Name: 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 배우세요 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포를 효율적으로 유도하는 방법을. 정의된 인자를 사용하여 분화를 가속화하고 수율을 높이는 이 기술은 재현성 있는 고품질 RPE 세포 생산에 필수적입니다.

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분화 프로토콜 개발에 아낌없는 도움을 주신 Tim Krohne 박사와 Eyal Banin 박사(Mandy Lehmann 박사 및 David Friedlander 박사)에게 감사드립니다. Felicitas Bucher 박사는 이 연구에 사용된 RPE 세포를 분화하는 데 도움을 주었습니다. 또한 이 프로젝트를 위해 매우 관대한 자금을 지원해 준 National Eye Institute(NEI 보조금 EY11254 및 EY021416), California Institute for Regenerative Medicine(CIRM 보조금 TR1-01219) 및 Lowy Medical Research Institute(LMRI)에 감사드립니다.

줄기 세포 유래 망막 색소 상피 1. 감독 차별화 주 : 모든 인큐베이션 단계는 5 % CO 2에서 37 ℃에서 수행 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 유지 보수 미디어 (; 표 1 MM)의 배아 줄기 또는 엉덩이 라인 (매일 공급)를 유지한다. 라인이 품질 관리 기준을 충분히 도달했으면, 마우스 배아 피더 세포의 층에이를 유지 보수 (MEFs에)은 250,000의 밀도 / 웰의 여섯 웰 플레이트에 시딩. 제노없는 배양 또한 터커 외. (40)에 의해 확립 된 프로토콜은 다음 생성 될 수있다. </li><li> 줄기 세포 식민지 포화 상태에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 니코틴 아미드 (; 표 1 DM / NIC)와 차별화 미디어로 전환; 매일 공급. </li><li> RPE 차별화를 강화하기 위해, 문화 삼주 후, 니코틴 및 중 하나를 Activin-A 또는 IDE-1 (표 1 DM / NIC / AA 또는 DM / NIC / IDE1)와 차별화 미디어로 전환합니다. </lI&gt; <li> 문화 오주 후, DM / NIC로 전환. 매일 먹이를 더 이상 공급 후 노란색 하루를 돌려 미디어 정지의 pH를 표시 한 번 필요하지 않습니다. </li><li> (그림 2D-F와 3A 참조)만큼 잘라 제거 할 큰이 나타나는 색소 세포의 섬 기다립니다. </li></ol> 2. 분리 안료 독도 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 외투 세포 자연 환경 (이종이없는 것이 바람직하다) 본뜬 매트릭스 24- 웰 플레이트의 웰. 참고 : 각막 블레이드 날카로운, 뾰족한 집게 따기위한 매우 유용합니다. 따기 동안 분화 된 세포의 전체 시트를 분리 할 수​​ 있습니다. 신중하게 작업하고 처음에 접시의 중앙에 식민지를 선택하여이 피하십시오. </li><li> (; 표 1 DM) 필요에 따라 차별화 미디어를 24 웰 플레이트의 많은 우물을 입력합니다. 착색 된 콜로니의 수에 의존 할 것이다 이러한 결정수집. </li><li> 해부와 세포 배양 후드에서 수동으로 착색 된 섬을 잘라. 약 2-6 조각으로 메스를 사용하여 원래 판의 맨 아래에 각각의 섬을 잘라 날카로운 집게로 착색 된 부분을 잡아. </li><li> 각 24 웰에 1-2 착색 된 조각을 전송합니다. </li><li> 세포가 준수 할 때까지 3~5일을 위해 미디어를 변경하지 마십시오, 다음 미디어에게 일주일에 세 번 변경 시작합니다. (그들은이 시간 이후 준수하지 않는 경우, 가능성은 결코 좋은입니다). </li><li> (; 표 1 DM) - 전형적인 문화의 이미지가 그림 3b에 도시되어 차별화 미디어 3-4 주 동안 세포를 확장합니다. 세포는 여전히 전체를 잘 채울 수 있지만 더 이상 기다리는 것은 해결 될 수 없다. 일주일에 세포를 세 번 피드. </li><li> 약 3 주 후, 수동 날카로운 집게로 필요한 경우 대단히 짧은 흰색 세포의 클러스터를 제거합니다. 필요한 경우가 아니면이 단계를 수행하지 마십시오 - 그것은 오염 물질을 소개하기 쉽습니다. 그것은에 이상적입니다단계 1.6 원래 색소 식민지에서 RPE의 순수한 인구를 얻으려고. </li></ol> 3.과 Passaging 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 세포 해리 용액 200 μL를 가진 세포를 분리하여 37 ℃에서 5-8 분 동안 (바람직 희석 바람직하다 통하여 불 활성화 될 수있는 시약의 트립신 생략), 및 DM 희석하여 비활성화. 모든 세포를 씻어하고 (두 24 우물에서 세포를 풀링을 고려, 몇 세포가 포함되어 잘 선택한 경우)을 재현 탁하기 위해 200 μL 피펫을 사용합니다. </li><li> 원심 분리기 (5 분 800 XG)는, 3 ㎖의 DM 미디어에서 뜨는 및 재현 탁를 폐기합니다. </li><li> 다시 플레이트 세포 하나 (또는​​ 2) 잘 당 DM의 3 ㎖ 한 매트릭스 코팅 6 자에 24 우물에서 (1 : 5 확장). </li><li> 세포가 ~ 90 % 컨 플루 언트 될 때까지 1~2주 대한 확대; 완전히 차별화 된 순수 문화의 이미지는 그림 3C에 표시됩니다. </li><li> 1 ml의 세포 D와 세포를 분리37 ° C에서 약 5-8 분 issociation 솔루션은, DM 희석하여 비활성화 모든 세포를 씻어 1,000 μL 피펫을 사용하고이를 재현 탁. </li><li> (5 분 800 XG) 스핀 다운 18 ML의 DM 미디어에서 뜨는 및 재현 탁를 폐기합니다. </li><li> (6 팽창 1) 또는 (2) 75cm 플라스크 하나가 코팅 된 (1 : 7.5 확장) 여섯 매트릭스로 한 각 6- 웰 플레이트에서 다시 셀 웰 당 3 ㎖ DM 6- 웰 코팅. </li><li> 충분한 세포를 얻을 때까지 반복 3.4-3.8 필요한 단계를 반복합니다. 참고 : 오히려 각 통로 RPE의 탈분화를 유도하기 때문에 계대를 통해 문화를 증폭 계획보다 확장 가능한 한 많은 식민지를 수집하려고합니다. </li></ol>

