Name: 일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 학습하세요 생체분자 형광 표지 및 전기천공을 이용한 미생물 내 도입법을 통해 DNA와 단백질의 생체내 역학을 실시간 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 세포생물학 연구에 새로운 가능성을 제공합니다.

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토론에 참여해 주신 Stephan Uphoff님께 감사드립니다. 
R.C.는 옥스퍼드 대학의 Linacre College의 지원을 받았습니다. A.P.는 German Academic Exchange Service (DAAD), German National Academic Foundation 및 EPSRC의 지원을 받았습니다. M.S.는 Wellcome Trust의 지원을 받았습니다. A.N.K.는 UK BBSRC 보조금 (BB/H01795X/1)과 European Research Council Starter 보조금 (261227)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
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많은 매개 변수는 셀 전기 및 데이터 수집 관심 생물학적 시스템 및 실험 (셀 레벨 또는 단일 분자 분석)의 정확한 성질에 따라 동안 변화 될 수있다. 세균 내로 DNA를 electroporating 때 예를 들어, 표지 된 dsDNA 단편의 0.25-5 pmol의이 (미리 photobleaching에 대한 필요없이, 즉.) 직접 단일 분자 검출을 허용하는 내재화 낮은 효율에 이르게. 5 pmol의 dsDNA보다도 무겁게 단일 세포 - 세포 분석을위한 체계가 더 적합로드되는 경향이있다. 표지 된 DNA는 모든 이전에 겔 - 정제 된 자유 염료의 흔적을 제거하기 위해 있어야 DNA 스톡 용액으로부터 (형광 비 반응). 게다가, 특히 smFRET 실험에 대한 DNA 저하, 잠재적 인 문제, 부 자연스러운 핵산, 또는 머리 핀의 자형 루프로 엑소 뉴 클레아 접근 말단을 보호 모티브의 DNA를 사용하여 해결할 수 있습니다. 또 다른 adjustabl일렉트로 목록 매개 변수는 E 일렉트로 동안인가 전계 강도이다. 낮은 전계 강도 (~ 1 kV의 / cm)는 단일 분자 연구에 적합한 낮은 부하 효율로 이어질 것입니다. (1.8 kV로 / cm까지) 더 높은 전기장 세기가 적재 효율을 증가시킬 것이다; 그러나, 전기 천공 후 전기장 세기 및 세포 생존율 사이의 역 상관 관계가있다 (도 4 참조). 참고로, 박테리아, 효모 및 전기 천공에 사용되는 통상의 전계 강도는 ~ 1.5 kV로 / cm이다. 시정 방울 즉시 임의의 아킹 현상이 발생 큐벳으로 보낸이 붕괴의 길이를 나타내는 시간 상수는, 따를 편리한 파라미터이다. 정상 설정에서 시간 상수는 4 밀리 초보다 커야한다; 낮은 값은 낮은 부하 효율 또는 비로드 손상된 세포로 이어질 것입니다. 대부분의 electroporators 모두 조정 수정할 수 있습니다 (예 : &quot;펄스 절단&quot;또는 &quot;펄스 모양&quot;등의) 자유의 다른 학위를 제공셀 로딩과 생존. 그러나 우리는 유사한 절차 또한 멤브레인 (단일 지질 이중층) 실제로는 덜 복잡하고 전기부터 이미 세포와 함께 사용되어 있기 때문에 적절한 electroporator 설정을 사용하여 포유 동물 세포에 표지 된 생체 분자의 내면화를 허용해야합니다, 모두 박테리아와 효모에이 방법을 적용 (21). 표지 단백질을 내면화 할 때, 모두 무료 염료 표지 단백질 원액 이전 전기에서 제거해야합니다. 자유 염료 분자가, 그들의 더 ​​작은 크기에, 관심있는 단백질의 내재화를 통해 우선적으로, 그리고 (자신의 확산에도 불구하고 예상 빠른) 데이타 분석에서 구별하는 것이 어려울 수있다. 유기적 표지 단백질의 샘플에 대한 설명서는, 전기 천공에 적합하도록, 자유 염료 잔량이 2 % 미만이어야 22 (SDS-PAGE의 형광 주사를 사용하여 검출). 이 프로세스는 특히 중요일부 분자는 일렉트로 세균이나 효모의 외막에 충실 할 수있다. 이러한 관점에서, 음성 대조군 샘플 (임의 형광 표지 된 생체 분자와 함께 배양이나 전기 천공되지 않은 세포도 2) 빈 셀의 자기 형광도 수준 이상적으로 낮은 전기 천공 세포보다 분명히 낮은 셀당 형광 강도를 표시한다. dsDNA와 마찬가지로, 표지 단백질의 내재화 효율 일렉트로 이전 세포에 첨가 된 생체 분자의 양에 연결된다. 그러나, 이러한 크기 및 전하와 같은 다른 파라미터들은, 내재화의 역​​할을한다. 작은 단백질은 더 큰 단백질 반면 (그림 5) (26) (98 kDa의까지) 성공적으로 내면화 될 수 있지만, 낮은 효율, 높은 국제화 효율을 나타낸다. 단백질 isolelectric 점, 세포막 전위와의 상호 작용 또는 다른 물리 화학적 및 파라미터전기 동안 영향 셀 로딩. 그 결과, 사용자는 표지 단백질 (&gt; 50 μM)의 높은 초기 농도가 성공적으로 로딩을위한 최고의 기회를 줄 것이다 것을 알고, 자신의 시스템에 대한 실험을 최적화해야합니다. 전기도 교란 및 세포 (중 레이블 또는 레이블)에 단백질 등의 생체 분자를 도입하여 세포의 기능을 분석 할 수있는 새로운 도구를 제공합니다. 본 T7 RNA 폴리머 라제의 실험 (도 5C) 우리는 전기를 이용하여 생체 내에서 유전자 발현을 변경 생체 분자를 도입 할 수있다 등의 실험 예. 단일 분자 형광 실험 수행 때 커버 슬립면 (~ 100 ㎚) 상기 얇은 섹션 내 흥분 만 형광 의해 최상의 신호 대 잡음비를 제공하는 것처럼, TIR 조명은 일반적으로 다른 조명 모드를 통해 선호된다. 그러나 살아있는 미생물의 내부 확산 영상 표시 생체 분자는 다시 수첩 깊은 조도 (최대 E. 콜라이 0.8 ㎛이다). 높은 신호 대 잡음비를 유지하면서 깊은 조명은, 힐로 모드에서 달성된다. 한편, 넓은 시야의 촬상은 사용자가 높은 레이저 파워와 전체로드 셀 photobleaching에 및 생산 단위의 강도에 의해 초기 셀 형광 강도로 나누어 내재화 분자의 수를 예상된다 단계적 광표백 분석에 특히 중요 단일 분자 (단일 광표백 단계, 그림 3)에 의해. 그 궤적이 셀 전체 볼륨을 커버해도 위드 촬상 또한 관심 분자 확산 지역화하기 위하여 장기간 추적 분자 요구된다. 이 프로토콜에서, 우리는 전기, 세포에서 핵산을 전달하기위한 생물학 및 생화학의 표준 기법은 다양한 세포 유형에서 형광 생체 분자를 전달하기위한 간단한 방법을 구성하는 방법을 제시한다. 목소설, 높은 처리량 기술은 그 나라의 환경 표지 분자를 관찰 할 수있는 독특한 도구를 제공합니다. 형광 물질은 넓은 파장 범위를 포함 표지 또한 생체 분자에있어서, 이러한 비 천연 뉴클레오타이드 및 아미노산, 금속 킬레이트 제, 가교제, 및 caging 기 등 많은 화학 기, 변성 분자를 제공 할 수있는 전기. 관심있는 생물학적 시스템 세포 발달에 필수적이지 않으면 내재화 후 관찰 된 단백질은 세포 내 단백질 풀의 모든 (또는 대부분의) 표현을 보장, 표적 단백질을 코딩하는 유전자는 또한 삭제 될 수있다 (또는 노크 다운) . 본질적으로, 전기는 &quot;이식&quot;살아있는 세포로 체외 bioconjugates의 유연성 때문에 합성 생물학, 시스템 생물학에 노력하고, 생체 내 단일 분자 검출을 혜택을 누릴 수 있습니다.

