Name: mRNA의 붕괴 요금의 측정에 사카로 미세스 세 레비 시아 rpb1-1 균주 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 mRNA 붕괴 속도를 측정하는 방법을. 온도 변화로 mRNA 합성을 억제하고 Northern hybridization으로 분석하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 이해합니다.

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>jove_content<저자의 연구실에서의 연구는 텍사스 고등교육조정위원회(Texas Higher Education Coordinating Board)의 노먼 해커맨 고등연구프로그램(Norman Hackerman Advanced Research Program)과 베일러 대학교(Baylor University)의 창업 기금의 지원을 받고 있다.

효모 세포의 1. 성장 <ol><li> mRNA의 붕괴 속도 측정을 위해 활용 될 수있는 적절한 효모 균주를 선택합니다. RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제하기 위해, rpb1-1 돌연변이 일을 품고 효모를 사용합니다. 이미 하나를 가지고이 실험실에서 효모 균주를 얻거나 특정 유전 적 배경이 9 필요한 경우 표준 기술을 사용하여 실험실에서 생성. </li><li> 표준 절차 (10)를 사용하여 효모 미디어를 준비, 멸균 기술을 사용. 어떤 선택이 필요하지 않은 경우, 이러한 YPD으로 리치 미디어를 준비합니다. 및 선택 플라스미드로 형질 전환 된 효모 세포가 필요할 경우 선택적으로, 선택 배지를 준비한다. 미디어를 압력솥. </li><li> 이 효모의 허용 온도 28 ° C에서 효모 세포를 성장. 두 단계로이 작업을 수행합니다 : <ol><li> 제 들면 O / N은 ​​포화 성장 배지 5ml에 효모 세포 성장.</li><li> 둘째 날의 끝에서 두 번째 O / N을 설정한다. 제 O / N의 경우, 제 O 발 / N 100 μL 1 ㎖, 2 ㎖의 이상 범위의 성장 배지 (100~150 ㎖ 중에 효모 세포 상이한 양의 접종에 따라 효모 세포가 될 필요가있을 때 ) 다음날 수확. 문화 중 하나가 올바른 OD (600) 다음 날에 있는지 확인하기 위해이 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 수확 효모 세포 <ol><li> 효모 세포를 수확 준비합니다. 이 단계를위한 타이밍이 중요하다; 필요한 모든 튜브에 라벨을 한 곳에서 필요한 모든 장비와 자료를 수집합니다. 39 ° C의 물 목욕을 데우고 C 28 ° C에서 60 °에서 성장 미디어의 두 15 ml의 테스트 튜브를 예열. 참고 : 15 ml의 성장 배지 볼륨 세포 수확하는 시점의 수에 따라 변할 수있다. </li><li> 그들은 0.7 0.4 OD 600에 도달 할 때 효모 세포 수확. TRANSF어 4 셀 - 50 6 멸균 ml의 캡 병 나사. RT에서 5 분 동안 고속 원심 분리기에서 7,500 XG 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 28 ° C에서 평형화 된 15 ml의 성장 배지에서 펠렛을 재현 탁. 하나 멸균 250 ml의 플라스크에 효모 세포를 수영장과 28 ° C의 성장 온도에서 ~ 5 분 동안 그들을 평형. </li><li> 효모 세포가 성장 온도로 평형화 한 후, 즉시 39 ° C (nonpermissive 온도)까지 승온 후, 60 ° C로 평형화 된 성장 배지의 15 ㎖에 추가하고 즉시 39 ° C의 물을 용기에 플라스크를 배치 . 문화 매체가 전사의 전원이 켜져 있는지 확인하기 위해 나머지 세포 수확 단계에 걸쳐 39 ° C의 물을 욕조에 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 39 ° C의 물을 용기에 플라스크를 배치 한 후 다른 시간에 세포를 수확. 