Name: 신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염 생체와 톡소 포자충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 배우세요 Toxoplasma gondii에 감염된 신경 세포의 3차원 이미징 및 분석 방법을. 이 프로토콜은 160 µm 두께의 마우스 뇌 조각을 투명화하고 공초점 현미경으로 촬영하여 기생충과 감염된 뉴런 간의 공간적 관계를 시각화합니다.

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우리는 도움이 토론 전체 Koshy 실험실 감사합니다. 우리는 패티 Jansma과 조언을 애리조나 신경 과학학과의 대학 감사 및 이미징에 도움이됩니다. 우리는 또한 자신에 vibratome의 사용을 Porreca 실험실 감사합니다. 이 연구는 미국 국립 보건 연구소 (NIH NS065116, AAK)에 의해 지원되었다.

참고 : 마우스는 아리조나 대학에서 음식과 물을 사용할 수 임의로 빛 / 어둠주기를 반전 사육 12 시간과 온도 및 습도 조절 실에서 유지되었다. 실험 지침과 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인하에 실시 하였다. 모든 노력은 고통을 최소화하기 위해 만들어졌다. Cre 호텔 - 기자 마우스 C57BL / 6 배경 (11)에 있으며 상업적으로 사용할 수 있습니다. 1. 마우스 감염 참고 : - (12) 아래에 설명 톡소 포자충와 마우스 감염의 방법은 이전에 10 발표 된 연구에 사용되어왔다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 섬유 아세포 (HFFS) 인간 포피 톡소에서 균주를 성장 둘 베코 고혈당 배양 이글스 중간 (DMEM)를 10 % FBS가 보충 된 수정, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ strept5 % CO 2 인큐베이터 안에서 T-25 플라스크에서 omycin, 및 2 mM L- 글루타민 (cDMEM)는 기생충 큰 parasitophorous 액포가 형성 될 때까지. </li><li> 다음, 27 게이지 바늘에 연결된 5 ㎖ 주사기 경우에 모든 용액을 전송 플라스크 내부의 2 배를 플라스크의 바닥으로부터 세포를 긁어 및 3 ㎖ 주사기에 연결된 25 게이지 바늘을 통해 생성 된 용액을 통과시킴으로써 주사기 용출 기생충 그 거꾸로 15 ML 원뿔 관 내부에 배치되었습니다. 주사기 플런저를 연결하고 원뿔 튜브에 기생충 솔루션을 전달합니다. </li><li> 원심 분리기 (300)의 X g에서 10 분 동안 튜브. 그리고 나서 상등액을 4-6 ml의 멸균 USP 등급 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.4 (원액)에 펠렛을 재현 탁 대기음. </li><li> 기생충 가운데 큰 사각형의 네 모서리와 중앙 광장에 기생충의 수를 다음 정착 계산하는 원액 10 μL와 혈구를 넣고 5 ~ 10 분을 기다립니다. </li><li> 파라 희석100K / 200 μL의 적절한 접종량에 사이트 후 PBS 200 ㎕의 총 부피로 복강 내 (IP) 주입 된 마우스 배일. 참고 :이 절차를 들어, 마우스는 100K 유형 III (CEP) PBS 1X 200 μL 13 tachyzoites에 접종 하였다. 톡소 플라스마의 다른 균주와 마우스를 감염되면 접종의 농도는 독성의 수준을 고려하여 조정해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 2. 관류 및 뇌 수확 주 :이 낭종 피크 번호 마우스의 뇌에서 발견되는 시점을 나타내는 바와 같이이 프로토콜은 이십일일 감염 후의 수 (dpi)에서 수행되었지만, 다른 시점이 사용될 수있다. 17 - 낭종 크기, 개수, 위치 및 유무 마우스 균주, 균주 기생충 타입뿐만 아니라 접종량 7,14를 포함하는 다양한 인자에 의존한다. 수사관들은 개별적으로 마우스와 Toxoplas에 대한 적절한 접종을 결정해야합니다엄마의 변형은 그 / 그녀는 사용합니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 설치 모든 수술 수확 도구 (그림 1). </li><li> 각 마우스의 경우, 준비하고 얼음에 보관 : 0.9 % 염화 나트륨 (NaCl을) 가득 20ml의 주사기를 + 10 U / ㎖ 헤파린 1X 멸균 USP 등급 PBS (헤파린 / 식염수)에; 20 ML의 주사기는 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 가득; 15 ml의 4 % PFA와 섬광 유리 병. 