살아있는 세포 내부의 대부분의 형광 연구는 GFP 1 형광 단백질 (FPS)와 단백질의 융합에 따라 달라집니다. 이러한 형광 태그는 유전자 발현 또는 2-7 수송 막 등의 처리에 관여하는 단백질의 카피 수, 확산 패턴 또는 지역화 연구를 허용한다. FPS는 높은 라벨 특이성, 쉬운 구현을 제공하며, 다양한 광 물리, 화학적 특성 1 변종의 큰 목록에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 유기 형광가 큰 광 안정성에 의한 시험 관내 실험에 대한 주요 선택을 유지 (최대 FPS보다 안정적 100 배) 8, 9, 작은 크기 (더 작은 FPS보다 볼륨 100 배에) 및 분자 표지의 용이성 (주로 시스테인 잔기의 사용을 통해). 이러한 모든 요소는 단일 분자 형광에 특히 중요하며, FRET (10)을 연구합니다. 여러 국제화 메소드 COMBIN유기 라벨링 및 생체 검출 장점을 보내고 것은 지난 10 년 동안 소개되었다; 그러나, 이러한 방법은 비 천연 아미노산 (15)의 사용을 필요로하거나, 예를 들면 (대형 단일 막 진핵 세포로 제한되어, 비교적 큰 폴리펩티드 태그 (예를 들어, TMP, 할로, 또는 20 kDa의 SNAP 태그) 11-14을 사용 하나. 로드, 주사기 로딩, 미세 주입) 16 ~ 19를 긁어. 이 프로토콜은 그 생체 내 관찰과 커플 유기 형광의 새로운 장점을 간단하고 높은 처리량 내재화 방법을 설명한다. 이 기술을 개발하기 위해, 우리는 일반적으로 예컨대 E. 같은 미생물을로드하기 위해 플라스미드 DNA (20, 21)와 함께 세포를 형질 전환하는 데 사용되는 전기 천공 절차를 채택 대장균 또는 S. 유기적 표시 생체 분자와 사카로 마이 세스 세레 비시 애. 이 프로토콜은 4 간단한 단계로 구성 세포의 배양을 표시 생체 분자와,전기, 세포 복구, 세포 세척이 아닌 내면화 된 생체 분자를 제거합니다. 여기서, 우리는이 전기 프로토콜뿐만 아니라, 셀 기반 및 단일 분자의 형광을 연구하고 신호를 안달 세포 이미징 데이터 분석 및 처리를 제시한다. 전기 천공은 생체 분자 (도 1) 셀 (20, 21)를 입력 할 수있는 과도 멤브레인 기공을 형성하기 위해 낮은 이온 강도 세포 현탁액을 가로 질러 고전압 전기장 방전에 의존한다. 다만 플라스미드 DNA로 형질 전환 박테리아 또는 효모와 같은 세포는 electrocompetency을 보장하기 위해 전기 천공 전에 제조되어야한다. 이 절차는, 물과 여러 세척 단계로 이루어지는, 막 투과성을 증가시키고, 전기 천공 큐벳 내의 아킹을 피하기 위해 세포 용액의 이온 강도를 낮춘다. 이 프로토콜에서, 세포 (PROTOCOL 참조 : 1.1)을 후술하는 바와 같이 제조 될 수 있거나 또는 상업적 공급자로부터 구입의. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg"> 그림 1 : 국제화 프로토콜의 도식 표현 왼쪽에서 오른쪽으로 :. electrocompetent 세포 (이중 표지 DNA 단편이 예에서 박테리아)의 나누어지는 레이블 된 생체 분자의 몇 마이크로 리터를 추가; 얼음에 1 분 10 품어과 미리 냉장 전기의 베트로 전송; electroporate 다음 직후 세포에 0.5 ml의 다양한 매체를 추가; 세포가 복구 할 수 있도록 37 ° C (또는 유기체에 필요한 온도, 예를 들어, 효모 29 ° C)에서 배양; 임의의 과량의 비 표지 된 내면화 분자를 제거하는 세척 단계 5를 수행; PBS 버퍼와 피펫 아가로 오스 패드에 10 μL의 100 ~ 200 μL의 최종 펠렛을 재현 탁; (와이드 필드 모드 또는 힐로 모드) 형광 현미경 커버 슬립 세정 및 이미지 패드 커버. (그림 1)을 허용하는 풍부한 매체에서 배양된다. 비 표지 된 생체 분자의 내재화 과량 제 염의 비교적 높은 농도의 일부를 함유하는 세제 세척 버퍼에 의해 제거된다 (3.3 PROTOCOL 참조). 염의 존재는 그렇게 외막에 붙어있다 내재화 비 표지 된 생체 분자에 의해 형성된 비 - 특이 정전 기적 상호 작용을 방해. 마찬가지로, 세척 완충액 세제의 존재하에 비특이적 소수성 상호 작용을 방해. DNA 내재화 (그림 2) 간단하지만,주의 사항은 전기를 사용하여 표지 단백질을 내면화 할 때 수행해야. 첫째, 유기적 표지 단백질의 주식 샘플은 여전히​​ 무료 염료의 작은 비율을 포함 할 수 있습니다. 무료 염료 분자는 단백질보다 훨씬 작고, 따라서 우선적으로 내면화 될 수 있습니다. 관찰 된 내면화 형광 분자의 대다수가 관심의 단백질에 대응되도록하려면 초기 단백질 샘플은 적은 2 ~ % 이상에게 무료 염료 (그림 5) (22)를 포함해야합니다. 비 표지 된 단백질의 내재화 과량 또한 일렉트로 후 세포 외막에 찌를 수있다; 이러한 현상은 특정 단백질이며, 각 새로운 단백질에 대해 확인을받을 필요가있다. 우리는 (: PROTOCOL 3.3.3 참조)로드 셀의 샘플 비 단백질의 내재화를 제거 할 수있는 여러 옵션을 제시한다. 마지막으로, 세포를 인산 완충액의 작은 부피에 재현 탁하고 형광 현미경에 자신의 이미징을 허용 아가 패드 상으로 피펫 팅한다. 아가로 오스 패드에 고정화는 간체입니다전자 및 무결성을 해치지 않고 커버 슬립에 세포 이미징의 효율적인 방법. 패드는 낮은 형광 문화 매체를 포함해야합니다. 셀 이미징은 하나 위드의 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 HILO를 사용하여 (높은 경사와 적층 광학 시트) 현미경을 수행 할 수 있습니다. 힐로 구성에서, 레이저 빔은 큰 신호 대 잡음비 (23)을 허용 위드로서는 전체 샘플을 아직 조명하지 않는,보다 TIRF 시험편 깊숙히. 사용되는 레이저 파워 및 시간 해상도에 따라, 바이오 분자 내재화는 (도 3을 단계적-photobleaching에 분석을 사용하여) 계산 국소 또는 24-28를 추적 할 수있다. 형광의 FRET 쌍으로 이중 라벨 구조의 내면화는 단일 셀 또는 단일 분자 수준 (그림 6)에서 FRET 모두의 정량화 할 수 있습니다. 다른 파라미터는 변경 될 수있다원하는 출력과 연구 생물학적 시스템에 따라 다릅니다. 첫째, 셀당 내재화 물질의 양은 종래 전기 세포 (도 2)에 첨가 표지 된 생체 분자의 농도를 변경하여 조정될 수있다. 전기 천공 전계 강도는 적재 효율 및 세포 생존 둘 다에 영향을 미친다; 예상대로 증가 전계 강도 적재 효율이 증가하면서, 일렉트로 세포의 생존율 (도 4A)을 감소시킨다. 두 매개 변수는로드의 비율을 기록 및 일렉트로 후 세포 분할함으로써 정량화 할 수있다. 형광 이미징과 함께이 생존 분석은 또한 살아있는 세포에 내재화 된 생체 분자의 관찰을 확인하고 여러 세대 (그림 4B)를 통해 지속적으로 관찰 할 수 있습니다. 요약하면,이 프로토콜은 형광 표지 된 DNA와 단백질 분자의 내면화로 할 수 있습니다대장균 또는 S. 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (26). 유기 형광으로 표지 개별 분자 크기의 순서 이상 FPS보다 시간 척도에 대한 높은 시공간 해상도로 추적 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 위드, TIRF 및 공 초점 검출뿐만 아니라 ALEX (레이저 여기 교번 28,29)와 같은 펄스 음원 방식과 호환 가능하다.

