생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

다음 실험의 전반적인 목표는 칸디다 알비칸스 세포에 의한 생체 내 생물막 형성의 비침습적 모니터링을 위한 루시페라제 발현 균주의 사용을 검증하는 것입니다. 이는 칸디다 알비칸스(candida albicans)의 균주를 발현하는 루시페라아제(luciferase)로 집락화된 카테터 조각을 마우스의 등에 이식함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서 효모는 세포외 기질에 내장된 두꺼운 세포층으로 성장하여 카테터 내부에 성숙한 생물막을 생성합니다.

다음으로, 루시페라제 효소에 의해 전환될 기질을 추가합니다. 이 반응은 측정 가능한 빛을 생성합니다.생물 발광 이미징 또는 BLI는 살아있는 숙주 내에서 생물막의 형성을 기록하고 정량화하는 데 사용됩니다. 중앙 Venmo 시스템과 같은 다른 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 한 동물 내에서 최대 6개의 생물막을 테스트할 수 있으므로 통계 분석에 필요한 동물 수를 크게 줄일 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 칸디다 알비칸스 생물막 형성 치료로 확장되며, 당사의 방법은 기존 및 새로운 항진균 성분을 쉽게 테스트할 수 있기 때문입니다. 또한 이 방법은 진균 생물막인 칸디다 알비칸스(candida albicans)에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 박테리아나 다른 재미있는 종과 같은 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다.

제안된 절차는 수술 절차가 생물학적 안전 캐비닛 내에 삼중 루멘 카테터가 들어 있는 패키지를 개봉하기 24시간 전에 동물 시설에 접근할 수 있는 모든 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 불필요한 부분을 모두 제거하고 멸균 메스를 사용하여 카테터에 부착된 부분을 자릅니다. 그런 다음 플라스틱 패키지 아래에 자를 놓고 폴리우레탄 카테터를 1cm 길이의 조각으로 자릅니다.

다음으로, 각 카테터에 약 1.8ml의 100% 소 태아 혈청을 채우고 밤새 섭씨 37도에서 조각을 배양합니다. 다음 날 아침, 혈청으로 코팅된 각 카테터 조각을 개별 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고, A YPD 플레이트에서 C 알비칸스를 1-100 희석으로 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 PBS 1ml로 긁어냅니다. 계수 후, 세포 현탁액을 10의 5배의 최종 농도로 밀리리터당 네 번째 세포로 희석합니다.

그리고 혈청으로 코팅된 각 카테터 조각에 1ml의 세포를 추가합니다. 세포가 섭씨 37도에서 90분 동안 카테터에 부착되도록 합니다. 그런 다음 멸균 핀셋으로 튜브를 수직 위치로 잡습니다.

1ml의 PBS로 내강을 통해 각 조각을 두 번씩 부드럽게 세척하여 카테터를 배치합니다. 먼저 8주 된 마취된 암컷 생쥐의 허리를 발열 패드에 올려놓고 면도합니다. 그런 다음 피부를 소독하고 동물의 양쪽에 0.5-1cm의 작은 절개를 만듭니다.

다음으로 가위로 subcu를 해부하여 길이 약 1.5cm, 너비 1cm의 두 개의 피하 터널을 만듭니다. 각 터널에 3개의 카테터 조각을 삽입하여 조각이 겹치지 않고 수평 배열로 서로 옆에 놓이도록 합니다. 봉합사로 절개 부위를 봉합한 다음 소독제로 상처를 아주 부드럽게 닦아냅니다.

그런 다음 절개 부위에 직접 국소 마취제를 바르고 마취제를 투여하여 동물이 완전히 회복될 때까지 동물을 모니터링합니다. 적절한 실험 시점에서 생물막 형성을 이미지화하려면 마취된 동물의 카테터가 포함된 각 영역에 새로 준비된 코일과 테레진 100마이크로리터를 피하 주사합니다. 그런 다음 최대 신호 강도에 도달할 때까지 20초에서 60초 사이의 수집 시간으로 연속 스캔을 획득합니다.

다음 프레임을 획득하는 동안 각 카테터 트리오에 관심 영역을 배치하여 이전에 획득한 프레임의 생물 발광 이미징 또는 BLI 신호 강도를 측정합니다. 제어 영역에 고정된 크기의 직사각형 관심 영역을 배치하고 실시간 이미지 소프트웨어에서 배경 신호를 측정합니다. 각 카테터 트리오와 배경에 대한 관심 영역을 통해 광자 플럭스를 측정합니다.

생물막 형성 보고서 중 모든 동물과 다른 시점에서 이러한 측정을 반복한 후 각 카테터 트리오의 BLI 신호 강도를 초당 광자 플럭스로 보고합니다. 데이터를 복사하여 스프레드시트 프로그램에 직접 붙여넣을 수 있습니다. 종단 실험이 끝나면 피하 조직을 절단한 각 동물을 희생하고 멸균 핀셋을 사용하여 카테터 조각을 하나씩 제거합니다.

방금 시연한 것처럼 1ml의 PBS로 카테터를 두 번 세척합니다. 그런 다음 수조에서 40, 000 헤르츠의 새 PBS 1 밀리리터에 새로운 마이크로 원심 분리기 튜브의 조각을 초음파 처리합니다. 10분 후 초음파 처리하고 카테터가 들어있는 튜브를 얼음 위에 놓고 원래 샘플의 100마이크로리터를 YPD 한천 플레이트에 1-10 및 1-100 희석으로 도금합니다.

중복으로. 마지막으로 군체 형성 단위의 평균과 표준 편차를 플로팅합니다. 그리고 로그 스케일의 각 동물에 대한 BLI 신호.

이 이미지에서는 생물막 발달 후 6일이 지난 것으로 표시된 관심 영역과 함께 생물발광 신호를 표시하는 대표적인 동물이 표시됩니다. 대조군 배경 영역에서 신호가 부족하여 칸디다로 코팅된 카테터에 바로 인접한 영역에 대한 생물막의 제한을 확인합니다. 이 대표적인 실험에서는 생물막을 발현하는 루시페라아제에 의해 생성된 명확한 BLI 신호를 관찰할 수 있는 반면, 야생형 균주에 의해 생성되는 것은 배경 신호만 있는 것으로 보입니다.

이러한 신호의 증가는 생물막당 군집 형성 단위의 증가 및 각 동물 그룹에 대한 광자 플럭스 측정과 동일한 추세를 따릅니다. 이러한 데이터는 BLI가 피하 마우스 모델에서 생체 내 성숙 C 알비칸스 생물막 형성을 모니터링하고 정량화하는 강력한 기술임을 보여줍니다. 일단 숙달되면 칸디다 세포가 있는 장치의 감염은 2시간이 걸릴 수 있는 반면, 카테터 임플란트는 마우스 한 마리당 10분 안에 완료할 수 있습니다.

BLI 이미징은 마우스당 5분 이내에 수행할 수 있습니다. BLI 사용의 가장 큰 장점은 동일한 동물에서 바이오매스와 바이오필름 발달을 반복적으로 모니터링할 수 있다는 것입니다. 시간이 지남에 따라 이 절차에 따라 MRI 또는 CT와 같은 다른 방법으로 정확한 성당 위치에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.

그런 다음 이 정보는 심부 정맥 대성당 모델과 같은 더 복잡한 모델에서 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생쥐에서 in vivo, 피하 생물막, ss를 수행하는 방법을 매우 잘 이해하게 될 것이며, 이는 숙주 병원체 상호 작용에 대한 심층적인 분석을 위한 기초를 형성할 수 있습니다.