여러 쥐를 들어, 각 관류 솔루션의 전체 신선한 주사기를 그리는 모든 마우스에 필요한 각 솔루션의 전체 양 가득 비커를 준비합니다. </li><li> 200 μL / 케타민 / 크 실라 칵테일의 체중 25g (24 ㎎ / ㎖ 및 4.8 ㎎ / 각각 ml)에 관심이있는 날에 함께 마우스 IP를 마취. 발가락 핀치 반사를 확인하여 마취의 수준에 대한 마우스를 모니터합니다. 마우스가 회사 발가락 핀치에 대한 응답을 보여줍니다 만하면 프로토콜을 계속합니다. 주 : 마취 적절한 레벨에 도달하기 전에 마취로하는 다른 방법은 한 사용될 수있다프로토콜을 진행. </li><li> 적용 대상 거품 플랫폼에서 앙와위에서 마우스를 놓습니다. 다음 70 % 에탄올 (EtOH로) (그림 2A)와 함께 가슴과 복부를 스프레이 발 사지를 핀입니다. 무균 마우스하에 여러 종이 타월 첨가 관류 액의 오버 플로우를 흡수하는 데 도움이 될 수있다. </li><li> 단지 집게로 흉골 아래 리프트 피부는 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다. 가슴 (그림 2B)을 노출 다시 피부를 당겨. </li><li> 과정을 칼 모양의 올리고 퉁명스럽게 멀리 다이어프램에서 해부 간을 노출, 횡격막 바로 아래 복부 절개를합니다. 두 절개, 왼쪽에 하나, 다이어프램을 통해 오른쪽 갈비뼈 아래에 하나를 확인합니다. 약 1 / 2-2 / 3의 방식으로 다음 흉강 (그림 2C)를 열고 다시 반사되어 흉곽을 좌우 절개를 확장 할 수 있습니다. 참고 : 관리법은 장기를 잘라하지 않거나 주요 혈관 뒤관류의 품질을 손상 그럴 경우로이 절차를 반지. </li><li> 10 ~ 20 ml의 4 % PFA 다음 10 ~ 20 ml의 헤파린 / 식염수로 transcardially 관류. 참고 : 관류가 제대로 수행 할 경우, 간 (그림 2D)를 황갈색 빨간색에서 켜집니다. 올바르게 수행되지 않으면 혈관 표시 (도 2E)이 될 것이다. </li><li> 복부에 마우스를 뒤집어서 다시 핀 피트는 70 % EtOH로 머리와 목 스프레이. 목의 기지에서 피부를 들어 올려 절개를합니다. 두개골 (그림 2 층)을 노출 피부를 제거합니다. 어깨 레벨 헤드 참살. 부드럽게 뇌를 제거, 두개골을 제거하고, 4 % PFA (그림 2G-H)로 가득 섬광 유리 병에 넣습니다. 참고 : 잘 관류 경우, 뇌가 눈에 보이는 혈관 (그림 2I) 흰색 나타납니다. 뇌 관류 잘되지 않으면 혈관 표시 (도 2J) 될 것이다. </li><li> 불꽃 배치4 ° C에서 4 % PFA 뇌와 기의 유리 병 하룻밤, 빛 덮여. 냉장 1X PBS로 가득 찬 새로운 섬광 유리 병에 비 USP 등급 1X PBS의 뇌와 전송을 씻어. 빛 덮여 4 ° C에서 1X PBS의 뇌를 저장합니다. 노트 : 청소 및 이미징은 최대 한 달 동안 1X PBS에 저장 섹션으로 수행하지만, PFA 고정 역 것이다 PBS에서 장기간 보관으로 몇 일 이내에 뇌가 최적의 이미지 미만으로 이어질 수있는이 부분에 가장 적합한되었습니다 . 자기 형광 증가 흐림는 한 달 이상 1X PBS에 저장 한 후 몇 군데 일부 섹션에서 언급되었다. </li></ol> 3. 뇌 단면 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1X PBS에서 뇌를 제거하고 더 정확한 수 있도록 뇌 매트릭스 (그림 3A)에 배치, 심지어 뇌를 잘라냅니다. 존재하는 경우, 소뇌 및 후각 전구를 손질 한 다음 2 ~ 3 개의 섹션으로 coronally 뇌를 잘라. <li> 시아 노 아크릴 레이트와 시편 장착 블록 위에 각각의 뇌 부분을 붙입니다. 지원 뇌 부 (도 3b) 뒤에 5 % 아가 로즈 겔의 소 블록을 부착. 주 : 다른지지기구가 사용될 수 있지만,지지 않고, 요철 단면에 vibratome 원인 뇌 밀어있다. </li><li> 에 vibratome와 두꺼운 섹션 4의 속도와 9의 진폭으로 설정 160 μm의 (영상에 사용되는 목적의 작동 거리)로 조직을 잘라. 주 : 속도 및 진폭의 설정이 특정 시스템에 따라 조정될 수있다, 심지어 부드러운 부분을 얻기 위해 사용된다. 설정이있는 경우올바르지 않은 결과는 단차, 조직 또는 채터 마크의 인열 될 수있다. </li><li> 그들은 1 주일 이내에 삭제하려는 경우 1X PBS 차게 신선한 가득 섬광 유리 병으로 조직 섹션을 수집합니다. 섹션 1 주일 이내에 삭제하지 않을 경우, -20 ° C에서 cryopreservative 솔루션 및 저장 가득 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 넣 섹션. </li></ol> 뇌 조직 섹션 4. 