살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

이 절차의 전반적인 목표는 DI 하이드로 엽산 환원효소 단백질 단편 보완 분석 또는 D-H-F-R-P-C-A를 사용하여 관심 단백질의 단백질 상호 작용 파트너를 식별하는 것입니다. 이것은 먼저 고밀도 콜로니 어레이에 대한 DH FFR F 3 컬렉션 또는 칭찬을 압축하여 수행됩니다. 다음으로, 미끼 균주는 풍부한 매체에 대한 칭찬의 배열로 만들어집니다.

마지막 단계에서는 이러한 짝짓기로 인한 이배체를 선택합니다. 궁극적으로, DHFR의 재구성은 선택적 PCA 배지에서 콜로니 크기를 측정하여 정량화되며, 이는 세포에서 재구성된 미끼 피식자 복합체의 양에 비례하는 신호를 제공합니다. 이 기술의 의미는 단백질 상호 작용 네트워크의 재배선에 의해 암과 같은 질병 치료로 확장됩니다.

돌연변이가 그러한 질병으로 이어질 수 있다는 것입니다. 시술 당일 아침에 먼저 PIN 도구를 수조 스테이션에 10초 동안 5회 담가 로봇 플랫폼을 살균하여 잔류 세포 덩어리를 제거합니다. 그런 다음 PIN 도구를 브러시 스테이션에 앞뒤로 두 번, 케이터링 스테이션에 두 번 20초 동안 담그고 PIN 도구를 청소하는 동안 나머지 셀을 제거하기 위해 각각 담그십시오.

UV 램프를 5분 동안 켜서 로봇을 살균합니다. 인클로저 그런 다음 마지막 세척 후 에어 드라이어 스테이션에서 PIN 도구를 25초 동안 건조시킵니다. 여기에서 A-D-H-F-R 컬렉션을 384개 균주로 구성된 16개 어레이로 압축합니다.

384 어레이는 4개의 동일한 관심 간격의 사분면으로 세분화될 수 있으며, 각 사분면은 총 4개의 사분면에 대해 2 x 2 매트릭스 레이아웃의 96개 위치로 구성됩니다. 각 384 어레이에 대해 이 작업을 수행하려면 YPD와 밀리리터당 250마이크로그램을 포함하는 옴니 트레이의 4개 사분면에 4개의 글리세롤 플레이트를 인쇄합니다. Hygromycin B는 이를 위해 96핀 도구를 사용하여 DHFR 3 컬렉션의 60개의 글리세롤 플레이트 사이에 LDH FFR F 3 음성 대조군을 포함하는 4개의 96 웰 플레이트를 삽입하여 4개의 1, 536 어레이를 정확히 채우는 64개의 플레이트의 최종 세트를 갖습니다.

그런 다음 60개의 다른 플레이트 사이에 LDH FFR F 3개의 음성 대조군을 포함하는 4개의 96웰 플레이트를 삽입하여 4, 15, 36개의 어레이를 정확히 채우는 64개의 플레이트로 구성된 최종 세트를 만든 후 소스 플레이트에 세포를 추가한 후 멸균된 핀을 습식 스테이션의 옴니 트레이에 35ml의 멸균수에 적십니다. 배열을 섭씨 37도에서 이틀 동안 배양한 다음 컬렉션을 1,536 균주로 구성된 4개의 배열로 압축합니다. 4개의 대상 플레이트 각각에 384개 균주로 구성된 4개의 어레이를 인쇄합니다.

384 핀 도구 사용. 각 복제 주기 사이에 PIN 도구를 살균하는 것은 또 다른 2일의 배양 후에 시연되었습니다. 1, 536핀 도구로 선택한 YPD 배지에 4개의 어레이를 복제하여 콜로니 크기를 표준화하고 플레이트를 48시간 더 배양합니다.

높은 처리량을 위해. D-H-F-R-P-C-A는 먼저 50ml 튜브에 20ml의 액체 YPD와 CIO ricin에 미끼 균주를 접종하고 250RPM에서 진탕하면서 섭씨 30도에서 2일 동안 세포를 배양합니다. 문화가 포화 상태에 이르렀을 때.

세포 현탁액 5 밀리리터를 YPD 플러스 모기 옴니 트레이에 플레이트하고 5-10 분 후에 세포가 표면에 흡수되도록하고 여분의 액체를 제거하고 2 일 후에 섭씨 30도에서 배양합니다. 1, 536핀 도구를 사용하여 각 셀 잔디를 사용하여 12개의 YPD 플레이트에 미끼 변형을 4번 이상 인쇄하지 마십시오. 그런 다음 1, 536 핀 도구를 사용하여 미끼 셀 위에 DHFR F 3 컬렉션에 적합한 어레이를 다시 인쇄합니다.

또 다른 2일간의 배양 동안 균주가 짝짓기를 하도록 한 다음 YPD와 하이드로 마이신 B 및 노르틴이 포함된 옴니 트레이에 콜로니를 인쇄하여 이배체 세포를 선택합니다. 섭씨 30도에서 이틀 더 이배체를 배양한 다음 배양 하루 만에 보여준 대로 선택을 반복합니다. 다음날 메토트렉세이트가 함유된 배지를 플레이트에 붓습니다.

1, 536 핀 도구를 사용하여 이배체 세포를 메토트렉세이트 배지에 인쇄하고 배양액이 건조되지 않도록 비닐 봉지에 플레이트를 4일 더 배양합니다. 잠복기 3일째. 다음 날 시연된 바와 같이 MTX 배지가 포함된 두 번째 옴니 트레이 배치를 붓고, 로봇 조명을 켜고, 로봇 플랫폼을 사용하여 플레이트를 이미지화하여 PCA 균주의 배경 성장을 줄이고 정량적 분해능을 높이고, MTX 배지의 두 번째 배치에 세포를 복제하여 방금 시연한 대로 MTX 선택의 두 번째 라운드를 수행합니다.

마지막으로, 두 번째 플레이트 세트에서 이미지를 획득한 후 적절한 소프트웨어로 콜로니 어레이를 분석하여 각 어레이의 각 위치에 대한 콜로니 크기 정보를 수집합니다. LDH FFR F 3 대조군으로 정의된 임계값은 높은 신뢰도의 적중을 결정하기 위한 경험적 임계값으로 사용될 수 있습니다. 그런 다음 미끼의 알려진 물리적 인터랙터를 Biogrid와 같은 데이터베이스에서 검색하여 데이터에 오버레이할 수 있습니다.

예를 들어, 여기서, 8개의 높은 신뢰도 히트 중 5개는 이전에 NUP 82 인터랙터로 보고되었으며, 그 중 NUP 1 16 및 NUP 1 59는 NUP 82 하위 복합체의 일부로 결정되었습니다. 또한, 상기 데이터는 PEX 30 근사막 단백질이 낮은 처리량에서 D-H-F-R-P-C-A를 사용하여 확인된 바와 같이 Nup 82의 새로운 물리적 상호작용을 나타낼 수 있음을 나타내며, 검출된 다른 상호작용 파트너 중 2개는 검출된다. New one 20 및 New 85는 새로운 82 하위 복합체의 일부가 아닌 것으로 결정되었으며, 이는 D-H-F-R-P-C-A가 더 큰 복합체의 하위 복합체 내부 및 하위 단지 간의 상호 작용을 감지할 수 있는 능력을 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안 인쇄 단계에서 문제를 해결하지 않도록 Freshly Report 미디어를 사용하는 것을 기억하고 필요한 제어 기능을 포함하여 최종 PCA 미디어가 DHFR 보완을 보여주는 세포만 성장할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.