שיטה של מבודד
25 בפברואר 2015
Ex-Vivo ריאות זלוף (EVLP) אפשר השתלת ריאות בבני אדם להפוך לזמינה יותר בכך שיאפשר את היכולת להעריך איברים ולהרחיב את המאגר התורם. כאן אנו מתארים את הפיתוח של תכנית EVLP חולדה וחידודים המאפשרים למודל לשחזור להתרחבות עתידית.
המטרה הכללית של נוהל זה היא להקים מודל עקבי של פרפוזיית ריאות של חולדה ex vivo, אשר יניב תוצאות הניתנות לשחזור. השלב הראשון הוא קנוולציה של הקנה ותחילת הרפיה מכנית. לאחר מכן, מבצעים קנוולציה של העורק הריאתי והעליה השמאלית.
השלב האחרון הוא הוצאת בלוק הלב והריאה מחלל החזה והצבתו במעגל הפרפוזיה של הריאה ex vivo. בסופו של דבר, חיישני לחץ, מתמרי משקל ואנלייזר לגזי דם משמשים להצגת מצב הריאה בזמן אמת על ידי מדידת הלחץ בעורק הריאתי ופרמטרים אחרים. פרפוזיה של הריאה ex vivo היא טכנולוגיה יוצאת דופן שאפשרה לנו להרחיב את מאגר התורמים להשתלת ריאה.
אנו צופים כי באמצעות שימוש בטכנולוגיה זו כפלטפורמה להערכת איברים, נוכל לשפר את איכות האיברים המועברים להשתלה ואת תוצאות ההשתלה הכלליות. כאן, במעבדת Copper, טבענו את המונח "חימוש האיבר" (arming the organ), הכולל הערכה, עיצוב מחדש או תיקון, ולאחר מכן שינוי של האיבר כדי לשפר את איכותו ובכך לשפר את תוצאות ההשתלה. פיתחנו מודל חולדה חסון וניתן לשחזור של פרפוזיה של ריאה ex vivo בבעלי חיים קטנים.
בסרטון זה נדגים את השלבים המרכזיים והקריטיים לפיתוח מודל זה של פרפוזיה של ריאות ex vivo, אשר יכול לשמש לאחר מכן כפלטפורמה למחקר בתחומי הפרפוזיה וההשתלה. התחילו בהקמת מעגל ה-EVLP והזרמה של נוזל פרפוזיה חמים במערכת. כוון את אמבט המים החמים, מחליף החום והביתס המלאכותי ל-37 °C.
העבירו גז דה-אוקסיגנציה דרך מסנן הגזים ב-PERFUSE eight כדי להבטיח כי ריכוז החמצן המומס הוא כ-6% עבור הניסוי. לאחר פתיחת תוכנת רכישת הנתונים, חברו את המתמר של לחץ העורק הריאתי, המתמר של לחץ דיפרנציאלי קשיי, המתמר של לחץ דיפרנציאלי של זרימת הנשימה, המתמר של משקל הריאה והמתמר של מהירות המשאבה לקופסת הממיר מאנלוגי לדיגיטלי. לבסוף, הכינו את שולחן הניתוח ואת כל כלי הניתוח והציוד הדרושים להליך.
לאחר אימות הסדציה באמצעות צביטה בבהו, הנח את החיה המורדמת במנח גב (supine) על שולחן הניתוח. התחל בהקלטת נתונים באמצעות תוכנת רכישת הנתונים. כאשר תהיה מוכן, היכנס לחלל הבטן והזרק heparin לווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava).
בהתאם לנהלים הסטנדרטיים, בצעו קנולציה של הקנה וחברו את הקנולה למעגל הנשמה. הפעילו את מכשיר ההנשמה המכנית כדי להתחיל בהנשמה מכנית של הריאות. לאחר מכן, רחקו את דפנות חלל בית החזה כדי לחשוף את הריאות, תוך הקפדה להימנע ממגע עמן.
הסר את הטימוס והסט את תוכן הבטן לצד אחד כדי לחשוף את הווריד הנבוב התחתון או את הווריד המסריקי. לאחר ההמתה, הצב תפר משי מאחורי העורק הריאתי והאאורטה. כהכנה לקיבוע הקנולה בעורק הריאתי, בצע חתך של שני עד שלושה מילימטרים במשטח הקדמי של נתיב היציאה מהחדר הימני והכנס את הקנולה אל העורק הריאתי הראשי.
הדק בעזרת תפר משי, והסר קרישי דם מכלי הדם הריאתיים על ידי הזרמה של כ-15 milliliters של תמיסת אלקטרוליטים חיוביים עם ריכוז נמוך של אשראים דרך העורק הריאתי ומחוץ לקודקודי הלב. לאחר מכן, מקם תפר משי מאחורי הלב ומסביב לחדרים. כדי להרחיב את המסתם המיטרלי ולהקל על הקניולציה, הכנס פינצטה כירורגית קטנה אל הקודקוד דרך המסתם המיטרלי ואל תוך העלייה השמאלית.
