줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

이 절차의 전반적인 목표는 줄기세포에서 고품질 망막 색소 상피 또는 RPE를 재현 가능하게 유도하는 것입니다. 이것은 먼저 유도성 만능 줄기 세포를 유창성으로 성장시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 세포를 RPE 운명으로 유도하도록 배지를 변경합니다.

다음으로, RPE 세포를 접시 내의 다른 분화된 세포에서 분리한 다음 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 배양물을 확장합니다. 궁극적으로, 배양물의 어두운 색소 침착 및 조약돌 형태학을 사용하여 RPE 세포가 말단 분화에 도달하고 있는지 확인할 수 있습니다. 자발적 분화와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 정의된 요인을 추가하면 분화, 시간이 가속화되고 RPE 수율이 증가한다는 것입니다.

지금까지 수천 마리의 설치류가 IPSA의 다양한 망막 퇴행성 질환에서 유래한 RPE 세포를 사용하여 치료되었습니다. 그러나 이를 효율적이고 효과적으로 변환하여 클리닉에서 이러한 질병을 앓고 있는 인간을 치료하는 경우, 고품질의 높은 RPE 판매 및 IPS를 제공할 잘 확립된 재현 가능한 프로토콜을 개발하는 것이 절대적으로 필요합니다. 이 방법의 시각적 표현은 주어진 시간에 한 사람만 후드 아래의 현미경에서 작업할 수 있다는 것입니다. 격리 단계를 시각화하기 어렵게 만듭니다. 제 연구실의 연구 기술자인 미첼 프린스(Mitchell Prince)는 이제 줄기세포 유래 RPE 배양의 분화를 지시하기 위해 6개의 웰 플레이트의 웰당 6개의 세포에 2배 10의 마우스 배아 영양 세포 층의 관심 줄기세포주, 군체가 cOf 유창성에 도달하도록 한 다음 분화를 통해 매일 먹이로 전환합니다.

니코틴아미드가 보충된 배지. 3주 후, RPE 분화를 향상시키기 위해 피드에 활성 활성 요소를 추가하기 시작합니다. 2주 후, 분화 배지로 다시 전환하고 니코틴아미드만 사용하여 매일 수유를 중단합니다.

배지의 pH 지시약이 수유 다음 날 노란색으로 변하는 것을 멈추면 절단하고 제거할 수 있을 만큼 큰 색소 세포의 구멍이 나타날 때까지 배양액을 인큐베이터로 되돌립니다. 착색된 구멍을 다음 코팅으로 분리하기 위해 자연 세포 환경을 모방한 이종이 없는 매트릭스가 있는 24웰 플레이트의 웰을 분리합니다. 다음으로, 24웰 플레이트의 웰을 필요한 만큼 분화 매체로 채웁니다.

그리고 세포 배양 후드에서 해부 내시경과 메스를 사용하여 원래 플레이트 바닥에 있는 착색된 각 구멍을 2-6조각으로 자르고 날카로운 집게로 착색된 부분을 잡은 다음 1-2개의 착색된 조각을 각각 옮깁니다.24. 세포가 부착될 때까지 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 플레이트를 3-5일 동안 배양합니다. 그런 다음 일주일에 세 번 미디어를 바꾸기 시작하십시오.

분화 배지에서 3-4주 동안 세포를 확장시킵니다. 일주일에 세 번 세포에 계속 공급하여 통로를 찾습니다. RPE는 섭씨 37도에서 200마이크로리터의 예열 비트립신 세포 해리 용액을 추가하여 세포를 분리합니다.

5-8분 후, 새로운 분화 배지로 반응을 중단한 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 배양물을 단일 세포 현탁액으로 재현탁시켜 소수의 세포로 콜로니를 모읍니다. 다음으로, 해리된 콜로니를 15ml 튜브로 옮기고 세포를 스핀다운합니다. 3 밀리리터의 분화 배지에 펠릿을 현탁시키는 Resus는 각각 콜로니를 웰 당 3 밀리리터의 분화 배지를 추가로 포함하는 매트릭스로 코딩 된 6 웰 플레이트의 각 웰로 전달합니다.

그런 다음 세포가 약 90% 융합될 때까지 1-2주 동안 세포를 확장하고 방금 설명한 것처럼 1밀리리터의 해리 용액에서 세포를 다시 분리합니다. 이번에. 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 세포를 재현탁하고 단일 세포 용액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 셀을 다시 회전시킨 후 펠릿을 현탁시킵니다. 18ml의 분화에서 배지는 최종적으로 매트릭스 코딩 배양 용기의 세포를 회수하여 추가 다운스트림 분석을 위한 최소 계대 수에서 원하는 세포의 최대 수를 얻고, 유도성 만능 줄기 세포주 배양 5-7주 후에 색소 집락이 나타나기 시작합니다. 이 군체는 배양이 유지됨에 따라 몇 주 동안 계속 성장할 수 있습니다.

충분한 크기에 도달하면 수동으로 절제할 수 있습니다. 비 RPE 세포로 인한 오염을 피하기 위해 조심스럽게 절제하면 충분히 순수한 RPE 배양액을 생성할 수 있습니다. 일단 숙달되면 기술이 적절하게 수행되면 8주에서 12주 이내에 많은 수의 RPE 세포를 얻을 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 배지를 만들고 세포를 공급하는 동안 배양물을 오염시키지 않도록 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후 많은 분들이 IPS에서 고품질 RPE 셀을 대량으로 생산할 수 있기를 바랍니다. 이를 통해 작업대에서 병상으로 보다 신속하게 이동할 수 있고, 현재 치료할 수 없는 망막 퇴행성 신생혈관 질환을 앓고 있는 환자들에게 세포 기반 치료법을 제공할 수 있기를 바랍니다.