상수를 추출하여 찾을 수 있는 표지된 생체 분자의 광표백 수명은 in vivo 염료의 광 안정성에 대한 정보를 제공합니다. 낮은 혼입 비율의 경우, 형광 강도의 양자화는 주어진 세포 내의 생체 분자의 총 수를 근사화하는 수단을 제공할 것입니다. 전기천공법은 단백질을 박테리아나 효양에 통합하는 데에도 사용할 수 있습니다.

형광 표지된 단백질의 경우. 유리 형광단(free fluorophores) 자체는 매우 효율적으로 내재화될 수 있기 때문에 단백질 스톡에서 과량의 유리 형광단(free fluorophores) 및 공유결합(non covalently attached fluorophores)을 모두 제거하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 우리 분자에 의해 이중으로 표지된 것은 몇 초 동안 살아있는 세포에서 단일 분자 프렛 관찰을 가능하게 하는 방법을 사용하여 내부화할 수도 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안, 전기천공되거나 표지된 분자로 배양되지 않은 표지된 생체 분자 또는 빈 세포와 같은 비전기 세포와 같은 대조군 샘플도 준비하고 분석하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 통제를 통해 세포 자가형광 수준과 세척 단계의 결핍을 평가할 수 있으며, 따라서 개발 후 전기천공법 실험이 성공적이었는지 여부를 평가하는 데 필요합니다. 이 기술은 생물물리학 및 제3생물학 분야의 연구자들이 살아있는 미생물에서 표지 생체 분자의 확산 및 동적 거동을 탐구할 수 있는 새로운 길을 열었습니다.

그리고 이것은 GFPs와 같은 자가형광 단백질보다 1-2 자릿수 더 긴 시간 척도입니다. 이는 생체 내 유기 d 라벨링의 유연성을 전달하여 살아있는 세포의 분자 내 및 분자간 역학 연구를 위해 단일 분자 위협 실험을 훨씬 더 실현 가능하게 만들었습니다.