כאשר הדבר מוכן, הכניסו קנולה אל apex דרך המסתם המיטרלי ואל תוך העלייה השמאלית. קבעו את קנולת העלייה השמאלית באמצעות תפר משי. לאחר מכן, חברו את קנולת העורק הריאתי למעגל ה-EVLP.
יש לוודא שקו הכניסה המגיע מהמעגל מלא בתמיסת perfuse eight. כדי למנוע חדירת אוויר ללב ולריאות, הפעל את משאבת הפריסטלטיקה הראשית והגדר אותה למהירות נמוכה. פעולה זו תאפשר לתמיסת perfuse eight לזרום דרך העורק הריאתי ומחוץ לחדר השמאלי אל תוך חלל בית החזה.
יש לנטר את הלחץ בעורק הריאתי כדי לוודא שאין עלייה חדה, העלולה להעיד על חסימה או על קנולציה לקויה. כאשר השלב מוכן, כבה את משאבת הפריסטלטיקה. חבר את קנולת העורק הריאתי למעגל הפרפוזיה של הריאה ex vivo.
אין לחבר את קנולת האטריום השמאלי למעגל עד להוצאת בלוק הלב-ריאה מהגוף. הוצא את בלוק הלב-ריאה על ידי סגירת הוושראגית בעזרת המוסטט וחיתוך מתחת לתסמיל, כך שניתן יהיה להשתמש בוושראגית כדי להרים את המבנים הקרדיו-pulmonary באופן קהה, להפריד את הרקמה המקיפה ולחתוך את האורטה היורדת ואת כלי הדם העזר כדי לשחרר את בלוק הלב-ריאה תוך כדי הרמתו באמצעות הוושראגית. בצע חיתוך של הקנה כדי לשחרר את בלוק הלב-ריאה והנח אותו במיקום המיועד במעגל ה-EVLP.
לאחר מכן, חברו את קנולת העלייה השמאלית לקו היציאה והפעילו את משאבת הפריסטלטיקה. כדי להקליט נתוני הנשמה ולנטר לחצים, הסירו במהירות את קו ההנשמה מחלקו העליון של מכשיר ה-EVLP וחברו את המארז עם חיישני הלחץ. לאחר מכן, הכניסו מחדש את קו ההנשמה לחלקו העליון של מכשיר ה-EVLP.
יש לוודא שמלכודת הבועות מלאה מספיק בנוזל הפרפוזיה. כדי למנוע כניסת בועות אוויר לריאות במהלך 15 הדקות הראשונות, שנו באיטיות את הגדרות ההוjolsendev והפרפוזיה לרמות הניסוייות הרצויות. הגבירו גם את קצב זרימת הפרפוזיה ואת הלחץ לקצב וללחץ הרצויים במהלך שלב העלייה ראשוני זה.
מומלץ לתכנת את המנשם כך שיבצע נשימות צדדיות לסירוגין כדי להקל על הוצאת נוזלים מחלל הריאה ולעכב את הופעת בצקת. הגדירו את זמן אפס כזמן שבו פרמטרי ההנשמה נמצאים בנפח שאיפה של 4 mL/kg חיובי. לחץ סוף נשיפה ב-2 cmH₂O.
רמות ה-H2O ופרמטרי הפרפוזיה נמצאות ברמות הצפויות ונשארות קבועות. במידת הצורך, קחו שמונה דגימות מפתח הדגימה, הקפיאו אותן במהירות בחנקן נוזלי, ורשמו את הזמן שבו נלקחו הדגימות. עם סיום הניסוי, בודדו את כל החלקים האנטומיים הדרושים לאיסוף והקפיאו אותם במהירות בחנקן נוזלי או העבירו אותם לתמיסת קיבוע לצורך מחקרים נוספים.
משקל הריאות של חולדות Sprague Dawley זכרים לא השתנה באופן מובהק לאורך 60 דקות של פרפוזיה ריאתית ex vivo לאחר 10 הדקות הראשונות. כמו כן, לא חל שינוי בלחץ העורקים הריאתיים. באופן דומה, ההתנגדות הווסקולרית הריאתית לא השתנתה לאורך משך המחקר.
לאחר שעה אחת של הנשמה בנפח נשיפה גבוה וב-PEEP גבוה, ריכוזי הציטוקינים הפרו-דלקתיים עלו ב-PERFUSE eight, בעוד שריכוזי הציטוקינים האנטי-דלקתיים נותרו ללא שינוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של השלבים המרכזיים הדרושים להקמת מודל פרפוזיה של ריאות ex Viva בחיות מעבדה קטנות (חולדות) במעבדתכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את ביסוסו של מודל פרפוזיה של ריאה ex vivo (EVLP) בחולדה, שמטרתו לשפר את תוצאות השתלות ריאה. המודל מאפשר הערכה של מצב הריאות בזמן אמת, ובכך מרחיב את מאגר התורמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של השתלות
- פרפוזיה של ריאות Ex Vivo
- שימור איברים
רקע
- טכנולוגיית פרפוזיה של ריאות ex vivo מאפשרת הערכה טובה יותר של ריאות תורם.
