Name: 미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 학습하세요 저온 절단된 쥐 뇌 조직에서 면역조직화학법을 이용해 미세아교세포와 신경세포를 이중 염색하는 방법을. 이 프로토콜은 신경과학 연구에서 세포 상호작용을 시각화하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 이 커뮤니케이션에 대한 귀중한 피드백을 준 Mr. Ryan Hart와 Mr. Arriz Lucas에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 작업은 NIH NINDS R01 NS065052 및 Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds의 지원을 받았습니다.

참고 : 모든 절차가 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)을 준수하여 수행 하였다. 추천 재료 및 장비의 목록은 표 1에서 찾을 수있다. 1. 조직 준비 <ol><li> 관류 <ol><li> 소듐 펜 토바 비탈 (25 ㎎ / ㎏, IP)의 과다와 설치류를 안락사, 8 ml / 분의 유속으로 완전히하여 죽인 (3-5 분)까지의 인산 완충 식염수 (PBS)을 관류로 transcardially. 깊이있는 관류 지침, 게이지 등 2012 9를 참조하십시오. </li><li> 즉시 / 분 8 ㎖의 유속에서 15 ~ 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 관류하여 조직을 고정, PBS 플러시 다음. </li><li> 4 ℃에서 (트리스 완충 식염수를 제조 순서로, 15 %, 30 %, 30 %) 등급 자당 솔루션 다음 24 시간에 대해 4 % 파라 포름 알데히드의 두뇌와 장소를 제거합니다. 이후 자당 솔루션 O에 뇌 이동할수 있답니다 뇌 후 각 솔루션에 침몰했다. 참고 : 일반적으로, 각 솔루션에 오일이 조직이 싱크에 충분한 시간이다. </li></ol></li><li> 조직의 냉동 및 냉동 절편 <ol><li> 등의 OCT 화합물로서 매체에 매립 뇌를 놓고 -35 ℃에서 펜탄으로 잠수함. 뇌가 10 분의 최소 동결 한 후 -80 ℃에서 저장할 수 있습니다. 온도 실사 촬영되지 않은 경우 문제가 발생할 수 있습니다; 문제 해결 정보에 대한 설명을 참조하시기 바랍니다. </li><li> 20 ㎛의 두께 및 -20 ° C의 온도에서 직렬 관상 단면을 잘라. 양으로 대전 된 슬라이드에 조직을 수집합니다. 뇌 부분은 -80 ° C에서 지퍼 가기 가방과 저장 장기적으로 호일에 싸여 슬라이드 상자에 배치 될 수있다. 저장이 방법은 공기, 서리에 노출되는 것을 방지하기위한 이중 경계를 생성한다. </li></ol></li></ol> 2. 조직 처리 참고 : 예 장비 및 재료 연구염색에 대한 equired은 그림 3과 같다. 대안을 사용할 수 있습니다, 그러나, 이러한 이미지는 면역 조직 화학 염색에 새로운 그 전에 구입에 적절한 항목을 시각화하는 데 도움이됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> 도 3 : 실시 예 항목이 면역 조직 화학 염색을 위해 요구 (A)에 도시 한 블랙 박스 면역 이상적인 습도 챔버 인, 슬라이드 호에 박스 포장을 필요로하지 않고 광으로부터 보호되어있다.. 단면 처리 후, 슬라이드 등의 (B)에 도시 한 바와 같이 상자 노란 박스에 저장 될 수있다. 호일로 단단히 상자를 포장 전에 냉장고에 지퍼 가기 가방에 배치하는 것은 냉동 화상에서 조직 샘플을 보호하는 데 도움이됩니다. 슬라이드의 예는 E (다른 염색 (D)에 도시 된 요리와 (C)에서 주어진다 </strong&gt;). 커버 슬립 그러나 1.2 두께 된 커버는 대부분의 수직 및 공 초점 현미경에 좋은 이미징 결과를 제공, 크기와 두께 (F)에 따라 다를 수 있습니다. 이러한 (G)에 나타낸 것과 연필 슬라이드 라벨을 사용할 수있다. 잉크가 실행할 수있는 영구 마커 염색 표본이 무엇인지를 결정하는 기능 모두에 영향을 피해야한다. 즉, (H)에 도시 된 바와 같이 미니 PAP 펜 구충제 테두리 슬라이드에 그려 질 수 있습니다. <ol><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 실온에서 냉동과 해동에서 슬라이드를 제거합니다. <ol><li> 옵션 : 섹션이 이전 슬라이드에서 부유 한 경우, 슬라이드를 떠에서 조직 섹션을 방지하기 위해 더 이상 4보다 시간 동안 60 ℃의 오븐에서 해동 슬라이드를 배치합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드 랙 및 대응 접시에 놓고 슬라이드. </li><li> 세척은 세척 용액 간의 변화, 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. 