광학 지우기 참고 :이 프로토콜은 이전에 발행 된 방식 8에서 수정되었습니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1X PBS + 2 % 트윈 -20 (GL / PBST)에서 25 %, 50 %, 75 % 및 90 % 부피 / 부피 글리세롤을 준비한다. </li><li> cryopreservative의 경우, 1X PBS로 씻어 내고, 25 % GL / PBST 10ml를 포함하는 섬광 유리 병에 전송, 1X PBS에서 섹션을 제거하거나. 12 시간 동안, 노출 빛에 덮여 4 ° C에서 진탕에 배치 유리 병. </li><li> 모든 섹션이 보에 침몰했는지 확인유리 병의 ttom. 섹션은 다음 12 시간 동안 빛에 노출 적용, 4 ° C에서 진탕에 10 ml의 50 % GL / PBST와 유리 병 및 장소를 채우기 충당하기 위해 충분한 떠나, 25 % GL / PBST를 대기음. 75 % GL / PBST 후 90 % GL / PBST에 대해이 과정을 반복합니다. 최대 청산에 도달하기 위해 24 시간 동안 90 % GL / PBST에 섹션을 남겨주세요. 삭제 절차의 과정 동안 점진적 광 소거 (도 4)를 관찰한다. 참고 : 솔루션 섹션은 유리 병의 바닥에 침몰 직후 변경된 경우이 과정이 신속 할 수있다. 75 % 및 90 %의 솔루션으로, 절은 유리 병의 바닥에 모든 방법을 침몰되지 않지만 중간에 떠. </li></ol> 5. 설치 뇌 조직 섹션 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 스페이서를 만들기 위해 5 조각으로 제 1.5 커버 슬립을 잘라. 도 5a에 표시된 점선을 따라 커버 슬립 점수 및 휴식 통치자와 다이아몬드로 만들어진 연필을 사용합니다. 취소 t그는 창을 생성하기 위해 일반 유리 슬라이드에 4 개의 외부 조각을 마련, 조각을 중심하고 올바른 구성 (그림 5B)에서 슬라이드로 스페이서의 조각을 준수하기 위해 솔기에 투명 매니큐어를 브러시. 참고 : 스페이서 슬라이드 및 삭제 섹션을 장착 커버 슬립 사이에 필요한 공간을 만드는 데 사용됩니다. coverslip에 필요한 모든 크기의 창을 만들 수있는 다른 방법으로 절단 될 수있다. 사전 컷 거품 스페이서도 시판되고있다. 매니큐어가 완전히 건조 할 수 있도록하기 위해서는 적어도 하루 전에 설치 섹션에 스페이서 슬라이드를 만드는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 팁 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 슬라이드로 전송 섹션은 차단. 90 % GL / PBST로 주변 지역을 작성해야합니다. 조심스럽게 확인 모든 거품을 소개 않도록주의하면서 섹션을 통해 커버 슬립을 낮 춥니 다. 초과 GL / PBST는 보풀이없는 닦아 멀리 악인 할 수있다. </li><li> 이미지 GFP + RFP를 포함하는 신경 세포 + <em&gt; 공 초점 현미경 즉시 (그림 7A-B) 저장 한 다음 슬라이드는 평평하고 4 ℃에서 빛 덮여 톡소 포자충 낭종. 참고 : 또한, 인감 완전히 주위의 모든 모서리를 저장하고 나중에 영상화하는 슬라이드. 슬라이드를 밀봉 명확한 매니큐어의 사용은 선택 사항이고 다른 하나는 추가 처리를 위해 나중에 슬라이드에서 섹션을 제거 할 수 있다면 더욱 어렵게 커버 슬립을 제거 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 이미징 주 : 현미경 고해상도 Z-스택을 얻는 능력을 갖고 사용할 수있다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 처음에 10 배에 초점면을 발견 한 후, 20 배 목표로 변경하고 GFP + 세포 내부에있는 낭종을 식별 할 섹션을 통해 스캔 할 수 있습니다. 시야에 대한 관심 (ROI)의 지역 센터입니다. </li><li> 40X 목표로 변경합니다. 있는지 확인하기 위해 전체 투자 수익 (ROI)을 통해 아래로 초점 전체 셀 및 CYST는 볼 수 있습니다. 참고 : 이미지는 40X / 1.30 오일 DIC M27의 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 얻을 수 있었다. </li><li> 설치된 이미징 소프트웨어를 사용하여, 낭종 셀 전체를 포함 Z 스택을 얻었다. 이미지를 획득하기 위해 보통 사용되는 설정은도 6에 도시되어있다. 참고 : 설정은 각 연구자의 조직 섹션과 현미경의 기능에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 돌기 (64)의 개수를 설정하여 전체 뷰를 구하는 회전 1. 돌기의 수를 설정하여 Z-스택의 최대 투영 화상을 얻는다. 주 : 다른 소프트웨어 패키지가 이용 가능하며 최대 투영을 얻기 위해 사용될 수 있고, 회전뿐만 아니라 Z 스택의 다른 이미지보기. </li><li> 영상 분석 소프트웨어와 이미지를 분석합니다. </li></ol>