제 시점의 경우, # 39에 플라스크를 배치 직후에 세포를 수확176; C. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브를 3 mL를 수확하고 두에 3 ㎖를 배포 할 수 있습니다. 미니 원심 분리기에 10 초 동안 펠렛은 세포 또는 빠른 감속 picofuge 상층 액을 붓는다. </li><li> 즉시 드라이 아이스 / 에탄올 욕에서 또는 액체 질소 중에서 동결 펠릿. 세포가 제로 시점에서 수확 같은 제 시점을 지정한다. </li><li> 실험적으로 관심의 mRNA에 따라 파일럿 테스트하여 세포에 수확 후 시점을 결정한다. 일반적으로, 다음과 같은 시점에서 수확 효모 세포 : 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 및 35 분 (도 2B). mRNA의 반감기가 상술 한 시점을 이용하여 판별 할 수없는 경우,이 시점을 조절한다. 예를 들어, 예상 짧은 반감기 mRNA에 대해, 짧은 시간 포인트를 사용하는 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 18 분) 및 예상 긴 반감기 mRNA에 대해, 확장 시점. </li><li> 전지 후, 하이다RNA 추출이 수행 될 때까지 rvested는 -80 ° C의 냉동고에 저장합니다. </li></ol> 효모 세포 3. 추출 RNA <ol><li> 프로토콜의 RNA 추출 부용, RNases 의해 RNA의 분해를 방지하기의 RNase에게 무료 기법을 사용한다. 의 RNase에게 무료 솔루션, 유리 및 플라스틱 도자기는 RNA의 추출에 사용되는을 준비합니다. </li><li> 표준 프로토콜에 따라 효모 세포에서 RNA를 추출합니다. 일반적으로, 핫 페놀을 사용하는 방법 (12). 대안 적으로, 효모 세포로부터 RNA를 추출하기 위해 사용될 수있는 키트를 사용한다. </li><li> 일반적으로 260에서의 흡광도와 Nanodrop를 사용하여 RNA의 280 2 μl를 측정하여, RNA의 양과 순도를 결정합니다. 농도를 기준 (260)로부터의 RNA의 농도를 측정, 1 μg의 RNA로 희석 / DEPC 처리 된 물을 사용 μL. 참고 : 260의 비율 / t에 대한 정보를 제공합니다 (280)RNA의 고 순도. 260 / 280 비율이 2.0 ± 0.1 인 경우 RNA 샘플은 순수하다. </li></ol> 4. 노던 블롯 분석 참고 : mRNA 수준을 정량화 및 성적 증명서의 크기에 대한 정보를 얻기 위해 북부도 말을 사용합니다. 또한, 같은 mRNA를 여러 이성체의 mRNA를 생산을 검출하는 노던 블롯을 사용한다. <ol><li> 1.0 % 아가로 오스 - 포름 알데히드 젤을 준비합니다. 표준 프로토콜 (12)에 따라 전기 영동으로 아가 로스 포름 알데히드 겔에 샘플 RNA 같은 양을 실행합니다. RNA 샘플과 함께 RNA 사다리를 실행하고 북부 오점에서 감지 된 RNA의 크기를 결정하는 데 사용합니다. 막에 아가로 오스 포름 알데히드 겔에서 분리 된 RNA를 전송하기 전에, 젤에서 RNA 사다리 차선을 절감하고 에티 디움 브로마이드를 사용하여 시각화. 주 : 대안 적으로, 전체 겔 RNA의 전사 전에 티듐 브로마이드로 염색 할 수있다. </li><li>따고 RNA 시료를 겔상의 적절한 간격으로 이주,의 RNase에게 무료 기술을 이용하여 막에 RNA를 옮긴다. 막 12 ~ 13에 RNA를 전송하는 데 사용할 수있는 여러 가지 프로토콜 중 하나를 사용합니다. 막에 RNA를 전송하려면, 겔과 거의 동일한 크기로 잘라 막. 표준 프로토콜 (12)에 따라 RNA를 전송합니다. </li><li> 자외선 제조업체의 지침에 따라 UV 가교 결합제를 사용하여 막에 RNA를 크로스 - 연결합니다. 대안 적으로, 1 시간 동안 80 ° C로 설정된 오븐에 구워 막. 