앞으로이 단계에서 섹션에 ì을 피하기기능 장시간 액체없이. 주 : 섹션 건조하면 배경 염색이 증가하고 의미있는 데이터를 확실하게 얻을 수 없다. </li></ol></li><li> 조직 염색 <ol><li> 빛을 꽉 염색 상자에서, 탈 이온수로 적신 보풀이없는 조직과 &quot;습도 챔버를&quot;만들 수 있습니다. </li><li> 멀리 조직 섹션에서, 슬라이드의 맨 가장자리에 액체 구충제 테두리 만들기 위해 미니 아빠 펜을 사용, 보풀이없는 조직과 슬라이드의 가장자리를 건조. 이 경계선은 액체의 메 니스 커스 그 표면 장력이 염색에 영향을주지 않도록 조직의 가장자리 사이의 충분한 공간을 확보한다. 참고 : 관심의 항체가 전자 항원 검색을 필요로하지 않는 경우 PAP 펜 구충제 테두리 이전에 2.1.3에 적용 할 수 있습니다. PAP 펜 PBS로 세척하기 전에 적용된 경우 액성 테두리의 무결성은이 단계에서 체크한다. 경계에 틈을 채우기 위해 미니 자궁 펜을 사용합니다. </li><li슬라이드 가로 배치로&gt;, 블록 특이 항원은 PBS (블록 솔루션)에 4 % V / V의 혈청 배양에 의해 결합. 피펫 실온에서 1 시간을위한 슬라이드 당 블록 솔루션의 300 μL. 반드시 블록 용액 슬라이드의 가장자리 PAP 펜까지 연장 완전히 조직 근처 표면 장력에 의한 염색 얼룩을 방지하기 위해 조직을 포함합니다. <ol><li> 이차 항체가 만들어지는 동일한 종에서 혈청을 사용합니다. 주 :이 절차에서는, 이차 항체는 당나귀에서 만들어진, 따라서 당나귀 혈청이 사용된다. 두 개 이상의 다른 종으로부터의 이차 항체가 사용되는 경우, 각각의 종으로부터 혈청을 포함한다. </li></ol></li><li> 슬라이드 위에 피펫 차 항체. 참고 :이 염색에 대한 항체 농도가 1에 최적화 된 5,000 및 1 : 각각 Iba1 및 팬 신경 500. 이러한 농도는 배경 염색의 결핍으로 의미있는 염색을 보여주는 것으로 밝혀졌다. <ol><li> 에 블록 솔루션을 희석1 % PBS에서 혈청 및 일차 항체를 추가합니다. 슬라이드 당 1 % 혈청 차 항체 용액 300 ㎕를 피펫. 다시 말하지만, 유체가 PAP 펜의 가장자리에 있는지 확인하십시오. 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> Iba1도 팬의 연결도 항체를 포함하는 하나의, 팬 - 신경 세포의 항체가없는 Iba1 하나, 그리고 Iba1없이 팬의 연결 항체와 한 세 가지 제어 슬라이드를 포함합니다. 그러나 차 항체의 결합을 비 특정 테스트를 일차 항체를 생략 동일한 솔루션 같은 런 이러한 슬라이드 얼룩. </li></ol></li><li> 다음 날 아침, 세척은 세척과 솔루션을 변경, 5 분마다 PBS에 세 번 슬라이드. </li><li> 형광 항체는 앞으로이 단계에서, 검은 색 또는 어두운 곳에서 배양 중 하나입니다 세척 용기가 박 및 하이브리드 상자에 포장되어 보장함으로써 빛의 노출을 최소화 따라서, 빛에 민감하다. 모든 슬라이드에 적절한 보조 항체를 피펫과 부화1의 농도로 실온에서 60 분 : 블록 용액 250 라이트 타이트 &quot;습도 챔버&quot;에 (단계 2.2.3 참조) (단계 2.2.1 참조). <ol><li> 서로 다른 파장의 이차 항체를 사용합니다. 여기서, 일차 항체 토끼 항 Iba1은 해당 이차 항체로서 당나귀 항 - 토끼 (594)를 사용한다. 일차 항체가 마우스 항 - 팬 신경은 해당 이차 항체로서 당나귀 항 마우스 (488)를 사용한다. 또는, 항 - 토끼 488 및 항 - 마우스 (594)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 세척을 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. </li><li> 옵션 : 핵 염색을 수행합니다. <ol><li> 정확히 60 초 동안 두 번 증류수 H 2 0에서 0.03 μg / ml의 농도 훽스트 (또는 다른 핵 얼룩)에 놓습니다. </li><li> 세척을 5 분마다 PBS 세 번 슬라이드. </li></ol></li><li> DDH 2 0 씻으십시오. </li></ol></li><li> Coverslipping <ol><li> 같은 형석 등의 수성 장착 매체 커버 슬립 슬라이드,omount-G 또는 ProlongGold. 면봉을 사용하여 모든 거품을 제거하기 위해주의하십시오. 참고 : 다른 설치 에이전트를 사용할 수 그러나 높은 블리드을 통해 염료 사이는 coverslipping의 일 이내에 일부가 주목되고있다. </li><li> 가장자리를 밀봉 명확한 매니큐어를 사용하여 증발에 의한 건조되는 부분을 방지 할 수있다. 