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감염된 숙주 세포에서 세포 변화는 HIV, 광견병, 클라미디아 (18, 19)와 같은 다른 세포 생물과 감염 질환의 결과에 연결되어 있음을 감안할 때, 우리는 우리가 CNS 사이에 발생하는 친밀한 상호 작용을 연구 할 수 있도록 해주는 기술을 개발 세포 및 톡소 플라스마를 개최. 여기에 기재된 방법은 만성 감염 뉴런의 효율적인 이미징을 가능하게함으로써 이러한 목표를 달성한다. 이 방법의 개발에 앞서, 이러한 이미지는 시간 소모, 비용이 많이 드는, 또는 수 없었습니다. 우리는 지금과 같은 기생충의 대상이 특정 신경 세포의 영역이다과 톡소 -neuron 상호 작용에 관한 기본적인 질문에 대답하기 위해이 기술을 사용할 수 있습니까? 이 톡소 균주 사이에 차이가 있습니까? 낭종 (즉 감염된 않고 신경 세포로부터 감염되지 않은 동일한 돌기가 등뼈의 수가 동일한 셀의 다른 상이 존재하는 셀룰러 영역을 ...

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 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

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Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

이 방법의 전체 목표는 고해상도, 의무적 인 세포 내 기생충 톡소 포자충에 감염 개별 뉴런의 3 차원 영상을 얻는 것이다. 톡소 때문에 종종 인간과 설치류를 포함 대형 중간 숙주 범위의 가장 성공적인 기생충 중 하나를 간주됩니다. 인간과 쥐 모두에서, 오염 된 음식이나 물을 섭취를 통해 급성 감염 후, 톡소 플라스마는 양식을 그 느린 복제로의 빠른 복제 양식 (tachyzoite)에서 변환 encysting에 의해 중추 신경계의 지속적인 감염을 일으킬 수있다 (bradyzoite ). 면역 개인,이 잠재 중추 신경계 감염은 비교적 증상이없는 것으로 생각되지만, 에이즈 환자 또는 이식 환자와 같은 면역 개인에, 기생충의 재발은 치명적인 toxoplasmic 뇌염 1,2로 이어질 수 있습니다. 또한, 최근의 연구 하메커니즘은 알 수없는 남아 있지만 톡소 플라스마와 잠재 감염, 설치류 3,4의 행동 변화로 이어질 수있는 것으로 나타했습니다. 놀랍게도, CNS- 톡소 상호 작용의 중요성을 강조하는 이들 데이터에도 불구하고, 비교적 작은, 특히 세포 및 분자 수준에서,이 관계에 대해 공지되어있다. 뇌 기생충 상호 작용의도 간단한 측면을 연구하는 기능은 technologic의 제한에 의해 부분적으로 방해하고있다. 예를 들어, 대부분의 작업은 뉴런 낭종 전자 현미경 (EM) 5,6- 수행 한 지속되는 셀임을 나타내는. EM은 높은 해상도를 제공하지만, 그것은 시간이 소요, 노동 집약적, 비싸다. 면역 형광 (IF) 분석은 최근 EM (7)에 의해 수행 된 작업을 확인하기 위해 공 초점 현미경과 함께 사용되어왔다. 분석은 수행 할 기술적으로 쉽고 상대적으로 저렴하지만, 언더에 이러한 기술을 사용하는 경우TAND 낭종과 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계는 시간, 기술적으로 어려운 소비하고, 중요한 정보의 손실을 초래할 수있는 시리얼 재건을 필요로한다. 따라서, 우리는 CNS의 톡소 플라즈마 증의 마우스 모델을 사용하고 EM 또는 면역 조직 화학 (IHC)없이 이미지에 감염된 신경 세포의 전체를 우리를 허용 할 수있는 방법을 개발했다. 이러한 기술을 개발함으로써, 우리는 상대적으로 신속하고 저렴한 방법으로 감염된 세포와 낭종 사이의 세포의 관계를 탐구하기 시작할 수 있습니다. 우리가 개발 한 방법은 기생충 단백질 9,10 주입 된 생체 세포에 표시하는 시스템과 공 초점 현미경 (8)에 의해 광학적으로 청소 및 이미징 두꺼운 뇌 섹션에 대한 새로운 기술을 결합합니다. 이 시스템에서는, 톡소와 재결합 11 치운다 매개 된 후에 만 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 치운다 리포터 생쥐에 감염 </em&gt; 적색 형광 단백질 (RFP)를 표현하고 숙주 세포 (9)에 Cre 호텔 재조합 효소를 주입 계통. 이 조합은 중추 신경계 감염이 설정된 후, 감염된 마우스의 뇌를 수확 두께 뇌 부분을 잘라 빠르게 RFP + 낭종을 찾아 이미지에 관련된 영역을 식별 할 수있게 해준다. 또한 GFP의 숙주 세포 발현 GFP + 세포의 수는 10 기생충을 포함하지 않는, 기생충 감염에 의해 Cre 호텔의 주입에 전적으로 의존하지 같이 것을 주목하는 것이 중요하다. 이 프로토콜의 목적은 화상 전체의 감염된 뉴런 할 수 있도록하기 때문에, 초점은 GFP + 또한 RFP + 낭종이 포함 뉴런이지만, 프로토콜은 또한 이미지에 GFP + / RFP를 사용할 수 - 뉴런. 