Name: 마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석 현장에서 TUNEL 방법을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 배우세요 마우스 골격근에서 TUNEL 방법을 이용한 DNA 손상 및 세포 사멸 검출 기술입니다. 이 방법은 형광 라벨링과 반자동 분석을 통해 빠르고 특이적인 정량 분석을 제공합니다.

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이 작업은 NIH-NINDS 보조금 RO1-NS065895 및 NIH-NINDS 보조금 5-F31-NS076250-02의 지원을 받았습니다. 
저온 유지 장치를 사용해 주신 JHU SOM Microscope Facility에 감사드립니다.

참고 :이 프로토콜에 설명 된 모든 동물 절차가 건강 (26)의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 프로토콜 (MO13M391)는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 신생아 마우스 희생, 해부 및 고정 <ol><li> CO 2 흡입 신생아 마우스를 희생. </li><li> 바로 무릎 위의 사지를 잘라. 약 출생 후 7 일까지, 다리 뼈는 저온 유지 장치에 연속적으로 섹션에 큰 실험실 가위 날카로운 칼날을 극복 할만큼 부드럽고합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 인산 완충 식염수 (PBS)에 차가운 얼음 4 % 파라 포름 알데히드 10 ㎖의 뒷다리를 놓습니다. </li><li> 집중은 4 ℃에서 4-24 시간 동안 파라 포름 알데히드의 사지를 고정합니다. 배아 조직은 여러 시간이 필요합니다고정의의. <ol><li> 이 TUNEL 분석 효율을 감소시킬 수 있으므로 24 시간보다 더 오래 고정을하지 마십시오. </li></ol></li><li> 자당 용액에 침지하여 뒷다리를 Cryoprotect. <ol><li> 같은 15 ML 튜브에 PBS의 10 % 자당에 파라 포름 알데히드를 변경, 4 ℃에서 하룻밤 배양한다. </li><li> PBS 30 % 수크로오스로 변경, 4 ° C에서 또는 튜브의 바닥 뒷다리 싱크까지 밤새 배양한다. 조직을 수크로오스 멸균 여과되었음을 제공, 긴 기간 동안 30 % 수크로오스에 남아있을 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 포함] <ol><li> 매체를 포함와 레이블이 포함 금형 절반 방법을 채 웁니다. </li><li> 몰드의 한쪽 벽에 최대한 가깝게 잘라면이 매립 매체 위에 배치 뒷다리. 금형의 외부에 뒷다리의 방향을 표시합니다. <ol><li> 여러 뒷다리를 포함하고 같은 블록으로 잘라. 그러나, 모든 힌을 확인하는 것이 중요하다블록 dlimbs은 사지의 축 방향과 일치하는 수준에서 섹션을 얻기 위해 서로에 대해 평행하게 배향된다. </li></ol></li><li> 매체를 포함와 뒷다리를 커버. 매체를 붓는 동안 뒷다리가 이동하는 경우, 무딘 팁 집게 또는 이쑤시개로 다시 방향. </li><li> 적어도 15 분 동안 실온에서 조직에 침투되는 매립 매체 허용. </li><li> 직접 드라이 아이스 또는 드라이 아이스에 이소 펜탄에 넣어 금형은 매체를 포함 동결. 항상 금형 수준을 유지하고 내장 조직의 이동을 방지해야합니다. </li><li> 몇 달까지 들어 잘라 준비까지 -80 ℃에서 냉동 금형을 보관하십시오. </li></ol> 3. 냉동 절편 임베디드 사지 <ol><li> -20 ° C로 설정 저온 유지 챔버 온도, -18 ° C에서 객체 온도; 필요에 따라 개체를 아래로 온도를 조절합니다. </li><li> 적어도 30 분 동안 저온 유지 챔버 내부 조직 블록을 평형. 올바른 블록 온도erature 섹션의 품질에 대한 중요합니다. </li><li> 10 ㎛ 이하의 두께로 잘라 횡단면도. 두꺼운 섹션은 완전히 TUNEL 시약에 의해 침투되지 않습니다. 안티 - 롤 플레이트, 블레이드, 블레이드 각도를 사용하여 (일반적으로 5 °)는 저온 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 실온에서 젤라틴 또는 vectabond 코팅 된 유리 슬라이드 위에 섹션을 수집합니다. 드라이 아이스에서 슬라이드 상자에 바로 놓습니다. 팔의 손이 닿는 곳에 저온 유지 장치 부근에 드라이 아이스와 별도의 용기에 슬라이드 상자를 보관하십시오. <ol><li> 100 ~ 200 μm의 생략, 사지의 장축을 통해 가로 시리얼 부분을 잘라. 각 시리얼 수준에서 최소 3 인접한 섹션을 수집합니다. </li></ol></li></ol> 상업적으로 사용 가능한 키트를 사용하여 뒷다리 섹션 4. TUNEL 분석 (실온에서 모든 단계를 언급하지 않는) <ol><li> 실내 온도와 건조 야간 또는 주말 섹션이 슬라이드를 해동. </li><li> immersin로 섹션을 재수코 플린 항아리에 2 × 10 분 동안 PBS에서 g 슬라이드. 실험실 건조 가능한 부분 주위에 많은 액체를 제거 닦아냅니다. </li><li> Permeabilize 하시려면 섹션 <ol><li> 비 단백질 분해, 사포닌 기반 상용 시약 0.5 % 트윈 20 0.05 % PBS에 트리톤 X100를 사용합니다. </li><li> 습도 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 충분한 물이 상자의 바닥을 추가로 포함하도록 간단한 습도 챔버는 뚜껑이 꽉 빈 피펫 팁 상자이다. </li><li> 섹션을 충당하기 위해 슬라이드에 피펫 충분한 시약 (50 μl의 신생아 마우스 사지에 충분하다). 반복 교반 슬라이드를 떠 섹션의 원인이 될 수 섹션에 직접 피펫하지 마십시오. </li><li> 무딘 팁 집게 사용 시약의 드롭을 확산 섹션의 상단에 파라 필름의 작은 사각형을 배치하고 완전히 섹션 커버. 모든 거품이 파라 필름에서 형성되면, 부드럽게 건조, 들어 올릴 및 다시 적용합니다. </li><li> permeabili와 슬라이드를 품어덮여 습도 챔버에서 1 시간 동안 아네트 시약. 