슬라이드는 평평하고 실온에서 유지하면서 매니큐어가 빛을 꽉 용기에 건조 할 수 있도록 허용 한 후 4 ℃에서 호일에 싸여 빛 기밀 용기에 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 스테인드 조직 이미징 <ol><li> 현미경 사용 <ol><li> 매니큐어는 어두운 방에서 개최해야하는, 현미경을 시작하기 전에 한 시간 이상 건조시킵니다. </li><li> 형광 광원과 디지털 카메라의 첨부 파일이있는 공 초점 또는 연구 현미경을 사용하여 현미경을 획득. 수반 소프트웨어를 사용하여 각 파장에 대한 노출 설정 - 405, 488, 및 594 - 별도. 참고 : 깊이있는 영상 지침은 현미경 제조 업체에서 온라인으로 사용할 수 있어야한다. </li><li> 섹션을 이동하거나 초점을 조정하지 않고 각 채널에서 현미경을 획득. 컬러로 이미지를 가지고, 또는 교대로 그레이 스케일과 이후에 색상을 변환 할 수 있습니다. 참고 : 컬러 또는 각 채널에서 그레이 스케일 이미지 후 처리에 대조 할 수 있습니다. </li><li> 섹션의 사진 표백가 발생하므로, 그 조직 섹션은 오랜 기간 동안 주변 광 또는 미세한 빛에 노출되지 않도록. 이를 방지하기 위해, 증가 빛 / 레이저 강도보다는 노출 시간을 증가시킨다. </li><li> 전원이 켜진 후 30 분 이내에 형광 광원의 전원을 끄지 마십시오. 참고 : 빠르게 연속 켜거나 소스를 전환 형광 전구의 수명을 감소시킬 수있다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li>
<li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li>
<li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies%3A+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li>
<li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+hebdomadaires+des+seances+de+l%27Academie+des+sciences.+Serie+D%3A+Sciences+naturelles%22%5BJournal%5D)">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li>
<li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCuello%2C+AC+%22Immunohistochemistry%22">Immunohistochemistry</a>. , Wiley. (1983).</li>
<li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunqueira%2C+LCU+%22Junqueira%27s+basic+histology+%3A+text+and+atlas%22">Junqueira's basic histology : text and atlas</a>. , Thirteenth edition / edn, (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li>
<li>Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).</li>
<li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li>
<li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+sections+of+70-100+mum%3A+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 통신의 전반적인 목표는 독자에게 면역 조직 화학 절차를 소개했다. 이를 위해, Iba1 및 팬 신경 항원에 두 번 라벨의 예는 미세 아교 세포 및 관류 파라 포름 알데히드의 신경 세포를 관찰하기 위해, 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌를 사용 하였다. 이 기술은 무단 목적을 제공하도록 구성 될 수있다. 뇌, 폐, 간, 신장, 소장에 제한 등 아니라 조직 유형의 다양한 상이한 항원 어레이 프로토콜에 약간의 조정으로 면역 가시화 될 수있다. 면역은 여러 마커의 직접 비교를 할 수 있으며 하나의 샘플에서 네 가지 항체까지 포함 할 수 있습니다. 하나의 샘플에 사용 된 항체의 수는 블리드 쓰루, 형광 파장의 중첩에 대해 설명에 의해 제한된다. 그 결과로서 내 염색 조합을 제한 제한된 형광 스펙트럼이 존재화롯불 샘플 (그림 6 참조). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

