약리학 연구에 고립 된 조직 목욕-애플리케이션에서 부드러운 근육 기능의 측정

이 절차의 전반적인 목적은 평활근 긴장도를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 조직을 절제 및 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 준비된 조직을 격리된 조직 욕조(tissue bath)에 장착하는 것입니다.

그 후 조직의 생존력을 테스트하고 등척성 수축 측정을 수행합니다. 최종적으로, 분리된 조직 욕조 준비물을 사용하여 수용체 기능, 수용체 신호 전달 및 평활근 반응성을 테스트합니다. 일반적으로 이 기술의 주요 장점은 시스템의 유연성, 결과 도출의 신속성, 그리고 조직 전체를 온전하게 유지할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 수용체 신호 전달이나 평활근 수축을 방해하기 위해 약물을 사용하는 모든 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 강조해야 할 몇 가지 준비 사항이 있습니다. 재순환 가열 수조를 켜서 조직 배스 시스템을 37 °C로 예열하는 것이 매우 중요합니다. 물은 각 구성 요소의 가장 낮은 바브 연결부로 유입되어 가장 높은 바브 연결부로 유출되어야 합니다.

각 구성 요소를 연결해야 합니다. 힘 변환기(force transducer)는 교정되어야 하며, 온도를 평형 상태로 맞추기 위해 실험 시작 최소 15분 전에 전원을 켜야 합니다. 그다음, 가스를 연결할 때 누출 여부를 확인한 후 시스템에 가압하십시오.

시스템을 용액으로 채운 후, 반드시 프라이밍을 수행하여 기포를 제거하십시오. 조직 욕조(tissue bath) 에어레이터를 테스트하는 것도 필요합니다. 적절한 통기는 약물을 효과적으로 분산시키지만, 실험 직전에 조직을 불안정하게 만들지 않아야 합니다.

조직을 해부합니다. 쥐에게 마취를 실시한 후, 가위를 사용하여 기흉을 유도합니다. 흉곽 하단의 횡격막을 따라 절개합니다.

그다음 흉곽 하단에서 흉골까지 절개한 후 조직을 이분합니다. 척주 위의 장기들을 제거하여 척주를 따라 바로 위치한 대동맥을 찾습니다. 이제 대동맥에 연결된 모든 부위를 절단하고, 횡격막 높이에서 척추와 수직이 되도록 대동맥을 절단합니다.

다음으로, 대동맥을 부드럽게 잡고 척추에서 대동맥을 박리합니다. 척추에 인접한 횡격막 하단 부위부터 시작하여 심장 방향으로 진행합니다. 이때 대동맥 조직을 당기거나 끌어올리면 조직에 즉각적인 손상을 줄 수 있으므로 주의하십시오.

PSS가 들어 있는 해부 접시에 대동맥을 놓습니다. 이제 와이어를 사용하여 작은 90도 각도를 만듭니다. 와이어의 꺾인 끝부분을 해부 접시의 바닥에 고정합니다.

그 다음 가이드 와이어를 대동맥 내강 속으로 조심스럽게 삽입하고 대동맥을 와이어 위로 미끄러뜨리듯 밀어 넣습니다. 와이어의 자유단이 보이면, 이를 부드럽게 구부려 고정대에 밀어 넣어 조직을 안정화합니다. 이제 작은 정맥 가위와 포셉을 사용하여 흉부 대동맥이 하얗고 다소 섬유질처럼 보일 때까지 혈관 주위 지방 조직 및 기타 불필요한 조직을 제거합니다.

과잉 조직을 제거한 후, 와이어에서 깨끗한 대동맥을 조심스럽게 분리합니다. 대동맥을 3~5mm 너비의 링 형태로 절단하여 이 과정을 마무리합니다. 각 대동맥 링을 준비합니다.

욕조 챔버(bath chamber) 내에 고정하기 위해 봉합사가 달린 조직 훅(tissue hook) 두 개를 준비합니다. 하나의 훅에는 막대에 부착할 수 있도록 작은 매듭 루프가 있는 봉합사가 있어야 합니다. 다른 훅에는 10에서 14 cm 길이의 봉합사가 필요합니다.