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<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+into+retinal+pigment+epithelium-like+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Protei.%2C+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors.</a> Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).</li>
</ol>

저자 중 누구도 선언할 상업적 공개가 없습니다.

이 논문에서 우리는 효율적으로 순수 만능 줄기-RPE 문화의 큰 숫자를 생성하는 단계를 설명합니다. 우리는 우리가 강하게 transcriptomics, 단백질 체학, 대사 체학 및 기능에 따라 hRPE 유사 만능 줄기-RPE를 생성 할 수 있습니다를 Activin이 감독 분화 프로토콜을 사용하여 이전에 보여 주었다 및 RCS 쥐 12,31,32를 이식 할 때 그들은 망막 변성을 지연하는 것이 . 만능-RPE를 생성하는 과정은 시간이 많이 소요 아니라 고된 (도 1)이다. 만능 문화 포화 상태에 도달하면 그들은 매일 차별화 매체를 공급해야합니다. 우리를 Activin A 또는 덜 비싼 작은 분자 IDE-1 중 하나와 미디어를 보완하고, 일반적으로 5-7주 (그림 2A-C) 후 나타나는 색소 만능 줄기-RPE 식민지의 문화를 모니터링하면서 2 주 동안 먹이를 계속합니다. 일단 충분한 크기에 도달하기 (도 2D 및 <str...