<table><tbody><tr><td>ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td><td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>또는 기타 상업용 또는 실험실 마법사 전기화학적 박테리아 또는 효모.</td></tr><tr><td>EZ Rich Defined Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>저형광 리치 미디어</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporation 장치&nbsp;</td>미생물 전이를 위한 <td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>또는 어떤 고아한 electroporator</td></tr><tr><td>증명서를 가진 분자 생물학 아가로스</td><td>Biorad</td><td>161-3100</td><td>아가로스 패드를 위한 낮은 형광 agarose</td></tr><tr><td>현미경 coverslips 1.5 간격</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>500°C에 로에 있는 가열해서 배경 입자를 제거하십시오; C for 1h</td></tr><tr><td>Single-molecule fluorescence microscope</td><td>REFs Localization software에 설명되어</td><td>있는 자체 제작</td><td></td></tr><tr>로컬라이제이션<td>분석을</td><td>위해 조정할 수 있는 맞춤형 온라인 MATLAB 및 C++ 소프트웨어 패키지.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>추적 소프트웨어</td><td>Blair와 Dufresne이 구현한 온라인</td><td></td> MATLAB 버전을 <td>사용할 수</td> 있습니다.&nbsp;</tr></tbody></table>

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

생체 내에서 생체 분자를 연구하는 능력은 생물학적 맥락에서 생체 분자의 기능을 이해하는 데 중요합니다. 한 가지 강력한 접근법은 GFP와 같은 형광 단백질에 관심 분자를 융합하여 이들의 발현, 국소화 및 기능을 연구하는 것입니다. 그러나, GFP 및 그것의 유래물은 시험관 실험에 일반적으로 사용된 유기 fluorophores 보다는 현저하게 더 크고 보다 적게 광안정성이고, 이것은 조사의 범위를 제한할 수 있습니다. 
우리는 최근에 전기천공법을 기반으로 하는 간단하고 다재다능하며 처리량이 많은 방법을 도입하여 유기 형광단으로 표지된 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있도록 했습니다. 여기에서는 전기천공법을 사용하여 표지된 DNA 단편 또는 단백질을 Escherichia coli 및 Saccharomyces cerevisiæ로 내재화하는 방법, 형광 현미경을 사용하여 내부화된 분자의 수를 정량화하는 방법 및 전기천공된 세포의 생존력을 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 데이터는 형광 또는 FRET를 사용하여 단일 세포 또는 단일 분자 수준에서 획득할 수 있습니다. 생체 내에서 생리학적 관찰 가능한 반응을 유발하는 표지되지 않은 분자를 내부화할 가능성도 제시됩니다. 마지막으로, 특정 생물학적 시스템에 대한 프로토콜 최적화 전략에 대해 논의합니다.