<html> 면역 관심 항원에 특이 적으로 결합하는 일차 항체를 사용하여 조직 절편에서 항원 (예 : 단백질)를 검출하기위한 공정이다. 그는 항체가 큰 특이성 1 항원을 지역화 할 수 있다고 판단 할 때 면역은 1934 년 JR Marrack에 의해 개척되었다. 1942 년부터, 면역 조직 화학 염색을 시각화하기 위해 형광 항체를 사용하여 연구를 체외에서 첫 번째의 일부는 생체 조직 화학적 연구에서 처음으로 4 발표 된 후 2,3, 출판되었다. 1960 년대, 삼십년 면역 조직 화학 방법의 개시 후, 효소 결합 된 항체는 보조 시약으로 사용되기 시작했다. 이 방법은 동시에 독립적으로 프랑스와 미국 5,6에서 개발되었다. 오늘, 항체의 다양한는 면역 조직 화학 연구 (7)에 대한 무한한 가능성을 제공합니다. &quot;&gt;이 대응의 전반적인 목표는 면역 조직 화학 염색에 대한 간략한 소개를 제공하는 것입니다, 그것은이 기술의 포괄적이고 철저한 검토하기위한 것이 아닙니다 설명 된 방법에있어서,이 항원에 대한 면역 조직 화학 기술은 미세 아교 세포에 대한 (마커를 제공하고 있습니다. 관류 파라 포름 알데히드의 염색 뉴런), 자당 cryoprotected, 저온 절단 된 쥐의 뇌. 면역 조직 화학 염색을 배경 염색을 줄이기 위해 결합 특이 항원을 차단 시작한다. 다음으로, 일차 항체와 배양이 조직의 특정 항원에 결합이 가능합니다. 차 항체에 따라, 다른 항체를 이차 항체로 명명 공액 시각화 신호 8 차 항체를 링크에 적용된다. 이차 항체 차 항체가 발생시킨 종에 특이적인 면역 글로불린 G (IgG의) 도메인을 대상. 이차 항체는 신호를 증폭 차 항체의 T의 팹 지역부터차 항체의 IgG의 도메인에 여러 사이트에 그가 차 항체 바인드. 어느 차 항체의 F C 영역에 결합 효소 또는 형광 분자 시각화를 가능하게한다. 예를 들어, 토끼 항 Iba1 일차 항체에 특이 Iba1 토끼의 IgG 분자이다. 당나귀 항 - 토끼 IgG를 이차 항체가로인가 될 때, 인식하고 토끼 항 Iba1의 IgG의 복수의 영역 (도 1 참조)에 결합된다. 당나귀 항체는 다양한 방법에 의해 시각화 될 수있다. 이 통신은 형광 현미경으로 시각화를위한, 차 항체를 인식하는 이차 항체에 결합 형광 검출에 초점을 맞추고있다. 형광 면역 조직 화학에서, 이러한 훽스트 또는 DAPI와 같은 핵 염색은 모든 핵을 시각화 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> 그림 1 :의 SCH직접 대 간접 항체 라벨링 기술 ematic 표현. 항체는 관심있는 항원에 결합하여 일차 항체 종에 대해 발생하는 이차 항체에 의해 증폭 될 수있다. 이 기술은 시각화 (A)에 대한 증폭 및 DAB 용 아비딘 - 바이오틴 복합체 (ABC)를 사용하여 수행 할 수있다 또는 형광 직접 접합 된 이차 항체 (B). 또한, 일차 항체가 직접 비오틴 또는 형광 (C) 등 다양한 태그와 결합 될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> (DAB;도 1 및도 2 참조) 면역 조직 화학 염색의 시각화를위한 다른 방법은 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride를 이용한다. 이 비오틴 화를 사용하여 형광 또는 상이밝은 필드 현미경 아래에서 볼 수있는 침전물에 DAB를 변환하는 효소를 제공 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP) 복합 이차 항체,. 단일 항원 관심 또는 염색이 오래 지속되는 것이 요구되는 경우에, DAB 형광 염색보다 더 적합 할 수있다. 그러나, DAB 염색은 두 개의 핵 항원이 관심있는 특히, 여러 마커 사이의 차별화에 적합하지 않습니다. DAB 재료 및 프로토콜 변경에 대한 자세한 내용은 표 1를 참조. 대안으로는, 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 / 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 포스페이트 (NBT / BCIP)는 이차 공액 알칼리성 포스파타제 (AP)를 시각화하기 위해 사용될 수있다 항체. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 니켈 강화 DAB 하나의 표지 쥐의 뇌 조직 섹션의 대표 이미지 쥐의 뇌는 SE는혼자 미세 아교 세포 또는 뉴런의 오래 지속되는 분석을 허용 Iba1 (A)와 팬의 연결 (B)을 위해 니켈이 강화 된 DAB로 표시되어 있습니다 ctions. 스케일 바 20 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 하나는 조직 내에서 관심있는 항원의 존재 량 추정 분석되는 것을 고려한다. 간접 방법은 위에서 설명한대로 낮은 풍부한 목표에 유용하다. 관심 항원 높은 풍부하게되면 직접 방법이 적용될 수있다. 직접 방법은 직접 시각화 신호에 결합되는 일차 항체를 포함하고, 따라서 어떤 차 항체가 필요하지 않습니다. 이 방법은 염색 공정을 단순화하지만, 간접적 인 방법에 의해 달성 증폭을 제거한다. 직접 복합 일차 항체를 사용하여 이차 항체의 교차 반응을 제거때 두 번 라벨. 이 통신은 Iba1과 팬의 연결 (표 1의 세부 사항)와 이중 라벨에 대한 프로토콜을 자세히 설명합니다. Iba1는 분지, 하이퍼 분지의 활성화, 아메바, 및로드 등 많은 활성화 상태에서 미세 아교 세포를 얼룩. 팬 신경 얼룩 신경 축삭 돌기, 그리고 소마. Iba1 대부분의 미세 아교 세포와 팬의 연결 대상에게 신경을 얼룩 때문에, 얼룩의 조합은 미세 아교 세포 - 신경 세포 상호 작용의 폭 넓은 이해를 얻는 데 유용합니다. 결론적으로, 면역 조직 화학 염색은 항체의 신중한 선택에 의존한다. 연구 문제는보다 구체적인 해짐에 따라, 다른 항원에 제기 항체는 바람직 할 수있다. 특정 소교 활성화 상태를 대상으로, 하나는 오히려 Iba1보다, CD45 또는 CD68 항체를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 또한, 마우스를 작동에서 F4 / 80은 필요한 결과를 제공 할 수있다. 마찬가지로, 신경 요소는 특히 항체 류마티스 관절염의 대상이 될 수 있습니다핵에 대한에 다루지, 시냅스 (사전 또는 사후), 축삭, 성장 콘. 또한, 신경 세포 (더블 cortin, NeuN)의 나이를 구별 다른 마커 및 신경 재생 (GAP-43)이있다.