이 특정 프로브에 혼성화 될 때까지 무기한 비닐 봉투에 -20 ° C에서 막을 저장합니다. 주 : 건조 막은 또한 여과지 사이 RT에서 저장 될 수있다. </li></ol> 5. 혼성화 프로브 막에 대한 관심의 RNA에 대한 보완 주 : 멤브레인에 mRNA를 검출하는 방법 중 하나는 P (32) 표지 된 DNA 프로브를 혼성화하는 것이다. 주의 : resea의32 P 작업 rchers는 오염을 방지하기 위해 보호 절차를 사용해야합니다. 방사성 물질의 사용에 대한 제도적 가이드 라인을 따르십시오. <ol><li> 25 라벨에 의해 DNA 프로브를 준비 - DNA의 50 NG는 표준 프로토콜 (12)에 따라 막에 하이브리드합니다. PCR 또는 절단에 의해 플라스미드 DNA 단편을 생성한다. 비법 뉴클레오티드 12 제거한 후 방사성 표지 된 DNA 프로브의 1 μl를 카운트하여 DNA 프로브의 특이 적 활성을 결정한다. </li><li> 42 ° C에서 예열 예비 혼성화 / 하이브리드 버퍼입니다. 막 (12)의 100cm 2 당 예비 혼성화 / 하이브리드 버퍼의 ~ 10ml를 사용합니다. </li><li> 1 혼성화 - 멤브레인 O 혼성화 완충액 1 ㎖ 당 방사성 표지 된 DNA 프로브의 5 × 106 CPM을 / 혼성화 오븐에서 N은 관심 (12)의 mRNA를 검출한다. 하이브리드 동안 하이브리드 오븐 회전 방향에 있는지 확인하는전체 막은 적절한 혼성화를 보장하기 위해, 혼성화 용액에 노출되도록한다. </li><li> 2 × SSPE 50 ㎖, 15 분간 12 배속 SSPE / 2 % SDS 50 ㎖와 65 ℃에서 한 시간 15 분 동안 RT에서 막 두 번 씻는다. 그것을 건조 또는 형광면을 오염시키지 않도록하기 위해 플라스틱 랩 막 감싸. </li><li> 가이거 계수기를 사용하여, 막에 방사능의 강도를 추정한다. 주 :이 추정 멤브레인 시간 적절한 양 형광면에 노출되는 것을 보장한다. 방사능의 낮은 양의 세포막이 더 오래 노출 시간을 사용합니다. </li><li> 북부도 말 들어, RNA 같은 양의 각 지점에로드하는 것을 확인하기 위해 로딩 컨트롤을 사용합니다. 이를 위해 막을 제거하고 프로세스가 검사되는 영향을받지 않는 RNA로 reprobe. XS 박리 액 (0.1 % SDS / 0.01 끓는 200 ㎖을 함유하는 유리 트레이에 배치하여 멤브레인을 벗기고2 분 동안 SC). 제거 솔루션을 붓고 절차를 다섯 번 12를 반복합니다. 참고 :. 로딩 대조군으로 사용 RNA의 예는 SCR1입니다 SCR1 안정적이고 풍부한 RNA 중합 효소 III 성적 증명서입니다 SCR1 RNA 풍부는 RNA 중합 효소 II 억제의 짧은 기간 동안 크게 변경하지 않아야합니다.. </li></ol> 6. 막에 바인딩 된 RNA를 정량화 참고 : 멤브레인 방사능의 양을 정량화 형광면에 막을 노출하기. 적절한 노출 시간 후,은 phosphorimager을 사용하여 형광면을 스캔. <ol><li> 은 phosphorimager의 제조업체가 제공하는 지침을 사용하여 형광체 화면을 검색합니다. </li><li> 각 시점에서 mRNA의 정량화. ImageQuant 소프트웨어 또는 관련 소프트웨어를 사용하여 mRNA 수준을 정량화. 로딩 컨트롤 각 시점에서의 mRNA 정규화. SCR1는로드로 사용 되었다면제어는 SCR1으로 반감기 northerns 정상화. </li><li> mRNA의 반감기는 시각 0에서 mRNA의 존재의 양에 의해 각 시점에서 남아있는 mRNA의 양 (초기 시점)을 나누어 계산한다. semilogarithmic 플롯 (그림 2C)에 대 시간 남은 퍼센트의 mRNA를 그래프입니다. 다음 식에 의해 mRNA의 반감기를 계산한다 : t 1/2 = -0.693 / K (음 0.693) </li><li> k는 추세선의 기울기이고, t 1/2 mRNA의 반감기이다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