망막을 차지하는 다양한 세포 유형은 기능적 아키텍처로 구성되어 있습니다. 망막 뒤쪽에 있는 광수용체(photoreceptor)는 광전달(phototransduction)을 통해 빛을 전기 충격으로 변환하는 역할을 합니다. 그러나 광형질전환은 뮐러 신경교세포(Mueller glia 및 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE) 세포를 포함한 다른 인접 세포 유형의 조정된 노력 없이는 발생할 수 없습니다. RPE 세포의 단층은 광수용체의 주요 혈액 공급원인 맥락모혈관(choriocapillaris)의 감각 망막을 분할하며, 광수용체 항상성에 중요한 여러 기능을 제어하는 데 이상적인 위치에 있습니다. 사실, RPE와 광수용체는 상호 의존적이어서 하나의 단일 기능 단위로 널리 간주됩니다. (RPE의 다양한 기능에 대한 검토는 Strauss, 2005,1 참조) 망막 색소 상피 세포의 사멸 또는 기능 장애는 선진국에서 영구적인 시력 상실의 주요 원인인 노화 관련 황반 변성(AMD)을 유발할 수 있습니다2-4. 
AMD는 RPE, 광수용체, 맥락막 혈관 구조의 복합성 질환이며, 위험 요인은 다양하며 환경 및 유전적 영향의 조합을 포함합니다5,6. AMD에 대한 치료법은 매우 제한적이지만, 유망한 잠재적 치료법 중 하나는 RPE 세포 치환7,8입니다. 결과는 엇갈렸지만, AMD 환자(및 다른 망막 변성 환자)와 망막 변성의 설치류 모델에서 RPE 세포를 이식하면 유의미한 광수용체 위축을 일시적으로 예방할 수 있는 잠재력이 있습니다9-23. (이 연구에 일반적으로 사용되는 동물 모델은 MerTK 유전자에 돌연변이를 가지고 있는 RCS(Royal College of Surgeons) 쥐입니다. 이 돌연변이는 RPE 세포가 광수용체 외분절을 식세포화할 수 없게 만들고 망막 변성을 촉진한다24.) RCS 쥐와 마우스의 망막하 공간에 이식된 RPE의 보고된 생존율은 크게 다르지만 몇 개월 또는 몇 년 동안 생존할 가능성이 있습니다9,10,12,20. 
RPE 세포는 만능 줄기 세포9-14,25-28에서 유도하여 이식에 충분한 수를 얻을 수 있습니다. 여러 독립적인 그룹은 이러한 세포가 체세포 세포와 유사한 방식으로 기능한다는 것을 입증했으며, 장기간의 연구에 따르면 쥐 및 쥐 질병 모델9,10,12,14,19,20,25,29-32에 이식하면 안전하다고 제안합니다. 배아 줄기세포 대신 유도만능줄기세포를 사용하면 동종 RPE와 관련된 윤리적 문제 및 면역학적 문제를 피할 수 있기 때문에 유리할 수 있다33,34. iPS 기술의 또 다른 흥미로운 응용 분야는 질병 모델링35입니다. RPE 질환 환자에서 유래한 많은 수의 RPE 세포를 조사할 수 있는 능력은 분자 기반을 이해하는 데 매우 중요할 수 있습니다. 이러한 유형의 연구는 최근 Best disease patient RPE를 대상으로 수행되었으며, 유전성 황반병증에 대한 유사한 연구의 길을 열 수 있다36. 
줄기세포에서 RPE를 추출하는 것은 비교적 간단한 과정이며 완전히 이종이 없는 조건에서 수행할 수 있습니다. 가장 간단한 전략은 RPE 세포의 단층을 자발적으로 유도하는 것이지만, 유도된 분화 기술을 사용하여 수율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 그러나 이러한 기술은 비용이 많이 들고 종종 박테리아 또는 기타 인간이 아닌 소스에서 생성될 수 있는 외인성 단백질 인자의 사용을 포함합니다10,12,37. 본 연구에서는 니코틴아미드(nicotinamide)와 액티브빈(Activin) A를 활용하는 확립된 프로토콜10을 따랐는데, 이는 RPE 사양38에 충분한 것으로 밝혀진 신호전달 인자이다. 여기에서는 소분자 IDE-1이 Activin A를 적절하게 대체할 수 있음을 입증하여 비용을 절감하고 재조합 단백질39의 사용과 관련된 우려를 완화할 수 있습니다. 또한, 당사는 xeno-free 혈청 대체물을 활용하고, 합성 xeno-free 기질에서 분화 RPE 세포를 배양합니다. RPE 세포는 이전에 이 접근법을 사용하여 매우 효과적으로 분화하는 것으로 나타났습니다40.
단층으로 분화하면 빠르면 5주 후에 RPE 세포를 포함하는 색소 콜로니를 시각화할 수 있습니다12. 충분한 크기에 도달하면 수동으로 절제하고 확장을 위해 다른 접시로 옮길 수 있습니다. RPE 세포는 각 계대에서 역분화되는 것으로 악명이 높으며, 5개 이상의 계대는 사용하지 않아야 합니다(동물 모델에서 특성 분석 및 이식을 위한 충분한 수의 세포는 2개 또는 3개의 계대 후에 쉽게 생성될 수 있음). 완전히 분화되면 여러 기술을 사용하여 세포를 해부학적으로나 기능적으로 특성화하여 질병이 있는 RPE를 적절하게 대체하는 역할을 할 수 있도록 합니다. 이러한 기술에 대한 설명 및 설치류의 망막하 공간에 iPS-RPE를 이식하기 위한 프로토콜은 이 방법 논문의 범위를 벗어나며 이전에 발표된 바 있습니다12,32,41. 
iPS-RPE의 효과적인 유도를 위한 표준화된 프로토콜을 개발하는 것이 임상에 분명히 중요하지만, 동물 모델에서 여전히 수행해야 할 중요한 전임상 작업이 있습니다. iPS 유래 세포의 면역원성에 대한 우려가 있으며, 인공 기질에 세포를 이식하는 것을 포함한 여러 가지 다른 이식 기술이 연구되고 있습니다42,43. 이러한 이유로, 우리는 표준화된 프로토콜의 발표가 임상 및 전임상 연구를 모두 촉진하는 데 유익하다고 생각합니다. 특히 다른 연구 그룹이 다른 실험실에서 파생된 iPS-RPE 세포를 직접 비교하는 경우.