샘플 준비 프로토콜의 다른 단계는도 1에 도식으로 제시한다. 예를 들어, 우리는 이중 표지 (도너와 억 셉터 염료) DNA 단편의 박테리아 하중을 나타낸다. DNA 내재화를위한 대표 결과는 그림 2에 나타내었다. 각 electroporation하여 샘플의 경우, 빈 셀 및 비 electroporation하여 세포에 대한 데이터는 (그림 2)을 기록 하였다. "빈 셀은"생체 분자 형광하지도 않으며 전기 천공으로 세포를 배양하지 electrocompetent 대응함 채널에서의 형광 강도는 동일 실험 조건 (레이저 파워, 시간 해상도, 온도 등)에서자가 형광 수준을 반영한다. "비 일렉트로 세포"(또한 -EP, 즉 마이너스 EP)는 세포 형광 biomolec 함께 인큐베이션 된 electrocompetent되는 음성 대조군에 대응개 모듈 있지만, 일렉트로 없습니다. 이러한 비 - 세포를 전기 천공 빈 셀의 자기 형광로드와 유사한, 세포를 전기 천공에 의해 표시되는 형광 강도보다 상당히 낮은 형광 수준을 나타낼 것이다. 이것은 세포 외막에 접착 있었을 비 표지 된 생체 분자의 내재화 제거를 확인한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig2.jpg"> 그림 2 : 박테리아에서 서로 다른 농도에서 다른 형광 물질로 표지 dsDNA의 내재화 (AE) 및 효모 (F)를위한 대표 결과 왼쪽에서 오른쪽으로. 백색광, 형광 및 오버레이 이미지. - / + EP는 전기와 함께 / 않고 배양을 의미한다. 스케일 바 : 3 μm의. A. CY3B dsDNA, 10 pmol의, E. 대장균. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol의, E. 대장균. C. Alexa647 dsDNA 5 pmol의, E. 콜라이. D. CY3B dsDNA, 100 pmol의, E. 콜라이. E.의 ATTO647N ds는DNA, 100 pmol의, E. 대장균. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol의, 효모. 이 그림은 참조 (26)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 셀당 내면화 생체 분자의 수를 카운팅 절차는 함께 표지 된 DNA와 상이한 농도로 얻어진 대표적인 결과,도 3 및 보충이 영화에 제시되어 photobleaching에 분석을 이용하여 셀당 내면화 표지 된 생체 분자의 수를 추정한다. 셀 로딩 효율 인큐베이션 표지 된 DNA의 초기 량에 따라 증가, "단일 분자"수준 (&lt;10, 보충 영화 2B) "앙상블"수준 (&gt; 10로 조정하는 사​​용자에게 셀당 표지 된 분자의 수를 허용 , 보충 영화 2A). 로드 된 세포의 비율을 추정하는 방법은 강력한 t이고O, 비 - 일렉트로 세포의 평균 기포 강도 및 3 배에 달하는 표준 편차 (즉, 아베 (I-EP) + 3 * STDDEV (I-EP) 아베 = 평균 이상의 셀 강도를 표시하는 일렉트로 세포의 수를 세 I = 픽셀 당 강도, Dev.에. = 표준 편차 -EP = 비 일렉트로) (그림 3). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig3.jpg"> 도 3 :. photobleaching에 내재화 분석을 이용하여 분자의 수를 계수 (A)는 단일 셀 photobleaching에 분석. 형광 강도 timetraces의 예 (파란색 : 원시 데이터, 빨간색 : 적합; 세트 : WL과 전 표백 후 ATTO647N 표지 dsDNA로드 대장균의 형광 이미지). 탑 : 한 단계 백화 현상. 중동 : 표백을 보여주는 ± 3 분자를 포함하는 세포점멸. 바닥 : 적어도 10 분자에 대응&gt; 10 단계를 포함하는 셀 6 미만 구별 단계를 포함하는 셀 (57)로부터 자동 - 피팅 알고리즘 단계에서 한 단계 높이의 강도 (B)의 히스토그램.. 단일 가우스 착용감 초당 8100의 단일 광자 형광 강도에 대응하는, 11 ± 3 AU 중심된다. 별표는 위 또는 단일 형광 강도에 의해 초기 형광 강도를 나누어 계산 ATTO647N dsDNA 상이한 양으로 일렉트로 셀당 내면화 분자의 동일한 50 AU (C) 히스토그램 모든 단차를 수집 함을 표시한다. 위에서 아래로 : 빈 셀 (즉, 형광 분자로 배양되지 않고 일렉트로되지 않음), 비 일렉트로 (그러나 형광 분자라는 -EP 배양) 및 electroporation하여 세포가 10 100 pmol의 (EP + 이름) dsDNA와 함께 배양 하였다. 빈 비 일렉트로 세포 대응자가 형광에, 일렉트로 반면 세포 (≥ 4 분자 별표 마크 빈 참조) 100 pmol의에서 높은로드 셀의 높은 비율이 내면화 된 분자의 넓은 분포를 보여줍니다. 국제화 효율 10, 100 pmol의 샘플 (INT와 세포의 비율은. + 3 배 Dev.에. 비 -EP 샘플의 의미&gt;)는 각각 94 %와 90 %였다. 10 pmol의 dsDNA 121 ± 106 분자, 100 pmol의 dsDNA 176 ± 187 분자 : 셀 당 내면화 분자의 수를 의미한다. 설정 : 100 MS 노출, 위드 조명. 스케일 바 : 1 μm의. 이 그림은 참조 (26)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 셀 로딩과 생존 표지 된 생체 분자의 변화량 이외에 종래 전기 천공 세포에 첨가,사용자는 전기 중 (그림 4, 보충 동영상 1) 다른 필드 강점을 선택하여 조정 내면화 분자의 양을 수 있습니다. 높은 필드 강도는 더 국제화 효율성으로 이어질하지만 세포 생존 능력의 약간의 감소로 이어집니다. 단백질의 내재화를 들어, 여과 공정의 사용은 비 표지 된 단백질을 내면화 (3.3.3.1.1 참조)를 제거하는 데 도움이된다. 이러한 경우, 셀 여과 관측 형광 단백질이 실제로 박테리아 세포질 내부에서 내재화되는 것을 보장; 우리는 (자세한 내용은, REF 22 참조) 그러나, 여과는 세포 생존 능력에 부정적인 영향을 가지고 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig4.jpg"> 그림 4 : 셀 로딩과 생존시 전기 전압의 영향 (A)로드 effic에 전기 자기장 강도의 효과를 나타내는 막대 차트.iency (빨간색 막대)와 세포 (녹색 막대)의 생존. 37 ° C에서 아가 패드 1 시간 후 비 - 일렉트로 셀 (0 kV로 / cm)에 나누어 84 ± 8 %. 동일한 조건 하에서 78 ± 3 % 및 0.9 kV로 / cm 내지 1.8 kV로 / cm에서 전기 천공 셀 49 ± 3 %를 각각 1 시간 후 나눈다. 세포를 92 ± 6 %가 1.8 kV로 / cm에로드하는 동안 적재 효율, 셀 (73)은 ± 8 %, 0.9 kV로 / cm로 로딩된다. 오차 막대는 세 독립적 인 측정으로부터 계산 된 표준 편차를 나타내고; 200 개 이상의 세포는 각각의 샘플과 각각의 반복에 대해 분석 하였다. 여러 세대에 걸쳐 세포 생존을 약간 손해에 전기 전압 전반적인 적재 효율이 증가한다. (B) 형광 세포 기반 측정은 전반적인 형광 강도가 두 개의 딸세포간에 똑같이 공유되는 것을 보여준다. 셀 1과 2는 t = 0에서의 스케일 (왼쪽) 백색광 이미지에서 세포 수 및 형광 영상을 의미바 : 1 ㎛). 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다. 단백질 국제화 단백질 내재화를위한 대표 결과는도 5A &amp; B에 있습니다. 이것은 이전에 가능 일렉트로 같은 단백질 샘플로부터 가능한 나머지 (미) 염료를 가능한 많이 제거하는 것이 특히 중요하다. 도 5a &amp; B, CY3B 표지 클레 나우 단편 샘플 (KF는 대장균 DNA 중합 효소 I의 클레 나우 단편 CY3B-KF, 66 kDa의) 1 % 무료 염료를 포함의 예에서; 전체 셀 로딩에 염료의 기여는 무시할 수있다. 자유 염료의 등량 전기 천공 (표지 된 동일한 양의 단백질과 함께 배양) 비 일렉트로 세포 모두 관심 electroporation하여 샘플의 비교뿐만 아니라 세포 관찰 형광 분자되도록하여 두 개의 필수 구성 컨트롤참으로 표지 단백질을 내장되어 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig5.jpg"> 그림 5 : 라이브 박테리아의 단백질 국제화 (A) 뷰의 대표적인 형광 오버레이 필드.. 세포는 1 % 무료 CY3B 염료가 포함 된 단백질 원액에서 50 pmol의 RNAP ω 서브 유닛으로 1.4 kV의 전압에서 전기 천공. 비 전기 천공 (비 -EP)과 빈 셀은 이전과 같이 정의된다. 자유 염료 RNAP ω 일렉트로 샘플과 동일한 농도로 내재화시켰다. 1 mW의 (A)의 샘플에 대한 보정 세포 평균 강도의 50 밀리 노출. (B) 분포 넓은 필드 모드, 532 nm의 여기에서 이미징, 총 세포 수의 비율에 따른다. 