섹션 슬라이드에서 떠 시작하면, 투과성으로 시간은 30 분으로 감소 할 수있다. </li><li> 코 플린 항아리 2 × 5 분에 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 파라 필름 사각형 상단에 떠 있어야하고 제거 및 폐기 될 수있다. </li><li> 실험실을 사용하면, 가능한 한 섹션 주위에 많은 액체를 닦아 건조. </li></ol></li><li> TdT에 매개 DNA 휴식 라벨링 <ol><li> (50 μL 신생아 마우스 사지에 충분하다) 조직 부분을 충당하기 위해 슬라이드에 1 배 가열 치사 라벨 버퍼, 피펫 충분히 라벨 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 또한, 코 플린 항아리에 가열 치사 라벨 버퍼에 슬라이드를 담가. </li><li> 가열 치사 라벨 믹스를 만들기 위해 키트 지침을 따르십시오. 키트는 코발트, 마그네슘, 망간 및 양이온을 포함한다; 망간 양이온은 골격 근육, 신경계, 담배 마는 포함, 다양한 조직에 잘 작동합니다UE들, 간, 피부, 뼈. </li><li> 양성 대조군의 경우, 가열 치사 라벨 믹스의 DNase (키트에 표시된 &quot;클레아 제&quot;)를 추가합니다. 대안 적으로, 키트 설명서에 따라, 37 ° C에서 1 시간 동안 클레아 버퍼와 DNase를 포지티브 제어부 미리 치료. 교차 오염을 방지하기 위해 멀리 다른 실험 섹션에서 DNase의 솔루션과 DNase를 처리 섹션을 유지합니다. </li><li> 음성 대조군의 경우, 라벨 믹스에서 가열 치사 효소를 생략합니다. </li><li> 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 가열 치사 라벨 버퍼를 제거 와이프 ​​사용합니다. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 가열 치사 라벨 믹스, 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 1 시간 동안 37 ° C에서 습도 챔버에 품어. </li><li> 1X 정지 버퍼를 만들기 위해 키트의 지시 사항을 따르십시오. 슬라이드에서 가열 치사 라벨링 믹스를 닦아 제거하는 랩을 사용하여 조직 절편을 커버하도록 200-300 μL 정지 완충액을 추가 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. 알<html> 대체적으로, 코 플린 항아리에 정지 버퍼에 슬라이드를 담가. </li><li> PBS에서 슬라이드 2 × 2 분을 씻으십시오. 연구소는 가능한 한 슬라이드에서 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용. </li></ol></li><li> 형광 라벨 <ol><li> DNA 나누기에 dNTPs를 레이블을 형광 라벨 용액을 제조 키트 지침을 따르십시오. 슬라이드 (섹션 당 50 μL) 상에 피펫 솔루션은 파라 필름의 새로운 사각형 커버, 20 분 동안 습도 챔버에 품어. </li><li> 코 플린 항아리에 PBS에서 2 분 동안 세척 슬라이드. 연구소는 슬라이드에서 가능한 한 많은 PBS를 제거하기 위해 걸레를 사용. </li><li> 슬라이드에 1 μg의의 /의 PBS에서 ml의 피펫에 훽스트 33258 핵 얼룩을 희석 (100 ~ 200 μl의 부분을 커버하기에 충분하다). 5 분 동안 습도 챔버 내에서 배양한다. </li><li> PBS에서 5 분 동안 배를 씻으십시오. </li><li> antifade 형광 장착 미디어 커버 슬립과 매니큐어와 가장자리를 밀봉. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. 디지털 화상 취득 <ol><li> DAPI, FITC, 텍사스 레드 필터 (또는 동급)와 기존의 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득. 라벨이 성공과 핵 (손상 또는 조각)가 표시되었는지 확인하기 위해 높은 배율의 목표 (20 배 또는 40 배)를 사용합니다. 10X 목적은 TUNEL 양성 puncta의 정량에 충분하다. </li><li> 하나의 이미지로 결합 별도의 세 가지 거짓 컬러 채널로 훽스트 염색, TUNEL 염색 및 autofluorescent 신호의 이미지를 수집합니다. TUNEL의 형광 라벨과 적색 필터, 이미지 autofluorescent 신호, 녹색이면 그 반대로. <ol><li> 이후 임계 값 및 정량 슬라이드 사이에 해당하는 모든 이미지 설정을 유지합니다. 각 필터, 사전 설정 및 녹화 노출 시간, 게인 및 비닝 (binning)을 위해 (더 비닝 (binning)는 최고의 없음); 자동 노출 또는 게인 설정을 사용하지 마십시오. </li><li> 가장 INTEN의 범위를 캡처 노출 및 게인 설정을 찾기 위해 시행 착오를 사용하여모든 스테인드 슬라이드에 걸쳐 잇고. 획득 된 이미지에는 포화 픽셀이 의지 바이어스 정량으로,이 없는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 관심의 전체 근육 그룹의 이미지를 가져 가라. 이것은 함께 &quot;스티치&quot;할 여러 이미지를 필요로 할 수있다. </li></ol> 6. 이미지 분석 <ol><li> TUNEL 염색의 디지털 이미지를 분석하는 상용 이미지 분석 프로그램을 사용합니다. 상용 소프트웨어를 사용하여 분석 여기에 표시됩니다. 대안 적으로, NIH로부터 자유 소프트웨어가 ImageJ에 TUNEL 염색을 분석하는데 사용될 수있다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)와 TUNEL 염색 섹션에 인접한 섹션을 얼룩과 기존의 시야 현미경으로 전체 섹션 디지털 이미지를 촬영합니다. 정량화 할 수있는 해부학 적 구조를 추적 해부학 아틀라스 5,18,19와 조합이 H &amp; E 이미지를 사용합니다. </li><li> TUNEL 채널을 끈 상태에서 수동으로 사용하여 정량 영역의 윤곽을 추적훽스트 (Hoechst)와 안내자가 형광 채널. 마스크로 추적 영역 변환 (선택한 화소의 세트를 분석 할 좌표). </li><li> TUNEL 채널을 켭니다. 이미지 분석 프로그램 기능을 임계 화 강도를 사용하여, 모든 자기 형광 신호를 제외하는 임계 값을 낮게 설정한다. </li><li> 연구 세트의 모든 이미지에 동일한 임계 값 설정을 적용합니다. 마스크로 역치 선택을 변환합니다. </li><li> 예를 들어, 각각의 이미지가 근육 영역 마스크와 마스크 TUNEL을 결합한다. 새로운 조합 마스크는 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호를 나타냅니다. </li><li> 객체의 수를 확인하고 추적 근육 지역 내의 TUNEL 신호의 영역을 객체로 조합 마스크에 마스크 정량을 수행합니다. ImageJ에있는 입자 분석기 기능을 사용하여이 작업을 수행합니다. </li></ol>

