미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

다음 실험의 전반적인 목표는 면역조직화학법을 사용하여 관심 단백질을 시각화하는 것입니다. 본 예시에서는 미세아교세포를 위한 IBA1과 신경세포를 위한 pan neuronal 항체를 사용합니다. 이는 먼저 준비된 절편을 블로킹 용액에 넣어 비특이적 결합을 방지함으로써 이루어집니다.

두 번째 단계로, 관심 있는 두 가지 서로 다른 단백질을 인식하는 항체를 절편 위에 올리고 하룻밤 동안 방치합니다. 다음으로, 절편을 세척하고 2차 항체에서 배양하여 1차 항체에 형광 태그를 부착합니다. 이중 표지 결과는 뉴런 영역 내의 미세아교세포 염색 부위를 나타낼 수 있습니다.

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 조정해야 할 변수가 매우 많기 때문에 처음에는 어려움을 겪습니다. 오늘 이 기술을 시연할 사람은 저희 실험실의 학부생인 Hazel May입니다. 우선 동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 설치류 뇌를 조심스럽게 고정 및 절편화한 다음, 필요할 때까지 -80 °C에서 주의 깊게 보관하십시오.

프로토콜을 계속 진행할 준비가 되면, 프리저에서 슬라이드를 꺼내 실온에서 해동하십시오. 해동이 완료되면 슬라이드를 랙에 넣고 PBS로 5분씩 3회 세척하십시오. 이 시점부터 절편이 마르지 않도록 주의하십시오.

슬라이드의 가장자리를 건조시킨 후, 액체가 고르게 도포되도록 하고 가장자리 효과를 줄이기 위해 펜 펜(pap pen)으로 슬라이드 가장자리를 따라 액체 방지 경계선을 그립니다. 다음으로, 각 슬라이드에 PBS에 희석한 혈청 300 µL를 첨가하여 절편을 블로킹합니다. 이때 사용하는 혈청은 2차 항체를 생성한 종의 혈청이어야 합니다.

본 사례에서는 당나귀 혈청을 사용하였습니다. 블로킹 용액이 슬라이드의 가장자리까지 닿아 조직을 완전히 덮도록 하십시오. 염색이 불균일하게 되는 것을 방지하기 위해, 슬라이드를 습윤 챔버에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하십시오.

배양하는 동안, IBA1 항체는 1:5,000, 범뉴런(pan neuronal) 항체는 1:500 비율로 1% donkey serum이 포함된 PBS 혼합액에 희석하여 1차 항체를 준비합니다. 블로킹 용액을 제거하고, 관심 항체 두 종류가 모두 포함된 항체 용액 300 µL를 첨가합니다. 또한, 세 개의 대조군 슬라이드를 준비합니다.

슬라이드 하나에 IVA 단독 희석액 300 µL를, 두 번째 슬라이드에 범뉴런성 항체(pan neuronal antibody) 단독 희석액 300 µL를, 그리고 세 번째 슬라이드에 PBS에 희석한 1% donkey serum 300 µL를 각각 첨가합니다. 모든 슬라이드를 습윤 챔버에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 아침에 PBS로 5분씩 세 번 세척합니다.

두 종류의 형광 2차 항체를 PBS 내 1% Donkey serum으로 1:250 비율로 희석하여 형광 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 각 슬라이드에 혼합물 300 µL를 가하고, 슬라이드를 차광 습도 챔버에 넣어 실온에서 60분 동안 배양합니다. 그 후, PBS로 5분씩 세 차례 세척하고, 마지막으로 2차 증류수로 헹굽니다.

세척하는 동안 슬라이드가 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. PBS 상태에서, 형광 신호 강도를 보존하는 데 도움이 되는 수성 마운팅 매질을 각 슬라이드에 몇 방울씩 추가합니다. 그 다음 커버 슬립을 덮고 면봉을 사용하여 남아 있는 기포를 제거함으로써 마운팅 매질을 슬라이드에 밀봉하고 절편이 건조되는 것을 방지합니다.

가장자리를 매니큐어로 코팅합니다. 슬라이드는 빛이 차단된 상자 안에서 평평하게 한 시간 동안 건조시킨 후, 알루미늄 호일로 감싼 차광 용기에 넣어 4 °C에서 보관합니다. 매니큐어가 마르면 슬라이드를 현미경실로 옮겨 이미징을 수행합니다.

천장 조명을 끄고 외부의 다른 모든 광원을 차단하여 실내 환경을 준비합니다. 현미경, 형광 광원 및 이미징 컴퓨터의 전원을 켭니다. 그 다음, 현미경 스테이지 위에 슬라이드를 놓고 초점을 맞춥니다.

함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 각 파장의 노출 시간을 개별적으로 설정하십시오. 시료의 광퇴색(photobleaching)을 방지하기 위해 슬라이드를 장시간 빛에 과도하게 노출하는 것을 피하십시오. 그런 다음, 절편을 이동하거나 초점을 조정하지 않은 상태에서 각 채널의 이미지를 획득하십시오.

이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 병합하고 나중에 이미지 분석을 할 수 있도록 저장합니다. 앞서 설명한 염색 프로토콜을 사용하면 여기에서 보여주는 것과 같은 형광 이미지를 쉽게 얻을 수 있는데, red channel에서는 IBA1 양성 미세아교세포가 명확하게 나타나며, green channel에서는 pan neuronal 양성 뉴런이 배경보다 두드러지게 나타납니다. 이 두 항체 염색에 대한 대조군 이미지들이 나타납니다.

IBA one과 범뉴런 마커를 이용한 암시야 이중 염색 결과는 피질 층 전체에 걸쳐 길고 미세한 뉴런 돌기가 뚜렷하게 관찰되는 주로 분지형 미세아교세포를 보여줍니다. 여기에 표시된 것과 같은 염색 결과는 조직의 품질이 낮을 때도 나타날 수 있습니다. 조직 품질이 낮음을 보여주는 징후로는 명확하게 정의된 세포체의 부재와 파편화된 미세아교세포 및 뉴런 돌기 등이 있습니다.

미세아교세포 염색의 선명도가 떨어지고 신경세포 염색이 완전히 이루어지지 않아, 이 기술을 시도할 때 중첩 이미지가 의미가 없게 됩니다. 절편을 고르게 덮는 것이 중요하며, 단계 사이에 절편이 마르지 않도록 주의해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면 기초적인 면역조직화학 기술에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.