샘플 당 400 개 이상의 세포를 분할했다. 이 수치는 참조 (22)에서 수정되었습니다. unla의 (C) 국제화T7 프로모터의 통제하에 pRSET-EmGFP 플라스미드 인코딩 에메랄드 GFP (EmGFP)를 들고 electrocompetent DH5α에이라고 표기 T7 RNA 중합 효소 (T7 RNAP, 98 kDa의). 왼쪽 : 분석의 개략도. 중동 : 형광 오버레이. 오른쪽 : 배양 및 T7 RNAP (아래)와 일렉트로 비 electroporation하여 샘플 (위)과 전지 셀 기반 형광 강도의 히스토그램; 일렉트릭 세포의 약 11 %가 높은 형광 강도 표시 (INT와 세포의 일부를.&gt; + 의미 배 Dev.에. 비 -EP 샘플의) EmGFP의 발현을 나타내는. 3 μm의 : 별표 위 또는 동일한 1,100 AU 스케일 바의 모든 강도를 수집 쓰레기통을 나타냅니다. 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다. 그림 5c는 단백질 전기의 또 다른 응용 프로그램을 제공합니다. 여기에, 일렉트릭 단백질은 레이블이없는, 그러나 그것의 내면화는 관찰 형광 반응을 트리거합니다. 이 실험은 사전 검증가 나타나지 않는 및 세포질에 electroporation하여 단백질의 기능을 제공합니다. 레이블이없는 T7의 RNA 중합 효소 (98 kDa의)는 E.으로 내면화되었다 T7 프로모터 (26)의 제어하에 형광 단백질 EmGFP위한 코드하는 플라스미드를 함유하는 대장균 균주 DH5α. T7 RNA 중합 효소의 유전자가 DH5α에 존재하기 때문에, 우리의 실험에서 EmGFP 식 기능 T7의 RNA 중합 효소는 전기 (그림 5C)를 통해 세포 내로 도입되어 있어야합니다. 1 pmol의 T7 RNAP, 세포의&gt; 11 %로 전기를 이하의 (청색 막대도 5C)은 음성 대조군보다 높은 형광 나타냈다 (T7 RNAP 동일한 양 배양을하지만 일렉트로 생략). 이 결과는 일렉트로 내재화 T7 RNAP 분자의 비율이 생체 내에서 자신의 무결성을 유지하고 세포질에서 의도 기능을 수행 할 수 있다는 것을 정한다. 생체 내에서 단일 분자 FRET및 단일 세포 수준 마지막으로, 살아있는 박테리아에 이중 라벨 종의 내재화 및 분석 3. 형광 단백질 융합 생체 내 smFRET 연구에 적합하지 않은 그림 6과 보충 영화에 제시되어, 전기를 사용하여 살아있는 세포에 이중 라벨 생체 분자를 제공 할 수있는 능력은 하나입니다 이 방법의 가장 큰 자산. 그림 6a는 단일 셀 (기증자 - 수용체 FRET 쌍으로 CY3B 및 Atto647N의 형광체를 사용하는) 다른 FRET DNA 표준로드 박테리아의 분석을 FRET 제공합니다. 세포는 0.17, 0.48의 명백한 FRET 효율 세 짧은 이중 표지 dsDNA FRET 기준의 20 pmol의 (E *)로 전기 천공하고, 0.86는 시험 관내 (이전 26 결정). 모든 DNA를 (그림의 6A, 왼쪽)와 각각의 단일 셀 E의 * 분포의 주 피크 효율적으로 세포를 입력합니다 (체외 결과와 잘 그림 6A를 동의, 오른쪽). 중급 및 고급 FRET 샘플에서는, 하부 아마도 인해 셉터 표백 광 물리 비활성, 가변 셀 로딩의 조합, 관찰 예상보다 E의 * (따라서, 가변 신호 대 잡음 비) 및 DNA 분해와 세포 집단 . <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig6.jpg"> 그림 6 :.. 단일 셀 및 단일 분자에 대한 대표 결과가 앙상블과 smFRET 연구 한 박테리아에 살고있는 박테리아에서 관찰 FRET 저를 보이는 각각의 세 가지 DNA FRET 기준의 20 pmol의로드 셀 (A) 분석 (~ 0.17) 중간체 (~ 0.48), 높은 (~ 0.86) FRET (체외 단일 분자 측정으로 측정 한, REF 26 참조). 왼쪽 : 흰색 빛과 그린 / 레드 (FRET) 형광 오버레이 이미지 (스케일 바 : 3 μm의). 다른 세포로부터의 FRET 값의 예는 (흰색) 표시된다. 조작 (위에서 아래로) HT :. 수정되지 않은 셀 기반 FRET (E *)는 DNA 표준을 FRET 기증자 만 (진한 녹색), 저 (밝은 녹색), 중간 (노란색), 고 (빨간색)에 대한 히스토그램 (B-D) 생체 smFRET합니다. 세포는 0.25 pmol의 중간 FRET DNA (패널 B), 0.25 pmol의 높은 FRET DNA (패널 C)와로드, 5 pmol의는 KF (패널 D)를 이중 표지. 왼쪽 열 : 전 수용체 광표백 후 단일 프레임의 그린 / 레드 형광 오버레이. 가운데 열 : 노란색 원 분자에 해당하는 시간을 추적합니다. FRET 효율, 기증자 방출 강도 및 수용체 방출 강도는 각각, 녹색, 파란색과 빨간색으로 표시됩니다. 오른쪽 열 : 기증자 만 분자 (녹색) 및 각 샘플에 대한 20 시간 추적에서 (노란색, 빨간색, 회색) 기증자 - 수용체 분자의 FRET 히스토그램. 스케일 바 : 3 μm의, B-D 1 μm의. 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다.208fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. DNA 또는 단백질 중급 및 하이 FRET DNA 표준 샘플, 소량 (0.25 pmol의) (그림 6B, C) ​​또는 FRET 쌍으로 이중 표지 KF (Alexa647 / CY3B의 형광의 5 pmol의 그림에 대한 생체 내에서 smFRET을 준수합니다 6D는) E.에 electroporation된다 대장균. 이러한 농도는 추적 및 단일 분자 모니터링 퍼즐, 직접 현지화를 허용, 몇 (N = 1-10) 표지 분자와로드 많은 세포로 이어졌다. 다른 사람이 움직이지 나타나거나 천천히 (보충 영화 3) 확산 반면 일부 분자는 자유롭게 확산. 1 ~ 30 초 동안 마지막과 smFRET의 특징을 보여 고정 이중 표지 생체 분자 (그림 6, 중)의 Timetraces : 예를 들어 수용체 표백시 기증자 및 수용체 형광 anticorrelated 변경 (, t는 ~ 16 초, 그림 6B, 중간 ), 단일 다음(예를 들어, t ~ 19 초, 그림 6B) - 스텝 기증자 표백. 이러한 timetraces (그림 6, 오른쪽)의 시험 관내 (in vitro) 연구 26,31,32 년에 출판과 매우 잘 일치에 평균 값의 결과에서 생성 FRET 분포. 이러한 결과는 내면화 된 DNA와 단백질의 정량 smFRET 연구에 대한 기능을 설정하고 (T7의 RNAP 국제화 실험에서 지원) 단백질이 전기 및 국제화에 자신의 무결성과 구조를 유지하는 것이 좋습니다. 보충 영화 1. 세포 생존 왼쪽 : 백색광 이미지. 오른쪽 : 형광 이미지. 애니메이션 GIF 10 pmol의의 Atto647 표지 DNA로드 박테리아의 전기 (1.8 kV의 / cm) 후 분열을 보여주는 애니메이션. 형광의 감소는 전반적인 명백 서로 부분적 중에 발생 광표백에 또한 세포 분열시 표지 된 DNA의 희석으로 인해이고측정. 보충 영화 2 : 세포 기반 광표백 연구 A.. (&gt; 100 Atto647N 표지 DNA 분자를 포함하는) 과도하게로드 셀의 대표적인 예. 왼쪽 위, 관심 (빨간색 사각형)의 셀의 백색광 이미지. 오른쪽 상단, 몇 분에 걸쳐 형광 붕괴를 보여주는로드 세포의 영화. 관심 셀의 전체 형광 강도 감쇠의 아래에, 시간 추적. 유기 형광 물질은 수명을 FPS보다 높은 크기의이 주문 (여기에, ~ Atto647N 41 초) photobleaching에 나타낼 수있다. 10 미만 표지 분자 (이 경우에는 3)로드 셀 B. 대표적인 예. 패널 A. 바닥, 단일 단계 표백을 보여주는 및 / 또는 단일 유기 형광에 해당 깜박 관심있는 셀의 전체 형광 강도의 시간 추적과 동일한 최고. 이 단계의 평균 높이가 ~ 여기 (단일 분자 단위 강도에 해당AU (12))은 셀 당 분자의 내재화 초기 수를 추정하기 위해 사용된다. 300 μW 전력에서 연속 적색 레이저 여기에서 영화와 프레임 당 100 밀리 초. 보충 영화 3 :. 나는 N 단일 분자 FRET 최고 생체 내 : 세포는 지속적으로 nTIRF 조명 아래 프레임 당 50 밀리에서 모니터 0.25 pmol의 (그림 6C에서와 같이) 고 FRET DNA는 1 mW의 녹색 (532 ㎚) 레이저를 사용하여로드. 각 프레임은 각 채널의 그린 / 레드 (FRET) 형광 오버레이입니다. 확산 및 움직이지 빨간색 (그대로)과 녹색 (단일 활성 라벨) DNA 분자는 관찰 할 수있다. 아래 : 노란색 원의 분자에 해당하는 시간 추적. FRET 효율, 기증자 방출 강도 및 수용체 방출 강도는 각각, 녹색, 파란색과 빨간색으로 표시됩니다. 안티 상관 수용체 백화 현상 (빨간색 - 투 - 녹색 전환) 단일 분자 FRET의 서명에 해당합니다.

