마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석 현장에서 TUNEL 방법을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 C 2에서 DNA 절단과 세포 사멸을 감지하는 것입니다. 이는 터널 시약이 세포핵으로 들어갈 수 있도록 첫 번째 투과 조직 절편에 의해 수행됩니다. 다음으로, TDT 효소는 이러한 세포에서 DNA 절단의 3개의 프라임 말단에 DTP를 공유 결합하는 데 사용됩니다.

그런 다음 DUTP에 형광 프로브가 태그됩니다. 궁극적으로, 터널 양성 신호는 세포에서 DNA 절단의 상대적 빈도를 반영하는 조직 섹션에서 정량화됩니다. 서던 블로팅(southern blotting) 또는 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 빠르고 특이적이며 노이즈와 자가형광을 제거하는 방법을 제공한다는 것입니다.

15 밀리리터 튜브에 PBS의 4 % 파라 포름 알데히드로 분리 된 뒷다리를 고정하는 것으로 시작하여 섭씨 4 도에서 4 시간에서 최대 24 시간 동안 고정을 허용합니다. 조직이 배아인 경우 2시간밖에 걸리지 않습니다. 그러나 고정 후 용액을 10% 자당으로 교체하여 조직을 동결 보호하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

다음날, 용액을 멸균 여과 된 30 % 자당으로 변경하고 밤새 또는 뒷다리가 튜브 바닥으로 가라 앉을 때까지 배양을 계속하십시오. 매립할 때 뒷다리가 매립 매체에 완전히 잠기는 것이 중요합니다. 임베딩 몰드는 드라이 아이스 위에 직접 배치하거나 드라이 아이스에 isop pentane에 배치하여 매체를 동결 할 수 있습니다.

동결 절제할 때. 두께가 10미크론 또는 더 얇고 두꺼운 절단 절편은 터널 라벨링 시약에 의해 관통되지 않습니다. 이러한 얇은 부분을 실온에서 젤라틴 또는 벡터 본드 코팅된 유리 슬라이드에 모으십시오.

매우 빠르게 슬라이드를 드라이 아이스로 옮겨 보관하십시오. 먼저 냉동 조직 단면의 슬라이드를 실온으로 해동하고 16-64시간 동안 건조시킵니다. 슬라이드가 실온에 도달하면 PBS로 채워진 커플링 용기에 10분 동안 섹션을 재수화합니다.

이 재수화 단계를 한 번 반복한 다음 조직 섹션을 방해하지 않고 실험실 물티슈로 슬라이드를 조심스럽게 건조시켜 섹션을 침투시키고 슬라이드를 습도 챔버에 놓고 50마이크로리터의 비단백질 분해 사포닌 기반 상업용 시약을 섹션에 피펫팅합니다. 분리되거나 손상될 수 있으므로 섹션에 직접 피펫팅하지 마십시오. 그런 다음 시약을 펴기 위해 섹션 위에 작은 파라 필름 조각을 놓습니다.

기포가 형성되면 파라 필름을 다시 도포합니다. 슬라이드를 한 시간 후에 한 시간 동안 배양시킵니다. PBS에서 5분 동안 두 번 세척하여 시약을 제거하고 조심스럽게 두드려 말립니다.

TDT로 DNA 절단을 라벨링하는 것 옆에는 시중에서 판매되는 키트를 사용하십시오. 먼저 하나의 XTDT 버퍼를 만들고 섹션 위에 피펫을 넣습니다. 그런 다음 가습실에서 슬라이드를 5분 동안 배양합니다.

둘째, 키트 지침 또는 포지티브 컨트롤 슬라이드에 따라 TDT 라벨링 믹스를 만듭니다. TDT 라벨링 믹스에 DNA를 추가합니다. 음성 대조군 슬라이드의 경우, 혼합물에서 TDT 효소를 생략합니다.

이제 물티슈를 사용하여 슬라이드에서 가능한 한 많은 버퍼를 제거하고 라벨링 믹스에 피펫팅합니다.50마이크로리터로 충분합니다. 다시 말하지만, 거품을 만들지 않고 파라폼으로 용액을 펴십시오.

슬라이드를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 챔버에서 배양하십시오. 셋째, 키트의 지침에 따라 one x stop buffer를 만듭니다. 실험실 와이프로 라벨링 혼합물을 제거한 후 2-300마이크로리터의 스톱 혼합물을 추가하여 섹션을 완전히 덮습니다.