<table><tbody><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 유리 슬라이드&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>조직 장착에 사용 (1.2.2)</td></tr><tr><td>오븐</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028112</td><td>조직 건조에 사용 (2.1.1)</td></tr><tr><td>Mini Pap pen</td><td>Life Technologies</td><td>00-8877</td><td>2.2.2 단계에서 사용</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>염색 중 모든 세척에 사용 (2.2) 및 Hoechst 단계 (2.2.8)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>슬라이드 건조에 사용 (2.2)</td></tr><tr><td>블랙 스테인닝 박스</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>차단 및 염색 단계에 사용 (2.2)</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>블록 및 항체 배양에 사용 (2.2)</td></tr><tr><td>마우스 &알파;-Pan-neuronal</td><td>Millipore</td><td>MAB2300</td><td>1차 항체에 사용 (2.2.4)</td></tr><tr><td>Rabbit &alpha;-Iba1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>1차 항체 (2.2.4)</td></tr><tr><td>당나귀 &alpha;-rabbit 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>2차 항체 (2.2.6)</td></tr><tr><td>-mouse 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>2차 항체 (2.2.6)</td></tr><tr><td>케이터링 호일</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>1.2.2 및 2.3.2 단계에서 사용</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>커버 슬립에 사용 (2.2.8)</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>커버 슬립에 사용 (2.2.8)</td></tr><tr><td>클리어 네일 폴리쉬&nbsp;</td><td>모든</td><td>N/A</td><td>커버슬립에 사용 (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 및 LSM 710 (레이저 스캐닝, 공막)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>이미징에 사용 (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>이미징에 사용 (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>DAB 프로토콜</td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>DAB 프로토콜</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>DAB 프로토콜</td></tr><tr><td>Biotinylated horse &alpha;-rabbit IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1100</td><td>DAB 프로토콜</td></tr><tr><td>Biotinylated horse &alpha;-mouse IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>DAB 프로토콜</td></tr><tr><td>30% 과산화수소</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>DAB 프로토콜</td></tr><tr><td>Wheaton 슬라이드 랙 및 염색 접시</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>DAB 프로토콜</td></tr><tr><td>Masterflex 관류 펌프 및 튜빙</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>관류에 사용(1.1.1 및 1.1.2)</td></tr> <tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT 화합물(12의 경우)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>조직 동결에 사용 (1.2.1)</td></tr><tr><td>온도계 (-50 to 50 C)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>조직 동결에 사용 (1.2.1)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM3500S</td><td>조직 절단에 사용 (1.2.2)</td></tr> <tr><td>염색 접시, 2 개의 뚜껑이있는 플라스틱</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>항원 레트리벌</td></tr><tr><td>용 20 자리 염색 랙, 수평 슬라이드</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>항원 레트리벌</td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>모든</td><td>N / A</td><td>항원 레트리벌</td></tr></tbody></table> 용