mRNA의 합성과 새로운 합성의 부재 하에서 mRNA의 회전율을 모니터링 억제 자주 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 방법이다. S.에서 cerevisiae를는 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제함으로써 mRNA의 붕괴 속도의 측정은 가장 자주 사용되는 방법 중 하나이다. 이 방법은 구체적으로는 RNA 중합 효소 II를 억제한다. 이 기술을 사용하여 mRNA의 붕괴 속도의 결정을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 효모 세포를 수확하기 전에, 그 전사가 39 ° C에서 문화를 유지하여 차단 된 보장; 2) 프로토콜의 RNA 추출 및 RNA 젤 전기 영동 단계 동안의 RNase없는 기술을 보장하기; 정규화 실험 치료가 예상대로 작동하는지로드 된 RNA의 같은 양을 확인하고 3) 제어 RNA를 사용; 4)의 재현성을 위해 3 회 이상 mRNA의 감쇠율 측정을 반복반감기 측정의 정확도 D. rpb1-1<...

전사 및 특정 mRNA를 붕괴는 유전자 발현의 중요한 결정 요인이다. 합성 및 특정의 mRNA의 붕괴 속도는 특정 mRNA를 정상 상태 수준을 결정합니다. 의 mRNA의 정상 상태 수준의 mRNA의 풍요 로움을 지배하고 단백질 합성에 사용할 수 있습니다 얼마나 많은 각각의 mRNA를 결정합니다. mRNA의 반감기의 측정의 mRNA 붕괴 속도를 결정하기 위해 광범위하게 사용된다. mRNA의, mRNA와 환경 조건에 의해 암호화 된 단백질의 기능의 기능에 관련된 다른 속도 특정 mRNA를 붕괴. mRNA의 붕괴 속도를 판단하기 위해 이용 된 기술에 따라서, 감소율 측정은 전역 적 또는 개별 사체에 대해 결정될 수있다. 효모 S.에서 cerevisiae에 가장 일반적으로 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 기술은 RNA 중합 효소 II 화학 transc의 온도 민감성 대립 유전자를 보유하는 효모 균주를 이용하는 것을 포함이러한 thiolutin 1,10- 페난 트롤 린 1-5 riptional 억제제. 이러한 방법은 또한 개개의 mRNA 붕괴 속도 4를 측정하는데 이용 될 수있다. 다른 방법은 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 이용 될 수있다. 이러한 방법은 정상 상태 표시 또는 유일한 선택 조건에서 발현되는 규제 프로모터로부터 발현되는 mRNA의 분자의 활용에 대한 접근 방법을 포함한다. 이러한 기술의 각 특정 장점과 제한 사항이 있습니다. 여기에 기재된 기술은 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 이용한다. 이 방법을 사용하여 S. cerevisiae의 모델로서, 특정 전사 억제 기술 (6)을 사용하는 다른 시스템들에서 이용되어 변형과 수 있지만. RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 mRNA의 반감기 측정은 광범위하게 mRNA의 붕괴 4-5의 두 게놈 전체 및 개별 측정에 사용됩니다. 이 기술과 특이의 사용을 필요RNA 중합 효소 II, rpb1-1 1의 온도에 민감한 대립 유전자를 품고 IC 효모 균주. 이 기술에 대한 이론적 근거는 nonpermissive 온도로 온도에 민감한 효모의 노출이 mRNA의 합성을 억제한다는 것입니다. 전사가 억제 된 후에 계속해서, 기존의 mRNA 붕괴가 상이한 시점에서 모니터링된다. 기존의 mRNA 전사 소멸이 해제 된 후에 서로 다른 시간 지점에서 효모 세포로부터 RNA를 추출하여 모니터링된다. 