매듭을 묶으려면, 이러한 조직 후크 한 쌍을 각 대동맥 링에 조심스럽게 부착하십시오. 후크가 엉키지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 링 스탠드에 조직 홀더를 고정한 후, 각 조직 조각을 상온의 PSS가 담긴 디시로 옮기십시오.

다음으로, 매듭지어진 루프를 로드의 페그에 끼우고 긴 봉합사를 사용하여 조직을 위로 고정합니다. 그런 다음 로드를 챔버에 넣고 로드가 단단히 고정되었는지 확인합니다. 이제 남은 후크의 봉합사를 힘 변환기(force transducer)에 묶습니다.

힘 변환기와 조직 사이의 장력을 마이크로미터를 통해 조절할 수 있도록 봉합사에 충분한 여유를 둡니다. 각 챔버의 각 링에 대해 이 과정을 반복합니다. 이제, 수동 장력을 설정합니다.

마이크로미터를 사용하여 장력을 2g까지 높인 다음, 조직에 가해지는 장력의 증가가 멈출 때까지 기다립니다. 그다음 장력을 2g 더 높이고, 다시 한번 장력의 변화가 멈출 때까지 기다립니다. 이것으로 종료합니다.

이제 장력은 약 3.2 grams가 되어야 합니다. 각 챔버의 각 링에 대해 이 과정을 반복하십시오. 모든 수동 장력을 설정한 후, 조직이 평형 상태에 도달하도록 1시간 동안 둡니다.

이 시간 동안 15분마다 PSS를 교체하고, 평형 도달 기간 종료 시점에 사용할 약물을 준비하는 등 실험을 위한 기타 준비 작업을 수행하십시오. 조직을 마지막으로 한 번 더 세척한 후, 데이터를 저장하고 모든 입력값을 초기화하십시오. 그다음 텍스트 프로토콜의 세부 사항에 따라 초기 자극을 가하십시오.

이러한 조작 내용을 소프트웨어에 반드시 기록하십시오. 초기 자극 후에는 장력 변화가 정체기에 도달할 것입니다. 그런 다음 자극 약물을 세척하여 조직의 긴장도가 기저선으로 돌아오게 하십시오.

이제 조직을 이 기저 긴장도 상태에서 약 10분 동안 안정시킵니다. 한쪽 욕조에는 용매(이 경우 물)를, 다른 쪽 욕조에는 물을 넣습니다. 욕조 내 농도가 5 nM이 되도록 충분한 양의 prazocin을 첨가합니다. 세척 없이 1시간 동안 조직 욕조를 배양합니다.

그동안 페놀린(phenol rine)을 로그 곡선을 따라 광범위한 농도로 준비합니다. 한 시간 후, 누적 농도 반응을 생성하기 위해 농도를 점차 높인 페놀린 작용제(phenyl rine agonist)를 배스(bath)에 첨가합니다. 매 첨가 후에는 다음 농도를 추가하기 전에 조직 반응이 평탄기(plateau)에 도달할 때까지 기다립니다.

조직의 긴장도가 더 이상 변하지 않거나 전체 반응 곡선이 평탄해질 때까지 계속해서 첨가하십시오. 그 대신, 흉부 대동맥을 alpha one adrenergic receptor antagonist인 POZ sim에 1시간 동안 배양한 후, 조직 욕조에 alpha one adrenergic agonist인 phenyl rine을 첨가하여 누적 수축 반응 곡선을 생성하고 phenyl rine의 최대 및 반최대 수축을 측정하였습니다. vehicle만 처리한 대조군 조직은 녹색으로 표시되어 있습니다.

반최대값은 약물의 유효 농도를 나타냅니다. razin 처리된 조직에 대한 동일한 측정값은 검은색으로 표시됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 분리된 조직 욕조(isolated tissue bath)에서 평활근 기능을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.