감염된 뇌 수확 및 절단되면, 섹션은 글리세롤 청산에 의해 투명하게 렌더링됩니다. 섹션들의 적절한 영역이어서 초점 현미경, 알을 촬상감염된 숙주 세포 및 그 전체 포낭 기생충과 같은 전례 시각화. 여기서 우리는 식별을위한 완전한 프로토콜, 광학 청소, 및 이미징 감염된 신경 세포를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Vibratome 시리즈 1000 절편 시스템</td><td>기술 제품 International, Inc.</td><td></td><td>다른 진동종도 호환됩니다</td></tr><tr><td>. 글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>프리미엄 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 커버슬립</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 메타 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&reg; 케타민 HCl Inj., USP 100 mg / ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&reg; 주사 자일라진 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>7906</td><td>B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm6 (CAG-ZsGreen1) Hze / J</td></tr><tr><td>수술 장비</td><td></td><td></td><td>엄지 집게; 가위가 옆으로 기울어져 있고 날카롭습니다. 날카롭고 날카로운 가위; 켈리 지혈; 마요네즈 가위; 마이크로 주걱.</td></tr><tr><td>인간 포피 섬유아세포(HFF) 세포</td><td></td><td></td><td>이들은 인간 포피의 일차 세포입니다. 우리는 이것을 사내에서 만들지만 외부 공급 업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Dulbecco의 High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 용액, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 경사형 목 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 1x 없음 칼슘 및 마그네슘</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 10x, USP 멸균 울트라 퓨어 등급</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line 혈구계</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>마우스 뇌 슬라이서 매트릭스</td><td>Zivic 기기</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20ml 일회용 섬광 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>알코올, 에틸, 95%, 190 프루프</td><td>사내</td><td>17212945</td><td>이 제품은 사내 창고에서 구입합니다.&nbsp; 다른 회사도 호환됩니다.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear 네일 폴리쉬</td><td></td><td></td><td>다른 브랜드는 호환 가능</td></tr><tr><td>10 ml 주사기와 Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>다른 주사기는 호환</td></tr> 가능 <tr><td>Three-way Stopcock</td><td></td><td></td><td>모든 브랜드가 호환</td></tr><tr><td>가능 Hypodermic needle</td><td></td><td></td><td>모든 브랜드가 호환 가능 - 마우스를 고정하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>셀 스크래퍼</td><td></td><td></td><td>모든 브랜드가 호환됩니다</td></tr><tr><td>. 25 G x 12" 튜빙, 안전 혈액 채취 세트, 루어 어댑터와 함께</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>다른 브랜드도 호환됩니다</td></tr></tbody></table>.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염 생체와 톡소 포자충