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

면역 조직 화학은 동일계에서 항원의 존재, 위치 및 상대적인 풍부함을 검출하기위한 널리 이용되는 기술이다. 이 초급 프로토콜 및 미세 아교 예로서 신경 요소의 마커를 사용하여, 시약, 장비 및 설치류 뇌 조직의 면역 조직 화학 염색을 완료하기 위해 필요한 기술들을 설명한다. 특히,이 논문은 각각 Iba1과 팬의 연결에 대한 면역 조직 화학 염색을 통해 미세 아교 세포와 신경 세포의 형광 시각화를위한 단계별 프로토콜입니다. 형광 이중 라벨링 정확하게 세포 유형, 수용체, 리간드 사이의 상호 작용을 관찰 할 수있는 기회를 제공하고, 동일한 샘플 내의 다중 단백질의 위치 파악에 특히 유용하며, 및 / 또는 서로뿐만 아니라 단백질 공동과 관련된 세포 외 기질 하나의 셀 내에서 지역화. 다른 시각화 기술과는 달리, 형광 면역 조직 화학 염색의 강도가 감소 할 수있다적절한 예방 조치가되지 않는 한, 염색 다음 달에 주. 형광은 더 효율적이고, 두 개 이상의 사이보다 정확한 분화 가능으로 이러한 제한에도 불구하고, 많은 어플리케이션에서 형광 이중 표지, 예컨대 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘의 tetrahydrochloride (DAB) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP)와 같은 대안보다 선호 마커. 토론은 문제 해결 팁과 성공을 촉진하기 위해 조언을 포함한다.

이 염색 프로토콜 미세 아교 세포 형광 594 채널 (빨간색)에 표시 한 쥐의 뇌 조직 섹션에서 결과와 488 채널 레이블 뉴런 (녹색, 그림 4 참조). 핵 염색을 완료 한 경우, 채널 405 (블루)에 표시한다. 이미지는 서로 다른 채널에서의 촬영과 세 채널의 직접 비교를 위해 오버레이 또는 두 채널 사이에있을 수있다. 많은 디지털 수집 소프트웨어 스위트는이 기능을 포함한다. 여기에 표시된 Iba1 및 팬 신경 마커를 두 번 라벨은 대뇌 피질의 층에서 분명 긴 미세 신경 돌기 대부분 분지의 미세 아교 세포를 보여줍니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig4highres.jpg" /> 그림 4 :. 이바-1 / 팬 신경 이중 라벨 열 1의 대표 공 초점 형광 이미지...

이 입문 수준 프로토콜은 미세아교세포와 신경 요소에 대한 마커를 예로 들어 설치류 뇌의 면역조직화학적 염색을 완료하는 데 필요한 시약, 장비 및 기술을 설명합니다.