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방법은 감지하고 정량적으로 설명 마우스 골격 근육에서 DNA 손상 관련 세포 사멸을 분석합니다. 절차는 조직 수확, TUNEL 염색, 디지털 이미지 수집 및 이미지 분석을 포함한다. 일반적인 조직 학적 용품 및 도구가 필요하고, 특수 TUNEL 상업용 키트가 필요하다. 필요한 필수적인 큰 장비 항목은 저온 유지 장치, 디지털 영상 능력 epifluorescent 현미경 및 이미지 분석을위한 컴퓨터 시스템이다. 실험은 잠재적 인 함정을 알고 있어야합니다. 조직자가 형광은 형광 이미징의 주요 관심사입니다. unperfused 동물, 적혈구 남은 상당히 높은 autofluorescent 신호를 기여할 것이다. 내피 세포도 크게 autofluorescent 할 수있다. 따라서, 그자가 형광을 확인하는 것이 중요하다 TUNEL 양성 신호로 오인하지 않습니다. 이 평가는 쉽게 아니 FL 채널로 화상을 취함으로써 달성된다uorophore, TUNEL 양성 채널에서 비교 가능한 빼기에 사용...

터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 TDT () 된 dUTP 닉 엔드 라벨 (TUNEL)이 dUTP를 3를 연결합니다 가열 치사 효소를 사용하는 과정은 &#39;단일 및 이중 가닥 DNA가 12, 23 나누기 끝입니다. 세포 사멸 및 DNA 손상의 검출을위한 TUNEL 방법은 첫째 Gavrieli 등. 1,12,24 20 년 전에보고되었다. 그것은 이후 평가와 다른 조직 준비 7,23,27,40에 최적화되었습니다. TUNEL 뉴런 6,14,29 및 43, 44 심근 허혈에 의한 세포 죽음, 흥분성 신경 세포 사멸 (30, 31)을 연구하는 데 사용하고, 관절염 치료 (39)의 바이오 마커로하고있다. 또한, 다양한 인간 암에서 2,3,15,32,37,38,42 예후 인자 및 종양 세포 마커로 사용되었다. 다른 방법은 DNA 손상 및 세포 사멸 검출을 위해 존재하지만, 그들은 기술적 인 문제와주의 사항이 있습니다. 서던 블랏 quantif하는데 사용될 수있다Y DNA 전체 조직 해물 7,9-11 손상,하지만이 방법은 세포 수준의 해상도를 제공하고 정량화하기 어려운되지 않습니다. 혜성 분석은 세포 4,20,28,36에서 보존 핵을 추출 필요로하는 다른 셀 기반 방법입니다. 혜성 분석법 격리 배양 세포에서 잘 작동하지만, 골격근 조직 8,21에서 그대로 핵을 제조하는 것이 훨씬 더 곤란하다. 서던 블랏과 마찬가지로 혜성 분석은 전체의 근육 조직 파쇄 액으로부터 세포 유형 특정 정보를 제공하지 않는다. TUNEL 방법에 대한 또 다른 대안은 단일 가닥 DNA 25,33,41에 대해 또는 DNA 손상 반응과 세포 사멸 경로에 (예를 들어 p53을, H2AX, 그리고 카스파) 13,17,22,40 참여 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학이다. 이러한 항체 - 기반 방법은 높은 신호 대 백그라운드 비율을 수득 항체의 철저한 특성이 우수한 항체 특이성을 필요로한다. 경우에도 사양IFIC 항체들은 항원 검색 절차 (34, 35)을 통해 목적 단백질의 변성을 요구할 수있는. 우리가 여기에서 토론 할 때, 허용 할 수 없을 정도로 높은자가 형광의 근육 조직 결과에 항원 검색. 다른 방법과 달리, TUNEL 간단 양성 및 음성 대조군, 우수한 조직 침투 항원 검색을 필요로하지 않으며, 세포 수준의 해상도로 테스트 될 수있는 높은 신호, 낮은 백그라운드, 우수한 특이성 DNA 손상 검출을 달성한다. 다른 방법은 전형적으로 밤새 항온 처리를 요구하는 반면, 또한, TUNEL 방법은 완료하는 데 약 4 시간이 걸린다. 우리는 리튬 - Hsieh의 동료 (16)에 의해 생성 된 척수 근위축증 (SMA) (10)의 마우스 모델에서 골격근 세포 사멸 연구. 근육 세포 사멸을 정량화하기 위해, 우리는 다른 skele 걸쳐 견고 작동 티슈 제조, 염색 및 정량하는 방법을 개발했다마우스에서 발달 상이한 시점에서 탈 근육 그룹. 우리는 시중에서 판매하는 TUNEL 라벨링 키트 및 상용 이미지 분석 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 또한 성공적으로 척수 (10)에 면역 형광 염색법과 함께 TUNEL 분석을 사용했다. 여기에 설명 된 방법은 골격 근육에서 조직 병리, 질병의 메커니즘, 노화의 메커니즘과 발달 (사전 및 산후) 세포 사멸을 평가하려는 연구자 유용합니다. TUNEL 기술은 세포의 서브 세트 만이 영향을 세포 수준의 해상도가 필요하다 모델 시스템에서의 DNA 손상과 수리 및 세포 사멸 연구에 특히 유용하다. 이 동영상은 해부, 조직 처리, 절편, 마우스 골격 근육의 형광 기반의 TUNEL 라벨을 설명합니다. 또한 반자동 TUNEL 신호 정량 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>인산염 완충 식염수에 4% 파라포름알데히드</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>여기에 설명된 절차를 위해 4% 용액을 분말에서 신선하게 준비했습니다. 모든 공급업체의 파라포름알데히드를 사용할 수 있습니다. 준비된 포름알데히드 용액은 4°C에서 보관해야 합니다. C이며 유통 기한(최대 몇 개월) 이후에는 사용해서는 안 됩니다. 파라포름알데히드는 흡입 및 피부 접촉에 의한 발암 물질 및 독소입니다. 파라포름알데히드를 취급할 때 MSDS에 명시된 예방 조치를 따르십시오.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S0389</td><td>냉동 전 동결 보호 조직에 사용됩니다. 