<table><tbody><tr><td>각막 칼&nbsp;</td><td>Surgipro</td><td>SPOI-070</td><td>나이프 x 1</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml x 4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 1X w/out Ca 또는 Mg</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>500 ml x 6</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated)</td><td>VWR</td><td>45000-736</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) 재조합 Human Protein</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td>100 &micro; g x 1</td></tr><tr><td>IDE-1</td><td>Stemgent</td><td>04-0026</td><td>2 mg x 1</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 100X&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>100 g x 1</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>20 ml x 1</td></tr><tr><td>재조합 인간/쥐/쥐 Activin A&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>10 &마이크로; g x 2</td></tr><tr><td>Synthemax-T 표면 6 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3877</td><td>Case(12) x 1</td></tr><tr><td>TrypLE-Express Enzyme (1X), 페놀 레드 없음&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>12604-021</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>진공 필터 / 저장 병 시스템, 0.1&micro; M 모공, 500ml&nbsp;</td><td>코닝</td><td>431475</td><td>케이스(12) x 1&nbsp;</td></tr></tbody></table>

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

55세 이상 노인의 시력 상실의 주요 원인인 노화 관련 황반변성(AMD)에 대한 치료법은 발견되지 않았습니다. AMD는 원인을 알 수 없는 복합적인 다인성 질환이지만, 주로 망막의 기저에 있는 세포의 단층인 망막 색소 상피(RPE)의 사멸 또는 기능 장애로 인해 발생하는 것으로 생각됩니다. RPE 세포 대체 전략은 대다수의 AMD 환자에게 치료 완화를 제공할 수 있는 큰 가능성을 가질 수 있으며, 일차 인간 세포(hRPE)와 매우 유사한 RPE 세포는 당사의 실험실을 포함한 여러 독립 실험실에서 생성되었습니다. 또한 iPS-RPE의 용도는 세포 기반 치료에 국한되지 않고 RPE 질환을 모델링하는 데에도 사용되었습니다. 이러한 유형의 연구는 질병의 분자 기반을 규명할 수 있을 뿐만 아니라 신약을 개발하고 테스트하기 위한 귀중한 도구 역할을 할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 직접 분화하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 니코틴아미드와 특정 시점에서 그 효과를 모방하는 작은 분자인 Activin A 또는 IDE-1을 추가하면 RPE 세포의 수율이 크게 향상됩니다. 이 기술을 사용하면 빠르면 3개월 이내에 많은 수의 저계대 RPE를 도출할 수 있습니다.

