미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

다음 실험의 전반적인 목표는 관심 단백질을 시각화하기 위해 면역조직화학을 사용하는 것입니다. 이 예에서는 미세아교세포에 대한 IBA 1과 뉴런에 대한 범 뉴런입니다. 이는 먼저 준비된 섹션을 차단 솔루션에 배치하여 비특이적 바인딩을 방지함으로써 달성됩니다.

두 번째 단계로, 관심 있는 두 개의 서로 다른 단백질을 인식하는 항체를 하룻밤 사이에 절편에 배치합니다. 다음 절편은 1차 항체에 형광 태그를 추가하기 위해 2차 항체에서 세척 및 배양합니다. 이중 라벨링 결과는 뉴런 영역 내의 미세아교세포 염색을 지적할 수 있습니다.

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 조정해야 할 변수가 너무 많기 때문에 처음에는 어려움을 겪을 것입니다. 오늘 이 기술을 시연하는 사람은 우리 연구실의 학부생인 Hazel May가 될 것입니다. 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 설치류 뇌를 조심스럽게 고정하고 절단한 다음 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 조심스럽게 보관하십시오.

프로토콜을 계속할 준비가 되면 냉동실에서 슬라이드를 꺼내 실온에서 해동합니다. 해동되면 슬라이드를 랙에 놓고 PBS에서 각각 5분씩 세 번 세척합니다. 이 시점부터 섹션이 마르지 않도록 하십시오.

슬라이드의 가장자리를 말리고 팝 펜으로 슬라이드 가장자리 주위에 액체 방수 테두리를 만들어 액체를 균일하게 덮고 가장자리 효과를 줄입니다. 다음으로, PBS에 300마이크로리터의 혈청을 각 슬라이드에 추가하여 섹션을 차단합니다. 혈청은 2차 항체가 자라는 종에서 유래해야 합니다.

이 경우 당나귀 세럼이 사용되었습니다. 차단 용액이 슬라이드 가장자리까지 확장되고 조직을 완전히 덮는지 확인합니다. 고르지 않은 얼룩을 방지하려면 슬라이드를 습도 챔버에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 도중, 1 차적인 항체는 IBA 1 항체 1 대 5, 000 및 팬 뉴런 항체 1 대 500을 1% 당나귀 혈청의 혼합물로 희석할 준비를 합니다. PBS에서 차단 용액을 제거하고 두 관심 항체를 모두 포함하는 항체 용액 300마이크로리터를 추가합니다. 또한 3개의 제어 슬라이드를 준비합니다.

300마이크로리터의 IVA를 1개의 슬라이드에 1회 희석하고, 300마이크로리터의 범뉴런 항체 희석만을 2번째 슬라이드에 추가하고, PBS에 300마이크로리터의 1% 당나귀 혈청을 추가합니다. 세 번째 슬라이드에서 모든 슬라이드를 습도 챔버에 넣고 다음 날 아침 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. PBS에서 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척합니다.

PBS의 1% 당나귀 혈청에 둘 다 1에서 250으로 희석하여 형광 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 각 슬라이드에 혼합물 300마이크로리터를 추가하고 슬라이드를 실온에서 60분 동안 가볍고 밀폐된 습도 챔버에 넣습니다. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 각각 5분씩 세 번 세척하고 마지막으로 이중 증류수로 헹굽니다.

세탁하는 동안 슬라이드를 빛으로부터 보호하십시오. PBS에서 각 슬라이드에 형광 신호 강도를 유지하는 데 도움이 되는 수성 장착 매체를 몇 방울 추가합니다. 그런 다음 덮개를 덮고 슬라이드를 미끄러뜨린 다음 면 팁 애플리케이터를 사용하여 남아 있는 기포를 제거하여 장착 매체를 슬라이드에 밀봉하고 섹션이 건조되는 것을 방지합니다.

가장자리에 매니큐어를 바르십시오. 슬라이드는 섭씨 4도의 호일로 싸인 가벼운 밀폐 용기에 보관하기 전에 빛으로 보호된 상자에서 1시간 동안 평평하게 건조되도록 남겨둡니다. 매니큐어가 마르면 이미징을 위해 슬라이드를 현미경실로 가져옵니다.

머리 위 조명을 끄고 다른 외부 광원을 차단하여 방을 준비합니다. 현미경, 형광등 및 이미징 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 현미경 스테이지에 슬라이드를 놓고 초점을 맞춥니다.

함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 각 파장에 대한 노출을 개별적으로 설정하십시오. 샘플의 광표백을 방지하기 위해 슬라이를 장시간 빛에 과도하게 노출시키지 마십시오. 그런 다음 섹션을 이동하거나 초점을 조정하지 않고 각 채널에서 이미지를 획득합니다.

이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 결합하고 나중에 이미지 분석을 위해 저장합니다. 방금 설명한 염색 프로토콜을 사용하면 여기에 표시된 것과 같은 형광 이미지를 빨간색 채널 IBA에서 양성 미세아교세포가 명확하게 나타나고 녹색 채널에서 팬 뉴런 양성 뉴런이 배경 위로 두드러집니다. 이 두 항체 염색에 대한 대조 이미지가 나타납니다.

여기에 표시된 IBA 1 및 범 뉴런 마커를 사용한 Dark Double 라벨링은 피질층에 걸쳐 분명한 길고 미세한 뉴런 돌기를 가진 대부분 파열화된 미세아교세포를 보여줍니다. 여기에 표시된 것과 같은 염색 결과는 조직의 품질이 좋지 않은 경우에도 가능합니다. 조직의 질이 좋지 않은 것은 명확하게 정의된 세포체의 부족과 단편화된 미세아교세포 및 신경 돌기에 의해 입증됩니다.

미세아교세포 염색의 선명도가 부족하고 신경 염색이 완전히 부족하여 이 기술을 시도하는 동안 오버레이된 이미지가 의미가 없습니다. 섹션을 고르게 덮는 것이 중요하며 단계 사이에 건조되지 않도록 해야 합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 입문용 면역조직화학 기법을 잘 이해하게 될 것입니다.