효모 세포를 수확하는 시점은 파일럿 실험에 의해 미리 결정된 및 성적 및 시스템이 연구되고에 달려있다. 긴 시간 점 이상 거주 증명서에 사용하는 동안 더 빨리 시점은, 단명 한 성적 증명서에 사용됩니다. 그 후, mRNA를 붕괴 중 하나 북부 얼룩 분석, 정량적 PCR 또는 RNAseq 모니터링합니다. 테를 사용하여 mRNA의 반감기의 측정RNA 중합 효소 II의 mperature 민감한 대립 유전자는 장점이있다. 첫째,이 기술은 곧장 앞으로 쉽고입니다. 둘째, 효모 균주는 mRNA의 반감기의 측정은 다른 성장 조건을 결정할 수있다 실험실에서 획득되거나 생성되면; mRNA의 붕괴에 대한 환경 영향의 결정을 가능하게한다. 셋째, mRNA의 붕괴 속도는 전체 게놈 모니터링 할 수있다. 다른 전사 억제 기술의 사용은 또한 장점과 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 유도 성 프로모터의 사용은 조절 된 프로모터의 제어하에 mRNA를 생성하기 위해 서브 클로닝이 필요하다. Thiolutin는 준비되지 않은 때 비싼 사용할 수 있습니다. 또한, 동작 모드의 thiolutin의 완전히 이해되지 않고,이 mRNA를 감쇠 7 억제를 포함하는 다른 세포 과정에 영향을 미치는 것으로보고되었다. 또한, 1,10- 페난 트롤 린은, 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 또한, 모든 기술은 PERT 수 전사를 억제하기 위해 사용세포 기능을 URB 별개의 방식으로 서로 다른 mRNA에 영향을 미칠 수 있습니다. 조사원은 가장 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 자신의 실험 조건에서 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 필요가있다. 자신의 애플리케이션에 가장 적합한 방법을 결정하기 위해, 연구원 조사되는 성적 증명서에 의해 코딩되는 단백질의 성적 증명서 및 함수를 식별 할 필요가있다. 가장 신뢰할 수있는 mRNA의 감쇠율 측정은 여러 기술들을 사용하여 동일한 감쇠율을 표시해서 결정들이다. 어떤 하나의 기술은 항상 가장없고, 가장 적당한 방법은 특정 상황에 따라 달라진다. S.에서 많은 연구 cerevisiae의 다양한 조건과 유전 적 배경에서 mRNA의 붕괴 속도를 측정했다. mRNA의 붕괴 속도가 측정되는 조건은 특정 실험 조사를 받고에 따라 달라집니다. 조건이 존재하는지 여부 다른 셀룰러 환경에서의 mRNA 붕괴 속도를 측정하는 것은 결정우선적으로 특정의 mRNA 붕괴 속도에 영향을 조사 하였다. 의 mRNA의 붕괴 속도는 사용되는 효모에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들면, mRNA의 붕괴 속도는 비 기능성 넌센스 매개 mRNA의 분해 (NMD) 통로와 야생형 효모 세포 및 효모 세포에서 결정될 수있다. 이 mRNA의 분해 경로는 지금까지 조사 된 모든 진핵 생물에서 발견되며, 이는 번역 8 조기 종료의 mRNA의 분해를 트리거한다. NMD는 초기에 조기 종료 코돈 또는 넌센스 코돈과의 mRNA를 분해 경로로 확인되었다,하지만 지금은 천연의 mRNA를 포함하는 비 넌센스의 발현을 조절하는 통로로 인식되고 있습니다. 경로의 대상이되는 mRNA를 빠르게 기능 NMD 경로와 효모 세포에서 분해 및 비 기능 NMD 경로와 효모 세포에서 안정화된다. 따라서,이 경로의 직접적인 대상인의 mRNA의 반감기는 야생형 효모에서 CEL 짧다비 기능 NMD 통로와 효모 세포에 비해 LS.