도 1에 도시 된 바와 같이,이 논문에서 설명하는 단계는, 이전에보고 된 바와 같이 (10, 12)를 용이하게 줄기 세포에서 RPE를 생성하는데 사용될 수있다. 몇 주 동안 만능 줄기 라인을 유지 한 후, 색소 식민지 5-7주 (7 주 된 문화가 그림 2A-C에 나와 있습니다) 후 식민지에서 나타나기 시작. 이러한 식민지 문화가 유지 될 때 주 동안 계속 증가 할 수 있습니다. 도 3a에 도시 된 바와 같이,도 2D-F (8 주령 배양)에 나타내는 바와 같이, 충분한 크기에 도달하면, 이들은 수동으로 절개 할 수있다. 주의 절제 크게 충분히 순수 RPE 문화 (그림 3B-C)의 생성을 촉진 할 것이다 비 망막 색소 상피 세포의 오염을 방지 할 수 있습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

이 절차의 전반적인 목표는 줄기세포에서 고품질 망막 색소 상피 또는 RPE를 재현 가능하게 유도하는 것입니다. 이것은 먼저 유도성 만능 줄기 세포를 유창성으로 성장시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 세포를 RPE 운명으로 유도하도록 배지를 변경합니다.다음으로, RPE 세포를 접시 내의 다른 분화된 세포에서 분리한 다음 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 배양물을 확장합니다. 궁극적으로, 배양물의 어두운 색소 침착 및 조약돌 형태학을 사용하여 RPE 세포가 말단 분화에 도달하고 있는지 확인할 수 있습니다. 자발적 분화와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 정의된 요인을 추가하면 분화, 시간이 가속화되고 RPE 수율이 증가한다는 것입니다.지금까지 수천 마리의 설치류가 IPSA의 다양한 망막 퇴행성 질환에서 유래한 RPE 세포를 사용하여 치료되었습니다. 그러나 이를 효율적이고 효과적으로 변환하여 클리닉에서 이러한 질병을 앓고 있는 인간을 치료하는 경우, 고품질의 높은 RPE 판매 및 IPS를 제공할 잘 확립된 재현 가능한 프로토콜을 개발하는 것이 절대적으로 필요합니다. 이 방법의 시각적 표현은 주어진 시간에 한 사람만 후드 아래의 현미경에서 작업할 수 있다는 것입니다. 격리 단계를 시각화하기 어렵게 만듭니다. 제 연구실의 연구 기술자인 미첼 프린스(Mitchell Prince)는 이제 줄기세포 유래 RPE 배양의 분화를 지시하기 위해 6개의 웰 플레이트의 웰당 6개의 세포에 2배 10의 마우스 배아 영양 세포 층의 관심 줄기세포주, 군체가 cOf 유창성에 도달하도록 한 다음 분화를 통해 매일 먹이로 전환합니다.니코틴아미드가 보충된 배지. 3주 후, RPE 분화를 향상시키기 위해 피드에 활성 활성 요소를 추가하기 시작합니다. 2주 후, 분화 배지로 다시 전환하고 니코틴아미드만 사용하여 매일 수유를 중단합니다.배지의 pH 지시약이 수유 다음 날 노란색으로 변하는 것을 멈추면 절단하고 제거할 수 있을 만큼 큰 색소 세포의 구멍이 나타날 때까지 배양액을 인큐베이터로 되돌립니다. 착색된 구멍을 다음 코팅으로 분리하기 위해 자연 세포 환경을 모방한 이종이 없는 매트릭스가 있는 24웰 플레이트의 웰을 분리합니다. 다음으로, 24웰 플레이트의 웰을 필요한 만큼 분화 매체로 채웁니다.그리고 세포 배양 후드에서 해부 내시경과 메스를 사용하여 원래 플레이트 바닥에 있는 착색된 각 구멍을 2-6조각으로 자르고 날카로운 집게로 착색된 부분을 잡은 다음 1-2개의 착색된 조각을 각각 옮깁니다.24. 세포가 부착될 때까지 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 플레이트를 3-5일 동안 배양합니다. 그런 다음 일주일에 세 번 미디어를 바꾸기 시작하십시오.분화 배지에서 3-4주 동안 세포를 확장시킵니다. 일주일에 세 번 세포에 계속 공급하여 통로를 찾습니다. RPE는 섭씨 37도에서 200마이크로리터의 예열 비트립신 세포 해리 용액을 추가하여 세포를 분리합니다.5-8분 후, 새로운 분화 배지로 반응을 중단한 다음 200마이크로리터 피펫을 사용하여 배양물을 단일 세포 현탁액으로 재현탁시켜 소수의 세포로 콜로니를 모읍니다. 다음으로, 해리된 콜로니를 15ml 튜브로 옮기고 세포를 스핀다운합니다. 