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

톡소 포자충은 인간과 설치류를 포함한 광범위한 호스트 범위와 의무적 인, 세포 내 기생충이다. 모두 인간과 설치류에서, 톡소 플라스마는 뇌의 평생 지속적인 감염을 설정합니다. 이 뇌 감염이 태아 또는 뇌의 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS) 환자에 대한이 편애 및 지속성 등의 면역 개인, 대부분의 면역 사람들 무증상이지만 파괴적인 신경 학적 질환으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 뇌 - 톡소 상호 작용에 의해 생성 톡소 질병 증상에 중요하다, 그러나 우리는 중추 신경계 (CNS) 및 기생충 세포 간의 세포 또는 분자 상호 작용의 이해가 작은 것은 분명하다. CNS의 마우스 모델에서이 신경 기생충가 지속되는 세포 인 30 년 이상 알려져있다 톡소 플라스마 증,하지만 약간의 정보는 약 사용 가능신경 세포의 일부는 일반적으로 (소마, 수상 돌기, 축색 돌기를) 감염이 세포 관계는 긴장 사이에서 변경하는 경우. 부분에서는 부족은 촬상의 어려움과 이차 전체 감염된 동물로부터 신경 세포를 시각화한다. 이러한 이미지는 통상적으로 직렬 절편 및 전자 현미경 또는 면역 염색 후 공 초점 현미경에 의해 촬상 조직 봉합을 필요로한다. 몇 가지 기술을 조합하여, 여기에 기재된 방법은 면역의 필요없이 입체 시각화 및 개별 만성적 감염 뉴런의 분석을 가능하게 식별하고 낭종이 포함 된 이미지 전체 셀에 두꺼운 부분의 사용 (160 μm의) 사용, 전자 현미경 , 또는 직렬 절편과 바느​​질. 이 기술을 사용하여, 우리는 기생충 감염 및 신경 세포 사이의 관계를 이해하기 시작할 수있다.

도 7은 A와 B가이 새로운 것을 낭종 함유 개의 상이한 160 μm의 두께 부분뿐만 아니라,도 7b에 대한 낭종 간 세포 몸으로부터의 거리의 대표적인 측정. 도면으로부터 GFP + 뉴런을 도시 7 개의 대표 화상을 포함 프로토콜은 그 전체가 감염된 신경 세포의 가시화를 허용.도 7c는이 영상 법으로는 낭종 세포체 (Imaris 7.7) 사이의 거리를 정량화하는 것이 가능하다 것을 알 수있다.도 7D는도 전체 회전 도면 7B. 이와 같이 Z 스택의 시각화 셀 낭종 완전 공략 검증을 허용한다.도 7E는도 7D의 화상에 낭종으로부터의 거리를 측정하는 Imaris 7.7 소프트웨어에 의해 분석 될 수있는 방법을 보여주는 3 차원 회전 동영상 인 전지 본체 중 어느 하나로부터...

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다.

