거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

다음 실험의 목표는 투과 전자 현미경을 사용하여 얼어붙은 수화 상태의 거대분자를 이미지화할 수 있는 것입니다. 이는 샘플이 있는 그리드를 극저온계에 플래시 플런지하여 얇은 유리화 표본을 얻음으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 샘플은 거대 분자의 투영 이미지를 형성하는 전자빔에 노출됩니다.

다음으로, 거대 분자의 3D 재구성을 얻기 위해 컴퓨터에서 이미지를 처리합니다. 그 결과 거대 분자의 매우 상세한 3D 구조, 확인 및 분자 파트너의 3D 위치를 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 electromicroscopy를 위한 다른 샘플 준비 방법의 장점입니다.

cryo에서 이미지는 거대분자 내의 전자에 의해 직접 형성됩니다. 이것은 원주민에 가까운 구조를 더 충실하게 반영합니다. 이 방법을 시각적으로 보여 주는 것이 중요합니다.

극저온 그리드 준비 및 전자 현미경으로 전송되는 것은 극저온에서 작업할 때 추가적인 복잡성으로 인해 배우기 어렵고, 워밍업 주기는 펌핑 시퀀스 시작 및 극저온 EM 세션 후에 사용됩니다. 이 절차를 시작하려면 극저온 홀더를 펌핑 스테이션의 펌핑 포트 중 하나에 삽입하십시오. 워밍업 주기 옵션을 시작합니다.

콜드 스테이지 컨트롤러에서 버터 플라이 밸브 V 2를 열고 터보 펌핑 스테이션의 진공이 안정화되어 마이너스 3에서 10을 읽거나 버터 플라이 밸브 V를 여는 것이 좋습니다. 홀더의 온도가 실온 이상으로 안정되고 예열 주기가 완료되면. V를 1 낮추고 사이클을 중지합니다.

다음으로, ze light cycle 옵션을 시작하고 1-2 곱하기 10에서 마이너스 4 tor 범위에서 좋은 진공을 얻는 데 필요한 시간을 선택하십시오. 진공이 10에서 영하 3도에 도달하여 범위를 확보하면 DU 배출 밸브 B 3과 극저온 홀더의 밸브를 엽니다. 사이클이 완료되면 밸브를 연 반대 순서로 밸브를 올렸습니다.

핀셋을 사용하여 운모 조각을 남겨 두 개의 새로운 표면을 노출시킵니다. 새로 노출된 운모 표면을 페트리 접시의 흰색 종이 위에 위로 향하게 놓습니다. 페트리 접시를 탄소 증발기의 용기에 넣은 후 진공이 10 미만에서 마이너스 6 토르 미만이 될 때까지 펌프 다운 시퀀스를 수행하여 운모를 얇은 탄소 층으로 코팅합니다.

그런 다음 얇은 탄소를 그리드로 옮깁니다. 0.5 x 1 센티미터의 코팅된 운모 조각으로 탄소를 여과된 탈이온수의 평평한 표면에 띄웁니다. 핀셋을 사용하여 그리드의 신성한 탄소 면을 부유 탄소 층의 상부 표면과 접촉시키고 집어 올립니다.

파워 필름으로 덮인 7.5 x 2.5cm 유리 슬라이드에 탄소 면이 위를 향하도록 그리드를 놓습니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 글로우 방전 장비의 챔버에 놓고 챔버를 닫습니다. 방울 항아리를 펌핑하고 빛을 발하십시오.

25 밀리 암페어에서 20 초 동안 방전하고 마이너스 2 밀리바까지 10을 7 곱하기 방전합니다. 이 시점에서 플런지 동결 장치를 켭니다. 저장소에 액체 질소를 채워 Ethan 용기를 아래로 당깁니다.

액체 질소가 끓는 것을 멈추면 Ethan 탱크에서 나오는 튜브의 끝을 내부 챔버에 놓고 밸브를 매우 천천히 엽니다. 내부 챔버에서 에탄을 액화하고 상단에서 1mm까지 채웁니다. 습도를 켭니다.

다음으로, 그리드를 핀셋에 로드하고 3-5마이크로리터의 샘플을 홀리 그리드의 탄소 표면에 로드합니다. 샘플이 그리드에 흡수될 때까지 기다린 후 블로팅을 수행하여 얇은 액체층 블러시를 얻으려면 그리드를 액체 에탄에 밀어 넣어 그리드를 동결합니다. 액체 에탄에서 핀셋 그리드 어셈블리를 조심스럽게 제거하고 액체 질소가 들어 있는 외부 챔버로 옮깁니다.

