마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 손상된 척수에서 미세아교세포, 단핵구 및 기타 세포 유형 간의 움직임과 상호 작용을 관찰하는 것입니다. 이것은 먼저 형광 마커로 표지된 상주 미세아교세포 또는 골수 유래 대식세포를 가진 골수 키메라 마우스를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 척수에 등쪽 기둥 압착 부상을 일으키는 것입니다.

그런 다음 동물을 다시 열고 척수를 안정화합니다.다광자 이미징의 경우 마지막 단계는 병변 내에서 단일 이미지 또는 타임랩스 동영상을 촬영하는 것입니다. 궁극적으로 이미지 분석은 세포의 움직임 및 주변 기질과의 세포 상호 작용을 보여줍니다. 세포 배양 및 고정 조직과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 살아있는 동물의 자연스럽고 복잡한 환경에서 세포를 이미지화할 수 있다는 것입니다.

이 수술에는 키메라 또는 이중 형질전환 동물을 사용하십시오. 마취를 유도한 후 상주 세포 또는 골수 유래 세포를 라벨링하는 방법에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하고, 분당 약 60-100회의 호흡 속도를 위해 1-2% ISO 불소로 유지하는 방법을 참조하십시오. 이제 눈 연고를 바르고 발가락 꼬집기로 마취 수술 평면을 확인합니다.

먼저 대상 척수 부위를 면도한 다음 포비돈 요오드와 70% 알코올 스크럽으로 피부를 깨끗이 닦고 동물을 드레이프하고 수술 부위에 접근할 수 있는 구멍을 만들어 수술을 준비합니다. 그런 다음 멸균 드레이프에 오토클레이브 도구를 배치하십시오. 여기에는 타인 사이에 1mm로 고정되고 끝에서 1mm 떨어진 곳에 표시가 있는 숫자 4개의 집게가 포함됩니다.

이제 홍채 가위를 사용하여 정중선의 피부를 열어 근육 조직을 노출시킬 수 있습니다. 해부 현미경으로 수술을 진행합니다. 정중선을 따라 척추를 노출시키는 것을 목표로 등 척추 돌기에 부착되는 등 근육을 자릅니다.

여기에는 latisimus dorsi의 승모근과 인대를 절단하는 것이 포함됩니다. 다음으로, 횡돌기(transverse process)와 등돌기(dorsal process) 사이의 회전근(rotator muscle)을 제거하여 제거 대상이 되는 특정 척추의 층판을 드러냅니다. 여기서 T10이 노출되어 있습니다.

프로세스 위와 아래의 공간에 RO 배심원 팁을 삽입하여 진행합니다. 그런 다음 팁을 약간 들어 올려 팁이 제자리에 단단히 고정되고 너무 깊지 않은지 확인합니다. 그런 다음 RO 배심원을 닫아 층을 제거합니다.

이제 나머지 척추뼈의 작은 부분을 모두 제거하여 개구부를 확대합니다. 30게이지 바늘을 사용하여 경막에 1mm 간격으로 두 개의 구멍을 뚫어 고정 집게를 위한 접근 지점을 만듭니다. 그런 다음 경막을 통해 90도 각도로 고정 집게를 삽입하고 경막 위의 타인에 있는 표시를 유지합니다.

이제 10초 동안 집게를 꼬집어 닫습니다. 10초 동안 두 번 더 쥐고 집게를 제거합니다. 다음으로, 흡수성 젤라틴 조각, 압축 스폰지를 식염수에 담그고 부상 부위를 덮습니다.

젤라틴 스펀지 위의 근육을 4 번, 합성 비 나일론 러닝 봉합사를 사용하여 닫습니다. 그런 다음 5mm 상처 클립을 사용하여 피부를 고정합니다. 10마이크로리터의 부피바카인과 490마이크로리터의 식염수를 킬로그램당 1밀리그램씩 피하 주사하여 절차를 완료합니다.

그런 다음 5마이크로리터의 부프레노르핀을 대둔근에 1kg당 100마이크로그램으로 주입합니다. 수술 후. 동물을 따뜻하게 하고 의식을 되찾을 때까지 모니터링합니다. 이미징을 위해 동물을 다시 열려면 이전과 같이 마취를 유도한 다음 제조업체의 및 지침에 따라 상처 클립을 제거하십시오.

필요한 경우 절개 부위 주변에 제모 제품을 바릅니다. 이번에는 포비돈 요오드와 70% 알코올로 스크럽을 추가로 바른다. 이제 이전 절개 부위를 따라 피부를 다시 엽니다.