모든 공급 업체의 설탕을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>O.C.T. 화합물</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>동결 절편용 임베딩 배지.</td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>Leica CM3050S 저온 유지 장치가 여기에 설명된 제제에 사용되었습니다. 10 &mu를 절단할 수 있는 모든 저온 유지 장치; m 섹션을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>유리 슬라이드, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>모든 공급업체의 슬라이드를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G-9391</td><td>젤라틴은 유리 슬라이드에 대한 조직 단면 접착을 촉진하는 데 사용됩니다. 젤라틴으로 유리 슬라이드를 코팅하려면 2.75 g 젤라틴과 0.275 g 크롬 명반을 500 ml 증류수에 용해시키고 60 °C로 따뜻하게하십시오. C, 슬라이드를 몇 초 동안 담그고 말리십시오. 모든 공급업체의 젤라틴을 사용할 수 있습니다. 또는 젤라틴이 사전 코팅된 슬라이드를 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>크롬 (III) 황산 칼륨 12 수화물 (크롬 명반)</td> <td>시그마</td><td>243361</td><td>크롬 명반은 유리 슬라이드의 조직 접착을 촉진하기 위해 젤라틴 용액에 첨가됩니다. 흡입 및 피부 접촉에 의한 발암 물질 및 독소일 수 있습니다. 크롬 명반을 취급할 때 MSDS에 명시된 예방 조치를 따르십시오.</td></tr><tr><td>Vectabond 조직 접착 시약</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>유리 슬라이드에 대한 조직 접착력 향상을 위한 선택적 기판; 젤라틴 코팅 슬라이드를 대신 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>조직을 투과시키는 데 사용되는 세제. 모든 공급업체의 Tween20을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>조직을 투과시키는 데 사용되는 세제입니다. 모든 공급업체의 Triton X100을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescein in situ 세포사멸 검출 키트</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>형광 기반 TUNEL 라벨링용 상용 키트.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(키트에 포함)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease buffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(kit에 포함)</td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>세척 및 희석을 위한 1x PBS 만들기. 모든 공급업체의 PBS를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DNase-free 수</td><td>질 생물학제</td><td>351-029-131</td><td>모든 공급업체의 물을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>핵 염료. 모든 청색 형광 핵 염료를 사용할 수 있습니다. DNA 결합 염료인 Hoechst는 발암 의심 물질이므로 피부 접촉을 최소화하기 위해 보호 장비와 함께 취급해야 합니다.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>multiple</td><td>807</td><td>다른 소수성 필름 또는 커버 슬립을 사용할 수 있습니다. 여러 공급업체에서 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>디지털 카메라가 장착된 형광 현미경</td><td>&nbsp;--</td><td>&nbsp;--</td><td>별도의 채널에서 적색, 녹색 및 청색 형광을 디지털 방식으로 캡처할 수 있는 모든 형광 현미경을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Vectashield 안티페이드 미디어</td> 모든 공급업체의 <td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>안티페이드 미디어를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립, No.1 두께</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>모든 공급 업체의 커버 슬립을 사용할 수 있습니다. 22 x 22mm의 가장 작은 크기는 신생아 마우스 다리 섹션에 충분합니다.</td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>커버 슬립을 밀봉하는 데 사용됩니다. 모든 공급업체(일반 소매점 포함)의 매니큐어를 사용할 수 있습니다. 형광 이미징 중에 빛을 반사할 수 있는 색상이나 첨가제가 포함된 매니큐어를 사용하지 마십시오.</td></tr></tbody></table>