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

이 절차의 전반적인 목표는 톡소플라스마 간디 낭종에 감염된 뉴런을 완전히 시각화하는 것입니다. 이것은 M 체리를 발현하는 기생충으로 Cree 리포터 마우스를 먼저 복강내 감염시키고 CRE 재조합효소를 숙주 세포에 주입하도록 조작됨으로써 달성됩니다. 중추신경계 감염이 확인되면 두 번째 단계는 헤파린 식염수로 경 심장 관류를 수행한 다음 4%파라알데히드를 수행하는 것입니다.다음으로, 뇌를 적출하여 후각구와 소뇌를 제거하고 버리고 나머지 뇌를 두 부분으로 자른 다음 반쪽을 160미크론 두께의 부분으로 나눕니다. 마지막 단계는 등급이 매겨진 글리세롤 PBS 트윈 용액으로 절편을 비우고 슬라이드에 장착하여 컨포칼 마이크로 현미경으로 이미징하는 것입니다. 궁극적으로 3D 렌더링 및 분석이 가능한 소프트웨어로 이미지를 분석할 수 있으며, 이 방법을 사용하여 낭종과 감염된 뉴런 사이의 세포 관계를 보여줄 수 있습니다.두꺼운 절편을 연속적으로 절단, 염색 및 재구성하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있는 염색 및 재구성에 대한 요구 사항을 제거한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구 전문가인 Carla Cabral입니다. 톡소플라스마 간디에 감염된 쥐의 뇌를 뇌 매트릭스에 넣어 소뇌와 후각구를 정확하고 균일하게 잘라내는 것으로 이 절차를 시작합니다.그런 다음 뇌를 두 개의 관상 절편으로 자릅니다. A: 각 뇌 절편을 Sano acrl로 표본 장착 블록에 고정합니다. 그런 다음 지지를 위해 뇌 섹션 뒤에 5%Aros 젤의 작은 블록을 부착합니다.조직을 160미크론 고정 섹션으로 자르고 viome을 속도 4와 진폭 9로 설정합니다. 그런 다음 조직 절편을 일주일 이내에 제거할 경우 신선하고 냉장된 XPBS로 채워진 섬광 바이알에 옮깁니다. 일주일 이내에 섹션을 청소하지 않을 경우 극저온 방부액으로 채워진 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.이제 하나의 XPBS에서 부피당 25%50%75% 및 90% 부피의 글리세롤을 준비하고 20 사이에 2%를 준비합니다. 다음으로, 하나의 XPBS에서 절편을 제거하거나, 극저온 방부제에 들어 있는 경우 하나의 XPBS로 헹구고 10ml의 25% 글리세롤 PBST가 들어 있는 섬광 바이알로 옮깁니다. 뚜껑을 덮은 바이알을 셰이커에 놓습니다.빛에 노출되지 않도록 바이알을 덮고 섭씨 4도에서 12시간 동안 배양합니다. 12시간 후 모든 섹션이 바이알 바닥으로 가라앉았는지 확인합니다. 25%글리세롤 PBST를 흡입하여 단면을 덮을 만큼만 남겨둡니다.그런 다음 10ml의 50% 글리세롤 PBST가 들어 있는 바이알을 만듭니다. 바이알을 셰이커에 올려 놓고 빛으로부터 보호하십시오: 섭씨 4도에서 12시간 동안 더 배양합니다. 75%글리세롤 PBST 및 90%글리세롤 PBST에 대해 이 과정을 반복하면 섹션이 바이알 중간에 떠 있는 상태로 유지됩니다.최대 투명화에 도달하기 위해 90% 글리세롤 PBST의 절편을 24시간 동안 그대로 두십시오. 이제 숫자 1.5 커버 슬립을 자와 다이아몬드 팁 연필로 5 조각으로 잘라 스페이서를 만듭니다. 중앙 장식을 버리고 4개의 바깥쪽 조각을 일반 유리 슬라이드에 배치하여 창을 만듭니다.그런 다음 이음새에 투명한 매니큐어를 바르고 스페이서 조각을 올바른 구성으로 슬라이드에 부착합니다. 다음으로, 팁이 잘린 플라스틱 피펫을 사용하여 섹션을 슬라이드로 옮깁니다. 주변 지역을 90% 글리세롤 PBST로 채워야 합니다.그런 다음 섹션 위에 커버 슬립을 조심스럽게 놓고 거품이 생기지 않도록 주의하십시오. 과도한 글리세롤 PBST는 보푸라기가 없는 물티슈로 제거할 수 있습니다. 나중. 이미지 : RFP 양성 톡소 플라스마 간디 낭종을 포함하는 GFP 양성 뉴런을 컨 포칼 현미경으로 완성하면 슬라이드를 평평하게 보관하고 섭씨 4 도의 빛으로부터 덮습니다.여기에 표시된 것은 RFP 양성 낭종을 포함하는 GFP 양성 뉴런의 최대 투영 이미지입니다. 이것은 세포의 3D 회전 동영상입니다. 이 이미지는 낭종의 가장자리와 세포체의 가장자리 사이의 거리에 대한 홍채 생성 직접 라인 측정을 보여줍니다.이 예에서 거리는 149미크론으로 측정되며, 다음은 낭종과 세포체 사이의 중간에서 중간, 가장자리에서 가장자리 측정을 보여주는 IMS에서 생성된 3D 동영상입니다. 일단 마스터하면 이 절차를 따라 적절하게 수행하면 이 기술을 4-5일 내에 완료할 수 있습니다. 감염된 수상돌기와 감염되지 않은 수상돌기 사이의 배턴수 수를 세는 것과 같은 추가 분석을 수행하여 낭종이 정상적인 신경 기능을 방해하는지 여부와 같은 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을...