3 밀리리터의 분화 배지에 펠릿을 현탁시키는 Resus는 각각 콜로니를 웰 당 3 밀리리터의 분화 배지를 추가로 포함하는 매트릭스로 코딩 된 6 웰 플레이트의 각 웰로 전달합니다.그런 다음 세포가 약 90% 융합될 때까지 1-2주 동안 세포를 확장하고 방금 설명한 것처럼 1밀리리터의 해리 용액에서 세포를 다시 분리합니다. 이번에. 1000마이크로리터 피펫을 사용하여 세포를 재현탁하고 단일 세포 용액을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.그런 다음 셀을 다시 회전시킨 후 펠릿을 현탁시킵니다. 18ml의 분화에서 배지는 최종적으로 매트릭스 코딩 배양 용기의 세포를 회수하여 추가 다운스트림 분석을 위한 최소 계대 수에서 원하는 세포의 최대 수를 얻고, 유도성 만능 줄기 세포주 배양 5-7주 후에 색소 집락이 나타나기 시작합니다. 이 군체는 배양이 유지됨에 따라 몇 주 동안 계속 성장할 수 있습니다.충분한 크기에 도달하면 수동으로 절제할 수 있습니다. 비 RPE 세포로 인한 오염을 피하기 위해 조심스럽게 절제하면 충분히 순수한 RPE 배양액을 생성할 수 있습니다. 일단 숙달되면 기술이 적절하게 수행되면 8주에서 12주 이내에 많은 수의 RPE 세포를 얻을 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 배지를 만들고 세포를 공급하는 동안 배양물을 오염시키지 않도록 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후 많은 분들이 IPS에서 고품질 RPE 셀을 대량으로 생산할 수 있기를 바랍니다. 이를 통해 작업대에서 병상으로 보다 신속하게 이동할 수 있고, 현재 치료할 수 없는 망막 퇴행성 신생혈관 질환을 앓고 있는 환자들에게 세포 기반 치료법을 제공할 수 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는, 우리는 마우스 눈 ciliary 상피에서 망막 줄기 세포를 분리하고 clonal 망막 분야를 형성하는 문화에서 그들을 성장하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 절연되는 분야는 줄기 세포의 추기경 속성을 가지고 : 자기 갱신과 multipotentiality.

마우스 아이의 망막 줄기 세포의 분리

마이크로 RNA (miRNA의) 인간 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 (IPS-RPE) 태아 RPE에서 파생 된 인간 유도 만능 줄기의 프로파일 (IPS) 세포, 망막 색소 상피 (RPE)를, 비교 하​​였다.

인간 iPS 세포의 마이크로 RNA 발현 프로파일, IP의 유래 망막 색소 상피 세포, 태아의 망막 색소 상피

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

비인간 영장류 (NHP)는 해부학적 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 망막 세포 치료법을 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 원고는 NHP 눈의 망막 색소 상피 세포의 피하 학적 이식 방법과 황반 조작과 관련된 수술 내 합병증을 방지하기위한 전략을 설명합니다.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

이 연구는 인간 줄기세포 유래 망막 색소 상피 세포의 효율적인 동결 보존을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 최적 단계에서 동결 보존

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

배우세요 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포를 효율적으로 유도하는 방법을. 정의된 인자를 사용하여 분화를 가속화하고 수율을 높이는 이 기술은 재현성 있는 고품질 RPE 세포 생산에 필수적입니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

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