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 dna 손상 분석 현장에서 tunel 방법을 사용하여

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), deoxyuridine triphosphate (dUTP), nick end labeling (TUNEL)은 TdT 효소를 사용하여 세포의 이중 및 단일 가닥 DNA 절단의 3' 말단에 태그가 지정된 형태의 dUTP를 공유 결합하는 방법입니다. 이는 DNA 손상과 세포 사멸을 현장에서 감지하는 신뢰할 수 있고 유용한 방법입니다. 이 비디오는 마우스 골격근의 박리, 조직 처리, 절편 및 형광 기반 TUNEL 라벨링에 대해 설명합니다. 또한 반자동 TUNEL 신호 정량화 방법에 대해서도 설명합니다. 타고난 정상 조직의 특징과 조직 처리 조건은 TdT 효소가 DNA를 효율적으로 표지하는 능력에 영향을 미칩니다. 조직 처리는 또한 TUNEL 신호 감지를 방해하는 바람직하지 않은 자가형광을 추가할 수 있습니다. 따라서 후속 정량화를 위한 최적의 신호 대 잡음비를 산출할 수 있는 조직 처리 및 TUNEL 라벨링 방법을 경험적으로 결정하는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 형광 기반 분석은 디지털 채널 감산으로 자가 형광 신호를 제외하는 방법을 제공합니다. 적절한 조직 처리 기술 및 대조군과 함께 사용되는 TUNEL 분석은 조직 내 세포사멸을 검출하기 위한 비교적 빠르고 재현 가능한 정량적 방법입니다. 병리학적 기전으로서 DNA 손상 및 세포사멸을 확인하고, 영향을 받은 세포 유형을 식별하고, in vivo 치료 효과의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