- יש לה פוטנציאל לשפר את תוצאות ההשתלה באמצעות הערכת איכות האיבר.
- פיתוח מודל חיות הניתן לשחזור הוא קריטי לקידום המחקר.
- מעבדת Copper שואפת לשכלל את טכניקות הערכת האיברים.
מטרת המחקר
- ליצירת מודל עכבר עקבי עבור פרפוזיה של ריאות ex vivo.
- לקידום מחקרים על השתלת ריאות ושיפור איכות האיברים.
- להדגמת השלבים הקריטיים בהקמת מודל ה-EVLP.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קנולציה של הקנה, העורק הריאתי והעליה השמאלית.
- שימוש בחשכני לחץ ובאיסוף נתונים לצורך ניטור בזמן אמת.
- הקמת מערכת פרפוזיה חמה ושמירה על תנאים פיזיולוגיים.
- ביצוע שלב אחר שלב של הפרוצדורות הכירורגיות להוצאת הריאה.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של מודל EVLP בחולדה עם תוצאות הניתנות לשחזור.
- ניטור בזמן אמת של מצב הריאות במהלך הפרפוזיה.
- הדגמה של טכניקות לשיפור איכות האיבר לצורך השתלה.
- פוטנציאל לשיפור התוצאות בהשתלות ריאה באמצעות מודל זה.
מסקנות
- מודל ה-EVLP בחולדות הוא כלי בעל ערך למחקר בתחום השתלות ריאה.
- שיפורים במודל יכולים להוביל להערכה טובה יותר ולשימור יעיל יותר של איברי תורם.
- מחקר זה תורם למאמצים המתמשכים לשיפור שיעורי ההצלחה של השתלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביסוס של מודל הדיסו-ויבו (ex vivo) הדינמי לפרפוזיית ריאות של חולדה (EVLP) הניתן לשחזור מספק פלטפורמה פרה-קלינית להערכת אסטרטגיות לשימור ריאות ולהערכת איכות האיבר לפני השתלה. מודל זה תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית של התערבויות טיפוליות המכוונות לפגיעות ריאות מושרית-אוורור ולפתולוגיות אחרות הרלוונטיות לאופטימיזציה של ריאות תורם. על ידי מתן אפשרות לניטור בזמן אמת של פרמטרים ריאתיים, המערכת מגבירה את הביטחון החזוי בתהליכי גילוי בשלבים מוקדמים המתמקדים בביולוגיה של השתלות ובתיקון איברים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות לפגיעה בריאה ומנגנוני תיקון תחת תנאי פרפוזיה מבוקרים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי מתן אפשרות להערכה של מסלולים מולקולריים במערכת איברים שלמה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף, לצורך בדיקת תרכובות המיועדות לשיפור איכות הריאות.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות מדידה בזמן אמת של לחץ העורק הריאתי, משקל הריאות ופרמטרים של גזי דם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה פגיעה ריאתית המושרית an-וונטילציה (VILI) כדי להעריך תגובות פתופיזיולוגיות ולבחון אסטרטגיות פוטנציאליות להפחתת הנזק.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על תנאים פיזיולוגיים במהלך הפרפוזיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל ה-EVLP בחולדה משתלב ברצף הגילוי על ידי תמיכה בבדיקת היפותזות בשלבים ביולוגיים מוקדמים, מתן אפשרות להכנת בדיקה (assay readiness) לסריקת תרכובות, ואספקת פלטים כמותיים לקבלת החלטות לגבי המשך קידום (go/no-go) בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת מעורבותם של מסלולים בתהליכי פגיעה וריפוי של הריאה.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון לחץ ריאתי ומשקל הריאה, לצורך השוואה בין תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מאפשרת רכישת נתונים בזמן אמת באמצעות חיישני לחץ, מתמירים של משקל ובדיקות גזי דם להערכת תפקוד הריאה.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות מידול של VILI, פתולוגיה רלוונטית קלינית בהשתלות ריאה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך בדיקות איטרטיביות של תמיסות שימור, אסטרטגיות הנשמה וחומרים פרמקולוגיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות בתגובת הריאה להתערבויות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של קנולציה, פרפוזיה וניטור.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מותאמת סיכון במחקר של שימור איברים, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים של פיתוח השתלות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מועמדים על בסיס תוצאות תפקודיות של הריאה במקום על בסיס סממנים חלופיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בקנולציה של מיקרו-כלי דם ובאנטומיה קרדיו-pulמונרית במודלים של מכרסמים.
- תלוי בציוד הכולל משאבות פריסטלטיות, חיישני לחץ (pressure transducers), חיישני משקל ואנליזים לגזים בדם.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי פרפוזיה, הגדרות מאוורר ופרוטוקולים לרכישת נתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר ממודלים של חולדות למודלים של יונקים גדולים יותר או להערכת ריאה אנושית.
- כולל מגבלות מעשיות כגון מורכבות טכנית של הוצאת בלוק לב-ריאה ושמירה על סטריליות במהלך הפרפוזיה.