<table><tbody><tr><td>고속 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22628169</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Genescreen Plus 멤브레인</td><td>PerkinElmer</td><td>50-905-0169</td><td></td></tr><tr><td>혼성화 오븐</td><td>Fisher Scientific</td><td>95-0030-01</td><td></td></tr><tr><td>나노드롭 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>인광 스크린</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td></td></tr><tr><td>태풍 인광분석기</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29004080</td><td></td></tr><tr><td>UV cross-linker</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>80-6222-31</td><td>대안적으로, 멤브레인은 80°도로 설정된 오븐에서 구워질 수 있습니다. 1시간 동안</td></tr><tr><td>NorthernMax 사전 혼성화/혼성화 완충액&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM8677</td><td></td></tr><tr><td>rpb1-1 돌연변이를</td><td></td> 보유한 효모 <td>균주 효모 균주는 실험실에서 얻거나 특정 배경</td><td></td>으로 만들 수 있습니다.</tr></tbody></table>

mrna의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA의 정상 상태 수준은 환경 조건에 따라 달라집니다. mRNA를 정상 상태 축적 레벨의 규정은 단백질의 정확한 양이 특정 셀의 성장 조건에 대해 합성되는 것을 보장한다. mRNA의 붕괴 속도를 측정하기위한 한 가지 방법은 전사를 억제이어서 이미 존재하는 mRNA를 소실을 모니터링. mRNA의 붕괴 속도는 정량화 될 수 있으며, 정확한 반감기는 여러 기술을 이용하여 결정될 수있다. S.에서 cerevisiae의, 반감기가 개발 된 mRNA의 측정 및 RNA 중합 효소 II, rpb1-1의 온도에 민감한 대립 유전자 항구 균주를 사용하여 mRNA의 전사를 억제 포함 프로토콜을 지원합니다. 조절 성 프로모터의 제어하에 mRNA를을 이용하여 반감기는 대안 thiolutin 또는 1,10- 페난 트롤 린, 또는 전사와 전사 억제제를 포함 mRNA의 억제를 측정하기위한 다른 기술,이러한 갈락토스 유도 성 프로모터와 TET 오프 시스템으로. 여기서 우리는 S.의 측정을 설명 RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 cerevisiae의 mRNA의 붕괴 속도. 이 기술은 개인의 mRNA 또는 게놈의 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용될 수있다.

<html> RNA와 노던 블로 팅을 추출하면서 정확하게 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는이 프로토콜의 능력은 기술 된 RNase 자유로운 전사의 억제, 적절한 시점에서 효모 세포 수확, 및 이용에 따라 달라진다. 각각 불안정하고 안정적​​인 것으로 알려진 두 개의 제어의 mRNA에 대한 프로빙 실험을했다 확신을 제공합니다. 예를 들어, 이는 앤 mRNA를 미리 CYH2 모두를 검출 프로브로 프로빙함으로써 달성 될 수의 mRNA.도 2B는 전사 억제 후 상이한 시점에서 야생형과 NMD 돌연변이 효모 균주 CYH2 프리 mRNA를 소실을 보여준다 . CYH2 사전의 mRNA는 작동하지 NMD 통로 (upf1)와 효모 세포에 기능 NMD 통로 (UPF1) 상대적으로 빠른 효모 세포에서 분해된다. 40fig1h...

특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 효모 Saccharomyces visi에서 mRNA 붕괴 속도를 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 효모 세포를 성장시켜 허용 온도에서 위상을 로그함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포는 총 mRNA 합성이 억제되는 더 높은 온도로 이동합니다.그런 다음 효모 샘플은 각 샘플에 대해 미리 결정된 시점에서 수확됩니다. 총 RNA는 겔 전기영동에 의해 분리되어 추출되어 멤브레인으로 옮겨집니다. 마지막으로, 북부 혼성화(northern hybridization)는 시간의 함수로서 mRNA 수준의 변화를 확인하기 위해 수행됩니다.궁극적으로 이 프로토콜은 다양한 성장 조건에서 개별 mRNA 또는 게놈 전체의 mRNA 붕괴 속도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 DO RNA 붕괴 속도가 다양한 세포 조건 및 유전적 배경에 따라 달라지는 것과 같은 RNA 붕괴 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Megan Pelli입니다.먼저, 고려 중인 균주에 대해 단일 효모 콜로니를 5ml의 적절한 선택적 배지에 접종하여 스타터 배양을 준비합니다. 균주가 RNA 중합효소 2의 온도에 민감한 대립유전자를 가지고 있는 경우, 섭씨 28도의 허용 온도에서 밤새 세포를 포화 상태로 성장시킵니다. 다음 날, 각각 총 부피가 100-150 밀리리터인 일련의 더 큰 야간 배양을 설정하고 다양한 양의 스타터 배양을 성장 배지에 접종합니다.최적의 희석 계수 범위는 변형률 배가 시간과 총 성장 시간을 모두 알고 있는 경우 추론할 수 있습니다. 3일째 되는 날과 세포 수확 전에 섭씨 28도에서 밤새 새로운 배양물을 성장시킵니다. 15ml의 신선한 매체가 들어 있는 두 개의 튜브를 각각 섭씨 28도와 60도에서 예열합니다.또한 예정된 수확 시간에 전용 수조를 섭씨 39도로 예열하십시오. 모든 배양물의 OD 600을 측정합니다. 로그 상 성장의 세포가 포함된 플라스크를 선택하고 전체 내용물을 여러 개의 멸균 50ml 튜브로 옮깁니다.방, 온도, 원심분리기 및 디캔트에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 세포를 모으는 상등액. 먼저 섭씨 28도의 예열된 매체 15ml를 세포 펠릿이 들어 있는 튜브에 추가합니다.Resus 후 펠릿을 현탁시키면 전체 내용물이 다음 튜브로 전달됩니다. 모든 세포가 단일 50ml로 모일 때까지 연속 재생 현탁액 과정을 반복합니다. 원