성공적인 조직 화학 염색, TUNEL 양성 신호 강도 임계치를 설정하여자가 형광 물질로부터 격리 할만큼 밝은해야한다. 낮은 배율에서 TUNEL 양성 개체는 골격 근육 (그림 1A)에 밝은 불규칙한 조각을 나타날 수 있습니다. 관련된 세포 사멸 유형은 세포 사멸 (도 1b) 인 경우에는 고배율, 고전 사멸 형태 일부 TUNEL 양성 개체 관찰되어야한다. 양성 대조군 (DNase를 추가) 섹션 (그림 1C)의 모든 조직에 걸쳐 균일하게 분포 풍부한 TUNEL 양성 신호를 전시한다. 음성 대조군 (반응 생략 가열 치사 효소) 낮은 강도의 배경 및 autofluorescent 신호 만 (그림 1D)를 산출한다. 이 조직은 정상 세포 사멸 (그림 1A)의 높은 속도를 가지고 같은 피부, 다리 전체 섹션의 내부 긍정적 인 컨트롤을 제공합니다. <p class="jove_conten...

이 비디오는 마우스 골격근의 해부, 조직 처리, 절편 및 형광 기반 TUNEL 라벨링에 대해 설명합니다. 또한 TUNEL 라벨링의 반자동 분석 방법에 대해서도 설명합니다.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석 현장에서 TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