남아 있는 봉합사를 제거하고 필요에 따라 가위를 사용하여 집게로 근육을 엽니다. 해부 현미경 아래에서 가위를 사용하여 척추의 횡돌기를 따라 후판 절제술보다 한 수준 위, 후판 절제술에서 한 수준 아래에 척수 클램프를 위한 주머니를 만듭니다. 각 척추뼈 주위에 척수 안정기의 클램프를 삽입하고 클램프를 조입니다.

척수가 이미징 플랫폼과 평행이 되고 조직이 안정적이도록 클램프를 조정합니다. 호흡 아티팩트가 보이면 클램프를 조정하여 움직임을 최소화하십시오. 그런 다음 클램프와 파라폼을 덮습니다.

다음으로 섬세하게 집게를 사용하여 젤 폼을 제거합니다. 가능한 한 많이 제거하십시오. 또한 존재할 수 있는 수막 위의 두꺼운 흉터 조직을 제거하십시오.

젤 폼이 모두 제거되면 척수를 식염수로 덮습니다. 출혈이 보이면 젤라틴 스펀지를 사용하여 출혈을 막으십시오. 필요한 경우 소작 중에 소작을 사용하십시오.

척수를 만지지 않도록 주의하고 식염수와 젤 폼으로 덮여 보관하십시오. 이제 침수 유체를 담을 수 있는 우물을 만들고 시아노아크릴레이트 접착제로 피부와 조직을 밀봉합니다. 그런 다음 두 클램프 사이에 치과용 아크릴 우물을 형성합니다.

우물이 경화될 시간을 주십시오. 경화되면 인공 CSF로 우물을 채웁니다. 이 단계에서 출혈을 계속 모니터링하십시오.

이 시점에서 선택적으로 형광 혈관 다이를 꼬리 정맥에 주입합니다. 이미징 중 혈관을 강조하려면 70킬로달톤 양자점 이상의 형광 DExT 가닥 또는 형광 표지된 렉틴을 사용합니다. 이미징하는 동안 통제된 환경에서 마우스를 섭씨 37도로 유지 현미경 단계에서 성공적인 준비를 위한 가장 중요한 단계는 척수가 깨끗하고 출혈이 없으며 눈에 보이는 호흡 인공물이 없는지 확인하는 것입니다.

이미징 중에 주기적으로 동물의 호흡을 모니터링하여 마취 수준을 확인하며, 이는 분당 60회에서 100회 사이여야 합니다. ISO 불소 수치를 조정하여 마취를 교정합니다. 이미징 후 동물을 수술 부위로 되돌려 놓고 척추 클램프를 제거하고 피부에서 아크릴을 잡아당깁니다.

그런 다음 초기 수술이 끝날 때와 같이 나중에 이미징을 위해 마우스를 닫거나 부상 후 5일 후에 안락사시킬 수 있습니다. 겸자 삽입 부위는 여전히 볼 수 있지만 염증으로 인한 2차 손상으로 인해 병변의 크기가 커지기 시작했습니다. 병변의 공동 끝에 있는 축삭돌기는 부상의 초기 위치에서 후퇴했습니다.

동시에, CX 3 C one 양성 세포, 미세아교세포 또는 대식세포의 대규모 유입이 병변 미세환경 내에서 이러한 세포의 행동을 식별하기 위해 크러시 병변 내부 및 주변에 침투하는 것을 볼 수 있으며, 방사선 키메라 모델이 먼저 사용되었습니다. CX 3 CR 1 양성 GFP 마우스의 골수 전구 세포는 비형광 기증자 세포로 대체되었으므로 GFP 양성 CNS 상주 미세아교세포만 볼 수 있습니다. 둘째, 비형광 마우스의 골수 전구 세포를 골수 유래 세포를 보기 위해 CX 3 CR 1 양성 GFP 마우스의 골수 세포로 대체했습니다.

부상 전에 검출된 유일한 골수 유래 GFP 양성 세포는 대부분 주혈관이었으며, 이는 크러시 부상 후 골수에서 지속적으로 교체되는 것으로 보고되었습니다. CX 3 C 1 양성 GFP 세포는 병변을 둘러싼 혈관 내부를 따라 증가합니다. 또한, 병변 중심은 침투하는 CX 3 CR 1 양성 GFP 대식세포로 채워졌습니다.

이 기술을 사용하면 척수 및 다른 질병 모델 내에서 상호 작용을 식별하기 위해 다른 형광 세포 집단을 라벨링하기 위해 다양한 형질 전환 동물을 사용할 수 있습니다.