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

변동 테스트를 통해 측정 된 사카로 미세스 세 레비 시아 젊은 세포에서 돌연변이 비율이 상이한 연령의 증식 및 모 세포의 돌연변이 빈도를 예측하는데 사용된다. 자기 정렬 및 유동 세포 계측법은 다음 예측 돌연변이 주파수에서 모든 편차를 식별하기 위해 실제 돌연변이 주파수와 어머니 세포의 나이를 측정하는 데 사용됩니다.

어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다 사카로 미세스 세 레비 시아

여기에서는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 단백질 분해의 상대적 속도를 정량화하기 위한 강력한 생물학적 분석법을 설명합니다. 분석 판독은 액체 배양에서의 효모 성장 속도이며, 이는 필수 대사 마커에 융합된 분해 신호로 구성된 리포터 단백질의 세포 수준에 따라 달라집니다.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

이 기사는 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 결정하기 위한 효모 성장 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한 효모 단백질을 신속하게 추출하는 방법을 보여주며, 이는 분해 요구 사항을 생화학적으로 확인하기 위한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 적합합니다. 이러한 기술은 다양한 단백질의 분해를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

여기, 우리를 mRNA 수준 S. cerevisiae 세포의 hypoxic 응답 시간 모니터링 RNA-seq를 사용 하 여 프로토콜을 제시. 이 메서드는 어떤 세포 응답 중 유전자 발현 분석을 적용할 수 있습니다.

효 모 S. cerevisiae Hypoxic 응답 하는 동안 시간이 지남에 mRNA 수준 측정

우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Ribonucleotides는 가장 풍부한 비정규 뉴클레오티드 핵 핵 DNA 복제 중 게놈으로 통합 중 이다. 제대로 제거, DNA 손상과 mutagenesis ribonucleotides 발생할 수 있습니다. 여기, 우리가 DNA와 그 변이 원 성 영향으로 ribonucleotide 설립의 풍부를 평가 하는 데 사용 되는 두 가지 실험 방법을 제시.

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

여기서, 우리는 선충 표백 후 선충근 및 형광 회복을 활용하여 생체 내에서 드 노보 단백질 합성을 평가하는 비방사성 및 비침습적 방법을 소개하고 설명합니다(FRAP). 이 방법은 단백질 합성의 새로운 변조기를 확인하기 위하여 유전 및/또는 약리학 스크린과 결합될 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

이 프로토콜은 악티노마이신 D 처리, RT-qPCR, 비선형 회귀분석을 사용하여 마우스 배아 줄기세포 내 유전자 간 및 유전자 내 강화자 RNA의 안정성과 반감기를 정량적으로 측정합니다. 위치별 정규화 전략이 eRNA 붕괴 역학을 맥락 의존적으로 정확하게 모델링하기 위해 도입됩니다.

마우스 배아 줄기세포에서 증강제 RNA 안정성의 최적화된 정량적 평가

배우세요 Saccharomyces cerevisiae에서 mRNA 붕괴 속도를 측정하는 방법을. 온도 변화로 mRNA 합성을 억제하고 Northern hybridization으로 분석하여 유전자 발현 조절 메커니즘을 이해합니다.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에

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