이 절차의 전반적인 목표는 C 2에서 DNA 절단과 세포 사멸을 감지하는 것입니다. 이는 터널 시약이 세포핵으로 들어갈 수 있도록 첫 번째 투과 조직 절편에 의해 수행됩니다. 다음으로, TDT 효소는 이러한 세포에서 DNA 절단의 3개의 프라임 말단에 DTP를 공유 결합하는 데 사용됩니다.그런 다음 DUTP에 형광 프로브가 태그됩니다. 궁극적으로, 터널 양성 신호는 세포에서 DNA 절단의 상대적 빈도를 반영하는 조직 섹션에서 정량화됩니다. 서던 블로팅(southern blotting) 또는 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 빠르고 특이적이며 노이즈와 자가형광을 제거하는 방법을 제공한다는 것입니다.15 밀리리터 튜브에 PBS의 4 % 파라 포름 알데히드로 분리 된 뒷다리를 고정하는 것으로 시작하여 섭씨 4 도에서 4 시간에서 최대 24 시간 동안 고정을 허용합니다. 조직이 배아인 경우 2시간밖에 걸리지 않습니다. 그러나 고정 후 용액을 10% 자당으로 교체하여 조직을 동결 보호하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.다음날, 용액을 멸균 여과 된 30 % 자당으로 변경하고 밤새 또는 뒷다리가 튜브 바닥으로 가라 앉을 때까지 배양을 계속하십시오. 매립할 때 뒷다리가 매립 매체에 완전히 잠기는 것이 중요합니다. 임베딩 몰드는 드라이 아이스 위에 직접 배치하거나 드라이 아이스에 isop pentane에 배치하여 매체를 동결 할 수 있습니다.동결 절제할 때. 두께가 10미크론 또는 더 얇고 두꺼운 절단 절편은 터널 라벨링 시약에 의해 관통되지 않습니다. 이러한 얇은 부분을 실온에서 젤라틴 또는 벡터 본드 코팅된 유리 슬라이드에 모으십시오.매우 빠르게 슬라이드를 드라이 아이스로 옮겨 보관하십시오. 먼저 냉동 조직 단면의 슬라이드를 실온으로 해동하고 16-64시간 동안 건조시킵니다. 슬라이드가 실온에 도달하면 PBS로 채워진 커플링 용기에 10분 동안 섹션을 재수화합니다.이 재수화 단계를 한 번 반복한 다음 조직 섹션을 방해하지 않고 실험실 물티슈로 슬라이드를 조심스럽게 건조시켜 섹션을 침투시키고 슬라이드를 습도 챔버에 놓고 50마이크로리터의 비단백질 분해 사포닌 기반 상업용 시약을 섹션에 피펫팅합니다. 분리되거나 손상될 수 있으므로 섹션에 직접 피펫팅하지 마십시오. 그런 다음 시약을 펴기 위해 섹션 위에 작은 파라 필름 조각을 놓습니다.기포가 형성되면 파라 필름을 다시 도포합니다. 슬라이드를 한 시간 후에 한 시간 동안 배양시킵니다. PBS에서 5분 동안 두 번 세척하여 시약을 제거하고 조심스럽게 두드려 말립니다.TDT로 DNA 절단을 라벨링하는 것 옆에는 시중에서 판매되는 키트를 사용하십시오. 먼저 하나의 XTDT 버퍼를 만들고 섹션 위에 피펫을 넣습니다. 그런 다음 가습실에서 슬라이드를 5분 동안 배양합니다.둘째, 키트 지침 또는 포지티브 컨트롤 슬라이드에 따라 TDT 라벨링 믹스를 만듭니다. TDT 라벨링 믹스에 DNA를 추가합니다. 음성 대조군 슬라이드의 경우, 혼합물에서 TDT 효소를 생략합니다.이제 물티슈를 사용하여 슬라이드에서 가능한 한 많은 버퍼를 제거하고 라벨링 믹스에 피펫팅합니다.50마이크로리터로 충분합니다. 다시 말하지만, 거품을 만들지 않고 파라폼으로 용액을 펴십시오.슬라이드를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 챔버에서 배양하십시오. 셋째, 키트의 지침에 따라 one x stop buffer를 만듭니다. 실험실 와이프로 라벨링 혼합물을 제거한 후 2-300마이크로리터의 스톱 혼합물을 추가하여 섹션을 완전히 덮습니다.그런 다음 챔버에서 5분 동안 슬라이드를 배양합니다. 이 단계에서는 파라 필름을 사용하지 않습니다. 스톱 버퍼를 제거하려면 PBS에서 2분 세척을 두 번 사용합니다.이제 50 마이크로 리터의 갓 준비된 플루오레세인 라벨링 용액을 피펫으로 만듭니다. 슬라이드에 퍼필을 바르고 챔버에서 20분 동안 배양하지만 지금은 어둠 속에서 배양합니다. PBS에서 2분 한 번 세척하여 라벨링 용액을 제거하고 세척하는 동안 일부 후크를 희석합니다.3, 3, 2, 5, 8에서 PBS의 밀리리터당 1마이크로그램. 세척 후, 희석 된 후크 용액의 1-200 마이크로 리터로 섹션을 덮으십시오. 그런 다음 슬라이드를 5 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하여 얼룩을 제거하는 고리를 제거하고 PBS에서 5 분 세척을 3 회 사용합니다.그런 다음 실험실 물티슈로 슬라이드를 조심스럽게 말리고 이미징을 위해 커버 슬립을 적용합니다. dpi, fitzy 및 Texas red 필터를 사용하여 단일 이미지에서 후크 염색, 터널 염색 및 자가형광 신호를 세 개의 가색 채널로 분리하여 섹션을 이미지화합니다. 쉽게 비교할 수 있도록 모든 슬라이드 간에 동일한 이미징 설정을 표준화하고 유지합니다.해부학적 참조를 위해 자동 노출 또는 게인 설정을 사용하지 마십시오. 이미지 분석 소프트웨어에서 h와 e로 염색된 인접한 뒷다리 부분의 밝은 명시야 이미지를 사용합니다. 터널 채널을 끕니다.그런 다음 다른 채널을 사용하여 정량화할 근육 영역의 윤곽을 수동으로 추적합니다. 추적된 영역을 마스크로 변환합니다. 그런 다음 터널 채널을 다시 켜고 최소 강도 임계값을 조정하여 자가형광 신호를 제외합니다.연구에서 분석된 모든 섹션에 대해 동일한 임계값 제한을 사용합니다. 다음으로, 임계값 픽셀을 마스크로 변환합니다. 각 이미지에서 근육 영역 마스크와 역치 터널 마스크를 결합합니다.이것은 추적된 근육 영역 내의 터널 신호를 나타냅니다. 이제 결합된 마스크를 정량화하여 터널 포지티브 객체의 수와 근육 내 터널 신호의 총 픽셀 면적을 결정합니다. 통계 분석에 이러한 값을 사용합니다.저배율의 터널 포지티브 물체는 골격근에서 밝고 불규칙한 조각으로 나타날 수 있습니다. 그러나 더 높은 배율에서는 세포 사멸 유형이 이 세포사멸과 관련된 경우 고전적인 세포자멸사 형태를 가진 일부 터널 양성 물체를 관찰해야 합니다. D DNA가 추가된 양성 대조군은 모든 조직에 균일하게 분포된 풍부한 터널 양성 신호를 나타내야 합니다.섹션에서. TDT 효소가 없는 음성 대조군은 낮은 강도의 배경을 가져야 하며 자가형광만 표시해야 합니다. 설명된 프로토콜을 통해 적혈구 뼈 및 내피 세포가 준비된 하지 절편에서 자가 형광 신호에 기여하는 것으로 나타났습니다.진정한 터널 포지티브 신호는 훨씬 더 강렬했습니다. 픽셀 강도 임계값을 사용하여 자동 형광 신호에서 분리할 수 있습니다. 터널 신호를 분리하는 또 다른 옵션은 터널 채널에서 적색 자가형광 채널을 디지털 방식으로 빼는 것이었습니다.이 기술을 사용하면 골격근 세포가 죽습니다. SMA의 마우스 모델을 평가한 결과, 터널 라벨링 결과 생후 5일 된 SMA 마우스에서 대조군보다 더 많은 세포사멸 세포가 발견되었습니다. 터널 염색을 정량화함으로써 이 관찰은 뒷다리 내의 여러 근육 그룹에 대해 통계적으로 유의미한 것으로 나타났습니다.일단 숙달되면 터널 기술을 약 4시간 안에 수행하여 신뢰할 수 있는 정량적 결과를 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