그런 다음 챔버에서 5분 동안 슬라이드를 배양합니다. 이 단계에서는 파라 필름을 사용하지 않습니다. 스톱 버퍼를 제거하려면 PBS에서 2분 세척을 두 번 사용합니다.

이제 50 마이크로 리터의 갓 준비된 플루오레세인 라벨링 용액을 피펫으로 만듭니다. 슬라이드에 퍼필을 바르고 챔버에서 20분 동안 배양하지만 지금은 어둠 속에서 배양합니다. PBS에서 2분 한 번 세척하여 라벨링 용액을 제거하고 세척하는 동안 일부 후크를 희석합니다.

3, 3, 2, 5, 8에서 PBS의 밀리리터당 1마이크로그램. 세척 후, 희석 된 후크 용액의 1-200 마이크로 리터로 섹션을 덮으십시오. 그런 다음 슬라이드를 5 분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하여 얼룩을 제거하는 고리를 제거하고 PBS에서 5 분 세척을 3 회 사용합니다.

그런 다음 실험실 물티슈로 슬라이드를 조심스럽게 말리고 이미징을 위해 커버 슬립을 적용합니다. dpi, fitzy 및 Texas red 필터를 사용하여 단일 이미지에서 후크 염색, 터널 염색 및 자가형광 신호를 세 개의 가색 채널로 분리하여 섹션을 이미지화합니다. 쉽게 비교할 수 있도록 모든 슬라이드 간에 동일한 이미징 설정을 표준화하고 유지합니다.

해부학적 참조를 위해 자동 노출 또는 게인 설정을 사용하지 마십시오. 이미지 분석 소프트웨어에서 h와 e로 염색된 인접한 뒷다리 부분의 밝은 명시야 이미지를 사용합니다. 터널 채널을 끕니다.

그런 다음 다른 채널을 사용하여 정량화할 근육 영역의 윤곽을 수동으로 추적합니다. 추적된 영역을 마스크로 변환합니다. 그런 다음 터널 채널을 다시 켜고 최소 강도 임계값을 조정하여 자가형광 신호를 제외합니다.

연구에서 분석된 모든 섹션에 대해 동일한 임계값 제한을 사용합니다. 다음으로, 임계값 픽셀을 마스크로 변환합니다. 각 이미지에서 근육 영역 마스크와 역치 터널 마스크를 결합합니다.

이것은 추적된 근육 영역 내의 터널 신호를 나타냅니다. 이제 결합된 마스크를 정량화하여 터널 포지티브 객체의 수와 근육 내 터널 신호의 총 픽셀 면적을 결정합니다. 통계 분석에 이러한 값을 사용합니다.

저배율의 터널 포지티브 물체는 골격근에서 밝고 불규칙한 조각으로 나타날 수 있습니다. 그러나 더 높은 배율에서는 세포 사멸 유형이 이 세포사멸과 관련된 경우 고전적인 세포자멸사 형태를 가진 일부 터널 양성 물체를 관찰해야 합니다. D DNA가 추가된 양성 대조군은 모든 조직에 균일하게 분포된 풍부한 터널 양성 신호를 나타내야 합니다.

섹션에서. TDT 효소가 없는 음성 대조군은 낮은 강도의 배경을 가져야 하며 자가형광만 표시해야 합니다. 설명된 프로토콜을 통해 적혈구 뼈 및 내피 세포가 준비된 하지 절편에서 자가 형광 신호에 기여하는 것으로 나타났습니다.

진정한 터널 포지티브 신호는 훨씬 더 강렬했습니다. 픽셀 강도 임계값을 사용하여 자동 형광 신호에서 분리할 수 있습니다. 터널 신호를 분리하는 또 다른 옵션은 터널 채널에서 적색 자가형광 채널을 디지털 방식으로 빼는 것이었습니다.

이 기술을 사용하면 골격근 세포가 죽습니다. SMA의 마우스 모델을 평가한 결과, 터널 라벨링 결과 생후 5일 된 SMA 마우스에서 대조군보다 더 많은 세포사멸 세포가 발견되었습니다. 터널 염색을 정량화함으로써 이 관찰은 뒷다리 내의 여러 근육 그룹에 대해 통계적으로 유의미한 것으로 나타났습니다.

일단 숙달되면 터널 기술을 약 4시간 안에 수행하여 신뢰할 수 있는 정량적 결과를 얻을 수 있습니다.