그런 다음 그리드를 액체 질소에 잠긴 작은 그리드 상자로 옮깁니다. 이 시점에서 극저온 홀더를 극저온 이송 워크스테이션에 삽입합니다. 극저온 홀더와 워크스테이션 용기의 작업자를 액체 질소로 채웁니다.

냉동 수화 그리드가 들어 있는 극저온 그리드 상자를 워크스테이션의 액체 질소로 빠르게 옮깁니다. 극저온 그리드 상자를 연 후 냉동 수화 그리드를 가져와 샘플 홀더 슬롯에 넣습니다. 그런 다음 클립 링을 그리드 위에 놓고 클립 링 도구의 뭉툭한 끝으로 제자리에 단단히 고정될 때까지 부드럽게 누릅니다.

그런 다음 크라이오 셔터를 닫습니다. TEM 오염 방지를 액체 질소로 마무리합니다. 현미경 스테이지를 영하 60도로 다시 기울입니다.

그런 다음 현미경에서 PrepU 에어록 주기를 시작합니다. 펌프 에어록 시퀀스가 완료되면 합창단 홀더를 에어록에 삽입하고 콜드 스테이지 제어 코드를 홀더에 연결하여 온도를 모니터링합니다. 빨간불이 꺼진 후 홀더를 0도 위치로 회전하여 T EM의 고진공 컬럼에 삽입합니다.

극저온 셔터를 집어넣고 컬럼 밸브를 엽니다. 검색 모드에서 저용량 프로그램을 활성화합니다. 스테이지를 중앙에 배치하고 알파 워블러를 사용하여 중심 높이를 설정하여 스테이지를 플러스 또는 마이너스 15도 흔들고, 적절한 구멍을 선택한 다음 XY 스테이지 컨트롤러로 필드 중앙에 배치합니다.

초점 모드로 전환하고 이미지에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 0.5에서 4.5 미크론 사이의 이미지에 초점을 맞춥니다. 노출 모드로 전환하고 이미지를 기록합니다.

마지막으로 검색 모드로 돌아가서 다음 구멍을 선택하고 순서를 반복합니다. 서로 다른 구조적 특성을 가진 4개의 대표적인 표본에 대해 음성 염색 및 Cryo EM 방법으로 얻은 현미경 이미지를 여기에서 비교하여 음성 염색된 아데노 관련 바이러스 캡시드는 바이러스와 유사한 입자를 나타내고 cryo EM은 비어 있음을 나타냅니다. 담배 모자이크 바이러스의 이미지는 음성 염색에서 중앙 채널이 얼룩으로 채워지고 cryo EM 이미지에서는 비어 있는 나선형 막대를 보여줍니다.

KLH는 negative staining 및 cryo EM 이미지 모두에서 6개의 줄무늬를 보여주는 특징적인 배럴에 조립됩니다. 직사각형 측면도와 원형 및 켜짐 보기는 오딘 수용체에서 cryo EM에 의한 구조에서 비어 있음을 나타냅니다. 중앙 십자가 및 중앙 함몰부와 같은 복잡한 표면 특징은 음성 염색에 의한 얼룩 축적과 cryo em에 의한 저밀도 영역으로 나타납니다.

Cryo EM 아티팩트의 일반적인 예로는 결정질 얼음, 얼음 오염, 난시 및 거미줄과 같은 구조가 있습니다. 단일 입자 분석 및 냉동 수화 수용체 1의 3D 재구성은 4중 대칭 구조를 나타냅니다. 세포질 도메인은 정사각형 프리즘을 형성하고 골격과 같은 구조를 형성하는 여러 재현 가능한 gular 도메인을 포함합니다.

10 옹스트롬 해상도에서는 알파 HELOC을 3D로 시각화할 수 있습니다. 차이 매핑은 중요한 리간드의 위치를 나타낼 수 있습니다. 확인 변화는 거대 분자에 대한 동적 관점을 제공합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 고품질 cryo EM 시료를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이미지 처리와 결합된 Cryo EM을 통해 연구원들은 고분자 기계의 구조, 소단위 조직 및 구조적 역학을 탐구할 수 있었습니다.