전체 동물 MG53 - 중재 세포막 수리 및 세포 수준에서 동적 프로세스를 시각화하는 데 사용되는 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 방식은 플라즈마 막 resealing 및 재생 의학 세포 생물학을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

이 비디오에서는 샘플에서 세포사멸 세포의 존재를 검출하기 위해 TUNEL 분석이 수행됩니다. 이 연구는 형광 현미경으로 관찰하고 식별할 수 있는 단편화된 DNA의 3' 말단에 표지된 dUTP를 추가하는 촉매 역할을 하는 특수 DNA 중합효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하는 것과 관련이 있습니다.

Terminal Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling—TUNEL Assay: An In Situ Method to Detect DNA Fragmentation in apoptotic cells(말단 전이효소 매개 dUTP 닉 말단 라벨링—TUNEL 분석법: 세포사멸 세포에서 DNA 단편화를 검출하는 현장 방법)

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

연속 크라이 섹션은 단일 마우스 골격근에서 인접 영역을 이용한 유전자 발현 측정 학적 어플리케이션 및 RNA의 농축을 가능하게 수집된다. 직접 애플리케이션에서 비교 풀링 저온부 및 측정 30mg을 - 고품질 RNA를 (20)로부터 얻어진다.

유전자 발현 및 조직 학적 분석을위한 단일 마우스 골격근의 연속 지역의 냉동 절편

여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

여기서 설명된 것은 근육 저온절에서 괴사 성 근섬유의 직접 면역 라벨링을 위한 프로토콜이다. 괴사 세포는 면역 글로불린 G (IgG)를 포함하는 혈청 단백질에 투과성이다. myofibers에 의해 IgG의 섭취를 공개하면 근육 상태에 관계없이 괴사를 겪는 myofibers의 식별 및 정량화를 할 수 있습니다.

근육 생검에 있는 면역 표지하는 Myofiber 변성

여기서, 우리는 동종구균 돌연변이 라민 Δ8-11 마우스 모델, 에머리-드레이퍼스 근 위축증(EDMD)에 대한 매우 가혹한 모델으로부터 초기 산후 발달 단계에서 단일 근육 섬유를 효율적으로 획득하는 방법을 제안한다.

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

플라스미드 DNA를 골격근으로 전기천공하는 것은 마우스의 근육 수축성을 손상시키지 않으면서 유전자 발현을 조절하는 실행 가능한 방법이다.

플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

난모세포 게놈 무결성을 유지하는 것은 결과 배아에서 유전적 충실도를 보장하는 데 필요합니다. 여기에서 우리는 포유류 암컷 생식 세포에서 DNA 이중 가닥 절단을 검출하기 위한 정확한 프로토콜을 제시합니다.

마우스 난모세포에서 DNA 이중 가닥 절단 검출

여기에 제시된 프로토콜은 단일 세포 질량 세포분석을 통한 근육 줄기 및 전구 세포의 식별 및 고차원 분석을 가능하게 하고 FACS에 의한 정제를 통해 기능에 대한 심층적인 연구를 가능하게 합니다. 이 접근법은 질병 모델의 재생 역학을 연구하고 약리학적 중재의 효능을 테스트하는 데 적용할 수 있습니다.

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미토콘드리아 염료 표지 말단 미토콘드리아의 국소 주입 시 생 체 내 공초점 현미경 검사. 이 방법은 건강한 근육을 가진 쥐와 병든 쥐의 골격근 조직에서 입증된 개념 증명을 활용하여 고해상도 미토콘드리아 시각화를 제공합니다.

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배우세요 마우스 골격근에서 TUNEL 방법을 이용한 DNA 손상 및 세포 사멸 검출 기술입니다. 이 방법은 형광 라벨링과 반자동 분석을 통해 빠르고 특이적인 정량 분석을 제공합니다.

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석 현장에서 TUNEL 방법을 사용하여

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