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

Toxoplasma gondii는 조직 문화 모델 했었 수있는 환경 스트레스에 대한 응답으로 낭종 형태로 변환됩니다. 이 동영상은 골수 파생 macrophages 뼈를 활성화하거나 fibroblast 세포 성장 매체 산도를 변경하여 낭종 벽 형성을 검토하기 위해 기술을 보여줍니다.

활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

소설로 루시 페라 제 및 생체 이미징 시스템 (IVIS)에서를 활용하면 임상 개발가 발생하기 전에 질병 끝점을 식별 할 수 의미합니다. IVIS은 우리가 미래 연구를위한보다 정확한 질병 모델을 제공 실시간으로 여러 일 동안 encephalitic 바이러스의 침입을 시각화 할 수 있습니다. 또한 우리는 신속하게 현재 활용 동물 모델보다 antivirals과 백신의 잠재적 인 보호 기능을 식별 할 수 있습니다. 여러 시간 지점을 통해 개인 동물을 활용하는 기능은 감소 동물의 요구 사항, 비용, 질병 연구의 더 인간적 더 과학적인 수단을 확보 활용 동물 전반적인 질병을 보장합니다.

신경 침윤성 Encephalitic 바이러스의 생체 이미징 시스템 (IVIS) 검색에서

출처: Zaeck, L., et al. 용매 세척 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징. J. Vis. Exp. (2019).  이 비디오는 감염 진행을 평가하기 위해 광견병 바이러스(RABV)에 감염된 쥐의 뇌 조직을 준비하고 이미징하는 과정을 보여줍니다. 형광 마커를 사용한 조직 염색, 탈수, 투명화, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 검사를 위한 장착을 포함한 주요 단계를 간략하게 설명하여 3차원 표현을 생성하는 것으로 마무리합니다.

쥐 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 3차원 시각화

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

설명된 파이프라인은 기가바이트보다 큰 전자 현미경 데이터 세트를 세분화하여 전체 세포 형태를 추출하도록 설계되었습니다. 셀을 3D로 재구성하면 개별 요구를 중심으로 설계된 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 3D로 직접 정성적 및 정량적 분석을 수행할 수 있으며 가상 현실을 사용하여 뷰 오클루전을 극복할 수도 있습니다.

신경교 세포와 신경 세포의 3D 재건 및 가상 현실 분석을위한 방법

본 프로토콜은 손상되지 않은 깨끗한 장기 및 조직에서 증식 및 휴면 중인 트리파노소마 크루지 기생충 및 T 세포를 시각화하고 정확하게 정량화하기 위한 광시트 형광 현미경 및 자동화된 소프트웨어 지원 방법을 설명합니다. 이러한 기술은 치료 결과를 평가하고 기생충-숙주 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

트리파노소마 크루지 감염 세포, 휴면 무산소 및 손상되지 않은 정화 장기의 T 세포의 정량적 3D 이미징

이 논문은 인간 특이적 항-CD19 단클론 항체를 방사선 표지하는 방법론과 생체 내 PET 이미징, 생체 외 감마 계수 및 자가 방사선 촬영 접근법을 사용하여 다발성 경화증 마우스 모델의 중추 신경계 및 말초 조직에서 B 세포를 정량화하는 데 사용하는 방법을 자세히 설명합니다.

양전자 방출 단층 촬영을 사용한 실험적 자가면역 뇌척수염 마우스 모델에서 CD19+ B 세포 이미징

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

배우세요 Toxoplasma gondii에 감염된 신경 세포의 3차원 이미징 및 분석 방법을. 이 프로토콜은 160 µm 두께의 마우스 뇌 조각을 투명화하고 공초점 현미경으로 촬영하여 기생충과 감염된 뉴런 간의 공간적 관계를 시각화합니다.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염 생체와 톡소 포자충

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