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

다음 실험의 전반적인 목표는 면역조직화학법을 사용하여 관심 단백질을 시각화하는 것입니다. 본 예시에서는 미세아교세포를 위한 IBA1과 신경세포를 위한 pan neuronal 항체를 사용합니다. 이는 먼저 준비된 절편을 블로킹 용액에 넣어 비특이적 결합을 방지함으로써 이루어집니다.두 번째 단계로, 관심 있는 두 가지 서로 다른 단백질을 인식하는 항체를 절편 위에 올리고 하룻밤 동안 방치합니다. 다음으로, 절편을 세척하고 2차 항체에서 배양하여 1차 항체에 형광 태그를 부착합니다. 이중 표지 결과는 뉴런 영역 내의 미세아교세포 염색 부위를 나타낼 수 있습니다.일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 조정해야 할 변수가 매우 많기 때문에 처음에는 어려움을 겪습니다. 오늘 이 기술을 시연할 사람은 저희 실험실의 학부생인 Hazel May입니다. 우선 동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 설치류 뇌를 조심스럽게 고정 및 절편화한 다음, 필요할 때까지 -80 °C에서 주의 깊게 보관하십시오.프로토콜을 계속 진행할 준비가 되면, 프리저에서 슬라이드를 꺼내 실온에서 해동하십시오. 해동이 완료되면 슬라이드를 랙에 넣고 PBS로 5분씩 3회 세척하십시오. 이 시점부터 절편이 마르지 않도록 주의하십시오.슬라이드의 가장자리를 건조시킨 후, 액체가 고르게 도포되도록 하고 가장자리 효과를 줄이기 위해 펜 펜(pap pen)으로 슬라이드 가장자리를 따라 액체 방지 경계선을 그립니다. 다음으로, 각 슬라이드에 PBS에 희석한 혈청 300 µL를 첨가하여 절편을 블로킹합니다. 이때 사용하는 혈청은 2차 항체를 생성한 종의 혈청이어야 합니다.본 사례에서는 당나귀 혈청을 사용하였습니다. 블로킹 용액이 슬라이드의 가장자리까지 닿아 조직을 완전히 덮도록 하십시오. 염색이 불균일하게 되는 것을 방지하기 위해, 슬라이드를 습윤 챔버에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하십시오.배양하는 동안, IBA1 항체는 1:5,000, 범뉴런(pan neuronal) 항체는 1:500 비율로 1% donkey serum이 포함된 PBS 혼합액에 희석하여 1차 항체를 준비합니다. 블로킹 용액을 제거하고, 관심 항체 두 종류가 모두 포함된 항체 용액 300 µL를 첨가합니다. 또한, 세 개의 대조군 슬라이드를 준비합니다.슬라이드 하나에 IVA 단독 희석액 300 µL를, 두 번째 슬라이드에 범뉴런성 항체(pan neuronal antibody) 단독 희석액 300 µL를, 그리고 세 번째 슬라이드에 PBS에 희석한 1% donkey serum 300 µL를 각각 첨가합니다. 모든 슬라이드를 습윤 챔버에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 아침에 PBS로 5분씩 세 번 세척합니다.두 종류의 형광 2차 항체를 PBS 내 1% Donkey serum으로 1:250 비율로 희석하여 형광 2차 항체 혼합물을 준비합니다. 각 슬라이드에 혼합물 300 µL를 가하고, 슬라이드를 차광 습도 챔버에 넣어 실온에서 60분 동안 배양합니다. 그 후, PBS로 5분씩 세 차례 세척하고, 마지막으로 2차 증류수로 헹굽니다.세척하는 동안 슬라이드가 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. PBS 상태에서, 형광 신호 강도를 보존하는 데 도움이 되는 수성 마운팅 매질을 각 슬라이드에 몇 방울씩 추가합니다. 그 다음 커버 슬립을 덮고 면봉을 사용하여 남아 있는 기포를 제거함으로써 마운팅 매질을 슬라이드에 밀봉하고 절편이 건조되는 것을 방지합니다.가장자리를 매니큐어로 코팅합니다. 슬라이드는 빛이 차단된 상자 안에서 평평하게 한 시간 동안 건조시킨 후, 알루미늄 호일로 감싼 차광 용기에 넣어 4 °C에서 보관합니다. 매니큐어가 마르면 슬라이드를 현미경실로 옮겨 이미징을 수행합니다.천장 조명을 끄고 외부의 다른 모든 광원을 차단하여 실내 환경을 준비합니다. 현미경, 형광 광원 및 이미징 컴퓨터의 전원을 켭니다. 그 다음, 현미경 스테이지 위에 슬라이드를 놓고 초점을 맞춥니다.함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 각 파장의 노출 시간을 개별적으로 설정하십시오. 시료의 광퇴색(photobleaching)을 방지하기 위해 슬라이드를 장시간 빛에 과도하게 노출하는 것을 피하십시오. 그런 다음, 절편을 이동하거나 초점을 조정하지 않은 상태에서 각 채널의 이미지를 획득하십시오.이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 병합하고 나중에 이미지 분석을 할 수 있도록 저장합니다. 앞서 설명한 염색 프로토콜을 사용하면 여기에서 보여주는 것과 같은 형광 이미지를 쉽게 얻을 수 있는데, red channel에서는 IBA1 양성 미세아교세포가 명확하게 나타나며, green channel에서는 pan neuronal 양성 뉴런이 배경보다 두드러지게 나타납니다. 이 두 항체 염색에 대한 대조군 이미지들이 나타납니다.IBA one과 범뉴런 마커를 이용한 암시야 이중 염색 결과는 피질 층 전체에 걸쳐 길고 미세한 뉴런 돌기가 뚜렷하게 관찰되는 주로 분지형 미세아교세포를 보여줍니다. 여기에 표시된 것과 같은 염색 결과는 조직의 품질이 낮을 때도 나타날 수 있습니다. 조직 품질이 낮음을 보여주는 징후로는 명확하게 정의된 세포체의 부재와 파편화된 미세아교세포 및 뉴런 돌기 등이 있습니다.미세아교세포 염색의 선명도가 떨어지고 신경세포 염색이 완전히 이루어지지 않아, 이 기술을 시도할 때 중첩 이미지가 의미가 없게 됩니다. 절편을 고르게 덮는 것이 중요하며, 단계 사이에 절편이 마르지 않도록 주의해야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면 기초적인 면역조직화학 기술에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐 해마 절편에서 바이오사이틴으로 채워진 인터뉴런을 시각화하는 과정을 보여주며, 특정 항체 및 형광 현미경을 사용하여 신경화학적 정체성을 강조합니다.