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

이 절차의 목표는 전기천공법을 기반으로 하는 방법을 사용하여 살아있는 미생물 내부에 유기 Fluor로 표지된 DNA 또는 단백질과 같은 생체 분자를 내부화하고 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 전기천공법으로 전환하기 전에 형광 표지된 생체 분자로 전기 역량 세포를 배양함으로써 이루어집니다. 수맥에 고전압을 가함으로써 세포벽과 세포막 모두에 일시적인 기공 형성이 있어 생체 분자가 세포로 확산될 수 있습니다.다음으로, 세포는 과도하게 내재화되지 않은 생체 분자가 제거되기 전에 회복할 수 있도록 풍부한 배지에서 배양됩니다. 마지막으로, 세포를 낮은 형광 최소 영양소 발생 패드로 옮긴 다음 유리 커버 슬립을 위에 덮어 유리 그로 샌드위치를 형성합니다. 궁극적으로, essence microscopy는 살아있는 세포 내부에서 표지된 생체 분자의 위치, 확산 패턴 및 동적 특성을 분석하는 데 사용됩니다.이 방법에 대한 아이디어는 라이브 셀 이미징의 한계를 깨달았을 때 처음 떠올랐습니다. GFP와 같은 광형광 단백질의 빠른 결함으로 인해, 우리는 유기 형광력으로 표지된 생체 분자로 살아있는 세포를 적재함으로써 살아있는 미생물에 이식할 것이라고 추론했습니다. 이 힘의 주요 장점은 밝기, 사진 안정성 및 작은 크기입니다.그런 다음 우리는 훨씬 더 긴 시간 척도로 원래 환경에서 DNA 또는 단백질의 국소화 및 확산을 추적하기를 희망하며, 이는 많은 중요한 생물학적 과정과 일치할 것입니다. 미세주입과 같은 기존 방법에 비해 이러한 기술의 주요 장점은 일반적인 미세주사 바늘의 직경보다 작은 미생물에도 적용할 수 있다는 것입니다. electroporation의 또 다른 이점은 많은 수의 세포가 형광성 유생분자로 동시에 적재되고 electroporation를 특히 눈 처리량 기술 시키는 그들을 평행하게 구상할 수 있다 입니다.이 방법은 생체 내에서 형광 표지된 생체 분자의 확산 및 역학 거동에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 표지되지 않은 전극 생체 분자와 같은 다른 상황에서도 적용할 수 있지만, 예를 들어 세포에 의해 내부화될 때 생리학적 반응을 유발할 수 있습니다.박테리아 또는 효모 형광 현미경을 위한 aros pad를 구성하려면 약 2개의 낮은 형광 배지를 준비하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 실험실 전자 레인지로 증류수에 2 % aros의 용액을 즉시 녹입니다. 뜨거운 HA 장미의 일치하는 부피 하나를 매체에 추가하고 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 기포 형성을 피하고 즉시 약 200 마이크로 리터의 발생 혼합물을 표준 크기의 현미경 커버 슬립에 피펫으로 넣으십시오.겔이 굳을 때까지 또는 임시 보관할 때까지 커버 슬립을 실온에서 1분 동안 벤치에 두고, 두 번째 청소된 커버를 새 패드 위에 올려 놓고 낮은 이온 강도 완충액에서 준비된 형광 생체 분자 스톡부터 시작하여 달걀 장미의 플라스까지 위에서 부드럽게 압력을 가합니다. 최대 5마이크로리터의 생체 분자를 20마이크로리터의 유익한 박테리아 분취량 또는 50마이크로리터의 유익한 효모 세포로 전달합니다. 세포와 함께 배양된 형광 생체 분자의 양은 세포당 내재화된 생체 분자의 양과 직접적인 상관관계가 있습니다.전기천공(electroporation) 후, 혼합물을 얼음 위에서 최대 10분 동안 배양합니다. 동시에 적절한 전극 간격의 electroporation vete를 선택하고 얼음에서 식힙니다. 세포 혼합물을 미리 냉각된 vete로 옮깁니다.베트를 몇 번 부드럽게 두드려 용액에서 거품을 제거합니다. 종이 타월로 수의에서 수분을 제거하고 수의사를 전기 장치에 넣습니다. 이 과정 직후에 세포에 고전압 펄스를 가하십시오.전기 장치에 표시되는 시간 상수가 4밀리초에서 6밀리초 사이인지 확인합니다. 낮은 시간 상수는 종종 qve 내에 과도한 염 또는 기포가 존재하기 때문이며, 이는 세포로의 생체 분자 흡수를 감소시키거나 완전히 억제할 수 있습니다. 더 높은 전압 펄스는 세포 부하를 개선하지만 전기천공법 직후 세포 생존력에 영향을 미칠 수도 있습니다.500마이크로리터의 리치 배지를 추가하고 세포를 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도의 박테리아 또는 섭씨 29도의 효모를 2분에서 10분 동안 배양하여 세포막이 회복되도록 합니다. 생체 분자 통합 및 성장 회복 후 섭씨 4도의 사전 냉각 원심분리기에서 1분 동안 세포를 회전시키고 앙와위 제제 Reese를 버립니다.펠릿을 500마이크로리터의 완충액에 현탁시키고 스핀 다운 세이트 및 제거 및 완충 현탁액 회수 과정을 반복합니다. 세 번 더. 이러한 세척 단계는 세포 현탁액에서 내재화되지 않은 생체 분자의 모든 흔적을 제거합니다.표지된 단백질의 경우, 세포 현탁액을 상단에 0.22 미크론 멤브레인 필터가 장착된 1.5 ml 튜브에 피펫팅하여 추가 정제 단계를 수행합니다. 원심분리를 통해 완충액에서 세포를 분리하는 동시에 세포 건조를 방지하고 유동 분획을 버리기 위해 필터 위에 충분한 액체가 남아 있는지 확인합니다. 필터 아래에서 세포 위에 500마이크로리터의 새 PBS를 추가하고 스핀 다운과 새 PBS 에디션의 조합을 반복합니다.두 번 더. 3, 300G에서 1분 동안 최종 스핀다운을 수행합니다. 이전 PBS 세척을 제거하려면 150마이크로리터의 PBS로 셀을 다시 현탁합니다.마지막으로 미리 만든 아로스 패드에서 상단 커버 슬립을 제거합니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 떨어뜨려 패드에 세포를 로드합니다. 어로즈 패드 위에 세척된 새 커버 슬립을 놓으면 샌드위치 셀이 이제 형광 현미경을 사용할 준비가 된 것입니다.전기 등급이나 배양되지 않은 라벨링된 생체 분자 또는 빈 세포로 배양된 비정격 대조군과 같은 음성 대조군도 로드된 샘플과 병렬로 준비해야 하며, 로드된 세포는 적절한 형광 현미경에서 이미징할 수 있습니다. 광시야 이미징 모드를 사용하면 세포 수준 이미징 및 분석이 가능하지만, 잔디 또는 높은 저조도 또는 단일 분자 관찰 및 추적에 최적입니다. 생체 분자의 과도한 광표백을 방지하기 위해 샘플을 로딩하기 전에 모든 무대 위의 레이저 조명을 끄거나 불투명 필터로 차단하십시오.또한 E-M-C-C-G 카메라 게인을 꺼서 카메라의 과다 노출 손상을 방지하십시오. 도립 현미경 설정의 경우 Aris 패드 샌드위치를 현미경 s에 놓습니다.tage 셀로 덮인 면이 하단 대물렌즈를 향해 아래쪽을 향하도록 합니다. 그런 다음 윗면 할로겐 광을 켜고 레이저를 켜기 전에 투과된 백색광 현미경 모드에서 세포에 초점을 맞추고 백색광 투과 모드에서 세포를 사진으로 찍습니다.이 사진은 생체 분자 형광 영역과 동일한 시야 내에 있는 세포의 실제 위치 간의 상관 관계를 나타내는 위치 참조 맵으로 사용됩니다. 생존력 측정을 위해 최적의 온도로 설정된 대물 히터를 사용하고 스테이지를 이동하지 않고 30분마다 백색광 조명 아래에서 동일한 시야의 순차적 이미지를 기록하고, 상단 조명을 끄고, 실험실의 다른 모든 주변 광원으로부터 샘플을 보호하십시오. 그런 다음 CCD 카메라를 켜고 데이터 수집을 시작합니다.레이저 조명을 켜기 직전에 형광 이온 기록을 시작하십시오. 형광 현미경 검사를 수행한 후 이미지 J와 같은 이미지 처리 소프트웨어로 모든 사진을 열어 데이터 분석을 시작하여 설정 버튼을 눌러 모든 이미지에서 밝기 또는 대비와 같은 모든 기본 이미지 매개변수를 정규화하기 시작하고 다른 모든 이미지로 전파를 선택합니다. 옵션 1은 로드된 셀이 주어진 이미지에 대한 음성 대조군으로 사용된 전기천공되지 않은 셀보다 훨씬 더 밝아야 하므로 셀 로딩이 성공적이었는지 정성적으로 확인할 수 있습니다.자유형 선택 도구를 사용하여 손으로 그린 다각형으로 형광의 다른 영역을 둘러쌉니다. analyze(분석) 메뉴에서 measurement option(측정 옵션)을 선택하여 모든 관련 polygons 간의 형광 강도를 비교합니다. 이 과정을 수동으로 반복하거나 자동화된 스크립트를 사용하여 각 샘플과 음성 대조군에 있는 모든 세포의 픽셀당 강도를 추출합니다.전기 등급 셀에 하나 또는 여러 개의 형광 생체 분자가 로드되면 평균 방출 강도는 음성 대조군 샘플의 평균 강도보다 커집니다. 세포 생존력을 평가하려면 분열하지 않는 세포와 손상된 세포가 손상되지 않은 세포로 온전하게 분열하는 비율을 수동으로 계산합니다. 여러 분할에 걸쳐 30분마다 데이터가 기록되는 동일한 시야에서, 특히 생체 분자가 빠르게 확산되거나 세포에 5개 이상의 표지된 생체 분자가 적재되어 있는 경우 세포당 내재화된 생체 분자의 수를 직접 계산하는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다.세포 기반 광표백 분석을 통해 이러한 조건에서 세포당 표지된 생체 분자의 수를 평가할 수 있습니다. 자유형 선택 버튼을 사용하여 주어진 형광 세포의 윤곽을 추적하고 광표백 효과로 인한 시간 함수로 원시 세포 형광을 추출하고 플롯합니다. 강도 대 시간 그래프는 기하급수적으로 감소하는 곡선과 부하가 많은 세포가 될 것이지만 10개 미만의 생체 분자를 포함하는 세포의 경우 명확한 단계를 구별할 수 있어야 합니다.예를 들어, 타임랩스 시리즈의 마지막 50개에서 100개의 이미지 프레임이 될 수 있는 실험의 평평한 꼬리 끝 부분 근처의 원시 형광 강도 값을 평균화하여 광표백 후 평균 자가형광을 계산합니다. 기준선도 강도도 결정한 후 원시 형광 데이터에서 기준선 자가형광을 빼서 시간에 따른 광백화 강도를 계산한 다음 결과 광표백 강도 데이터를 차단하고 수동으로 또는 알고리즘을 사용하여 각 단계의 높이를 양자화합니다. 이 과정은 평균 단계 고도의 정확한 추정치를 얻기 위하여 전체적으로 100개 단계 이상을 나타내는 몇몇 세포를 위해 반복되어야 한다, 이 가치는 단 하나 fluoro four의 표백 때문에 unitary fluoro 4 강렬에 대응한다.마지막으로, 세포당 내부화된 분자의 수는 시간에 기준선에서 뺀 세포 강도를 0으로 나누어 계산할 수 있습니다. 이 electroporation 프로토콜에 대한 4가지 강도. 박테리아 또는 효모로 내재화될 수 있는 형광 표지된 DNA 또는 단백질의 양은 전기천공법 완충액 내에 존재하는 DNA 프로브의 양을 조정하여 제어할 수 있습니다.생체 분자 내재화 속도가 높을 때, 먼저 형광 강도를 시간 함수로 표시한 다음 지수 시간 상수를 추출하여 찾을 수 있는 표지된 생체 분자의 광표백 수명은 in vivo 염료의 광 안정성에 대한 정보를 제공합니다. 낮은 혼입 비율의 경우, 형광 강도의 양자화는 주어진 세포 내의 생체 분자의 총 수를 근사화하는 수단을 제공할 것입니다. 전기천공법은 단백질을 박테리아나 효양에 통합하는 데에도 사용할 수 있습니다.형광 표지된 단백질의 경우. 유리 형광단(free fluorophores) 자체는 매우 효율적으로 내재화될 수 있기 때문에 단백질 스톡에서 과량의 유리 형광단(free fluorophores) 및 공유결합(non covalently attached fluorophores)을 모두 제거하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 우리 분자에 의해 이중으로 표지된 것은 몇 초 동안 살아있는 세포에서 단일 분자 프렛 관찰을 가능하게 하는 방법을 사용하여 내부화할 수도 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 전기천공되거나 표지된 분자로 배양되지 않은 표지된 생체 분자 또는 빈 세포와 같은 비전기 세포와 같은 대조군 샘플도 준비하고 분석하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 통제를 통해 세포 자가형광 수준과 세척 단계의 결핍을 평가할 수 있으며, 따라서 개발 후 전기천공법 실험이 성공적이었는지 여부를 평가하는 데 필요합니다. 이 기술은 생물물리학 및 제3생물학 분야의 연구자들이 살아있는 미생물에서 표지 생체 분자의 확산 및 동적 거동을 탐구할 수 있는 새로운 길을 열었습니다.그리고 이것은 GFPs와 같은 자가형광 단백질보다 1-2 자릿수 더 긴 시간 척도입니다. 이는 생체 내 유기 d 라벨링의 유연성을 전달하여 살아있는 세포의 분자 내 및 분자간 역학 연구를 위해 단일 분자 위협 실험을 훨씬 더 실현 가능하게 만들었습니다.