쥐 해마 절편에서 중간뉴런의 면역염색

이 동영상은 1차 및 2차 항체를 사용하여 형광 표지된 성상세포로 고정된 마우스 뇌 조직 절편을 면역 염색하고 컨포칼 현미경을 통해 염색된 성상세포의 이미지를 캡처하는 절차를 보여줍니다.

마우스 뇌 조직 절편에서 형광 표지된 성상세포의 면역염색

출처: Evilsizor, M. N., et. al., 저온 절개 쥐 뇌 조직에 대한 면역 조직 화학을 위한 프라이머: 미세아교세포 및 뉴런에 대한 염색 예. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 미세아교세포와 뉴런의 공간 배열을 시각화하기 위해 동결절제된 쥐 뇌 조직에 대한 단계별 면역조직화학 염색 절차를 보여줍니다.

미세아교세포와 뉴런을 위한 쥐 코로나 조직 동결절편의 면역조직화학적 염색

여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 쥐 중추신경계(CNS) 및 말초 림프절(LN) 조직 절편에서 이중 면역 염색을 위한 최적화되고 상세한 프로토콜을 제시합니다.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

여기, 선물이 동결 하 고 처리 한 두뇌를 절약해 주는 대신 여러 동물에서 뇌 조직 섹션 프로토콜. 이 immunohistochemistry 동안 얼룩 가변성을 감소 시키고 감소 시간 cryosectioning 및 이미징.

여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning

여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

이 프로토콜은 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투뿐만 아니라 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 분석 뿐만 아니라 IBA1 및 TMEM19의 면역 형광 유행성 화에 대한 단계별 워크플로우를 설명합니다.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

여기서 우리는 손상되지 않은 뇌 구조의 일환으로 표적 분자의 보기를 허용하는 소수성 조직 청산 방법을 제시합니다. 이 기술은 지금 F344/N 통제 및 두 남녀의 HIV-1 형질전환 쥐를 위해 검증되었습니다.

쥐 뇌 조직을 위한 소수성 조직 청산 방법

이 프로토콜은 관류, 뇌 단면, 자유 부동 면역 염색, 조직 마운팅 및 이미징을 포함한 마우스 뇌 조직학 연구를위한 효율적이고 재현 가능한 접근 방식을 설명합니다.

마우스 뇌의 자유 부동 면역 염색

쥐 생체 내 모델은 허혈성 뇌졸중의 병리학적 메커니즘과 치료 표적을 조사하는 데 필수적인 도구입니다. 이 연구는 쥐의 중대뇌동맥 폐색(MCAO) 후 경색된 뇌 절편에서 면역형광 염색을 수행하는 방법을 설명합니다.

허혈성 뇌졸중의 쥐 모델에서 면역형광에 의한 세포 사멸 신호 평가

미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS)는 코딩 전문 지식이 필요 없는 사용자 친화적인 분석 파이프라인으로, 면역형광 이미지로부터 단일 세포 미세아교 형태학 분석을 반자동으로 수행합니다. 설치류 지다당류 유도 신경염증 모델에서 검증된 MMPS는 활성화 관련 형태학적 변화를 재현 가능하게 감지하고 표준화되고 확장 가능한 미세아교세포 표현형을 가능하게 합니다.

미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS): 정량적 미세교교세포 형태학 분석을 위한 오픈 소스 사용자 친화적 도구입니다

학습하세요 저온 절단된 쥐 뇌 조직에서 면역조직화학법을 이용해 미세아교세포와 신경세포를 이중 염색하는 방법을. 이 프로토콜은 신경과학 연구에서 세포 상호작용을 시각화하는 데 활용됩니다.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

더 많은 동영상 탐색