internalization-observation-fluorescent-biomolecules-living

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

이 비디오에서 우리는 세포의 효율적인 electrofusion을...

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

출처: Aigrain, L. 외. 전기공공을 통한 생체 미생물 내 형광 생체분자의 내부 추출 및 관찰.  J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 전기공공을 이용해 형광 생체분자를 전기적(electroporation)을 이용한 전기적(electro-potation) 미생물 세포에 전달하는 과정을 시연합니다. 이 과정은 형광포자 태그가 부착된 DNA 또는 단백질을 냉각된 세포 현탁액에 주입하는 것으로 시작됩니다. 그 후 고전압 펄스를 가해 임시 막 구멍을 만들어 생체분자가 세포질 내 침투를 가능하게 합니다. 회복 후에는 세포를 세척하고 여과하여 내부화되지 않았거나 표면에 결합된 분자를 제거합니다. 마지막으로, 표지된 세포를 형광 영상을 위해 부착하여 세포 내 구성 요소를 시각화합니다.

형광 생체분자를 박테리아 세포에 전기천공 기반 전달

이 동영상은 형광 단백질 인코딩 플라스미드 DNA를 마우스의 1차 소뇌 과립 세포 전구체에 도입하는 전기천공법 기술을 보여줍니다.

전기천공법 매개 체외 유전자 전달: 배양된 세포에 형광 리포터 단백질 인코딩 플라스미드를 도입하는 전기 펄스 기술

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

관련 원리를 조사하고 형광 항체 타겟 조건의 다수와의 호환성을 입증하여 발광 (연료)에서 언 바운드 흥분에 의한 형광의 기초 및 응용 성을 확장.

브레 너머 단계 : 언 바운드 흥분에 의한 형광 발광에서 (연료)

유전자 총 변형은 상동 재조합을 통하여 기회 병원체 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만 스의 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합을 생성하는 데 사용되는 방법이다. 우리는 C. 콕 쿠스 네오 포르 만 스에 mCherry 형광 태그에 융합 된 유전자 부호화 아세테이트 키나아제를 갖는 구조, 유전자 총의 변화를 설명 할 것이다.

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

전기천공법(Electroporation)은 펄스 전기장(PEF)을 사용하여 세포 배양에 일시적인 공극을 만들어 분자 화물을 도입하는 것입니다. 이 기술은 최근 연구 및 임상 환경에서 널리 사용되고 있습니다. 여기에서는 최근 개발된 "Electroporation Cytometry System"을 사용하여 살아있는 세포, 형광 현미경 검사를 수행하기 위한 전기천공법 기술에 대해 설명합니다.

U2 OS 세포 배양을 사용한 라이브 셀, 형광 현미경 검사를 위한 전기천공법 세포 분석 프로토콜

학습하세요 생체분자 형광 표지 및 전기천공을 이용한 미생물 내 도입법을 통해 DNA와 단백질의 생체내 역학을 실시간 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 세포생물학 연구에 새로운 가능성을 제공합니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

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