2015년 1월 19일
이 프로토콜은 격리된 조직 수조 시스템과 컴퓨터 기반 데이터 수집을 사용하여 격리된 평활근 제제에서 등척성 수축을 측정하는 방법을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 평활근 긴장도를 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 조직을 해부하고 준비함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 분리된 조직 수조에 조직을 장착하는 것입니다.
그런 다음 조직의 생존력을 테스트하고 등척성 수축 측정을 수행합니다. 궁극적으로, 분리된 조직 수조 제제는 수용체 기능, 수용체 신호 전달 및 평활근 반응성을 테스트하는 데 사용됩니다. 일반적으로 이 기술의 주요 장점은 시스템의 유연성, 결과 달성의 신속성 및 전체 조직을 그대로 유지하는 것입니다.
이 방법은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다 약물을 사용하여 수용체 신호 전달 또는 평활근 영혼을 방해하는 모든 분야에서는 강조해야 하는 몇 가지 준비가 있습니다. 재순환 가열식 수조를 켜서 티슈 수조 시스템을 섭씨 37도로 예열하는 것이 중요합니다. 물은 가장 낮은 미늘 연결부에서 각 구성 요소로 흘러 들어가야 하고 가장 높은 미늘 연결부에서 흘러나와야 합니다.
각 구성 요소를 연결해야 합니다. 힘 센서는 보정해야 하며 온도를 평형으로 유지하기 위해 실험 최소 15분 전에 전원을 켜야 합니다. 다음으로, 가스를 연결할 때 누출 여부를 확인한 다음 시스템에 압력을 가하십시오.
시스템에 용액을 채운 후에는 프라이밍하고 기포를 제거하십시오. 티슈 수조 통풍기 테스트도 보증됩니다. 통기가 잘되면 약물이 효과적으로 분배되지만 실험 직전에 조직이 불안정해지지 않습니다.
조직을 해부합니다. 쥐를 마취시킨 후 가위를 사용하여 기흉을 만듭니다. 흉곽 하단의 횡격막을 따라 저주합니다.
그런 다음 흉곽 바닥에서 흉골까지 자르고 조직을 이등분합니다. 척추 위의 장기를 제거하여 척추를 따라 바로 있는 대동맥을 찾습니다. 이제 대동맥에 대한 모든 연결을 끊고 횡격막 수준에서 척추에 수직으로 대동맥을 자릅니다.
다음으로, 대동맥을 부드럽게 잡고 척추에서 대동맥을 절개합니다. 척추에 인접한 하부 횡격막 부위에서 시작하여 심장을 향해 작업합니다. 대동맥 조직을 당기거나 잡아당기면 즉시 손상될 수 있으므로 주의해야 합니다.
PSS가 들어있는 박리 접시에 대동맥을 놓습니다. 이제 와이어를 잡고 작은 90도 각도를 만듭니다. 한쪽 끝에서 와이어의 각진 끝을 해부 접시의 기초에 고정합니다.
그런 다음 가이드 와이어를 대동맥 내강에 조심스럽게 끼우고 대동맥을 와이어에 밀어 넣습니다. 와이어의 자유 끝이 보이면 부드럽게 구부리고 기초에 밀어 넣어 조직을 안정화합니다. 이제 작은 비너스 가위와 집게를 사용하여 흉부 대동맥이 하얗고 다소 섬유질로 보일 때까지 혈관 주위 지방 조직과 기타 외부 조직을 제거합니다.
여분의 조직이 제거되면 와이어에서 깨끗한 대동맥을 조심스럽게 제거합니다. 대동맥을 3-5mm 너비의 고리로 잘라 이 부분을 마무리한다. 도달 대동맥 고리.
목욕탕에 고정하기 위해 봉합사가 있는 두 개의 티슈 고리를 준비하십시오. 하나의 후크에는 막대에 부착하기 위한 작은 매듭 고리가 있는 봉합사가 있어야 합니다. 다른 고리는 10-14cm 길이의 봉합사 조각이 필요합니다.
매듭을 묶으려면 이 조직 고리 한 쌍을 각 대동맥 고리에 조심스럽게 부착하십시오. 후크가 엉키지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 티슈 홀더를 링 스탠드에 고정한 상태에서 각 티슈 조각을 실온 PSS 접시에 옮깁니다.
다음으로, 매듭이 있는 고리를 막대의 못에 끼우고 긴 봉합사 조각을 사용하여 조직을 고정합니다. 그런 다음 막대를 챔버에 넣고 막대가 고정되어 있는지 확인하십시오. 이제 나머지 후크의 봉합사를 힘 변환기에 묶습니다.
봉합사를 충분히 느슨하게 하여 힘 변환기와 조직 사이의 장력을 마이크로미터 단위로 조정할 수 있습니다. 각 챔버의 각 고리에 대해 이 과정을 반복합니다. 이제 패시브 장력을 설정하십시오.
마이크로미터를 사용하여 장력을 2g으로 높이고 조직의 장력이 증가를 멈출 때까지 기다립니다. 그런 다음 장력을 2g 더 높이고 다시 장력이 바뀔 때까지 기다립니다. 끝마치다.
장력은 이제 약 3.2g이 되어야 합니다. 각 챔버의 각 링에 대해 이 과정을 반복합니다. 모든 수동 장력을 설정한 후 한 시간 동안 조직이 평형을 이루도록 합니다.
이 시간 동안 15분마다 PSS를 교체하고 평형 기간이 끝날 때 약물을 준비하는 것과 같은 실험을 위한 다른 준비를 합니다. 마지막으로 조직을 한 번 씻고 데이터를 저장하고 모든 입력을 다시 로드합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜의 세부 사항에 따라 초기 챌린지를 만듭니다.
이러한 작업을 소프트웨어에 문서화해야 합니다. 초기 챌린지 후에는 장력 변화가 안정됩니다. 그런 다음 챌린지 약물을 씻어내어 조직의 색조가 기준선에 도달하도록 합니다.
조직을 이 기준선 톤에서 약 10분 동안 그대로 두고, 이 경우 차량에서 한 욕조를 한 욕조에 넣고, 다른 욕조에 물을 줍니다. 수조에서 5나노몰 농도를 위해 충분한 프라조신을 첨가합니다. 티슈 욕조를 씻지 않고 한 시간 동안 배양하십시오.
한편, 로그 곡선을 따라 광범위한 농도에서 페놀 라인을 수리하십시오. 한 시간 후, 페닐 라인 작용제를 첨가하여 농도를 증가시키는 수조에 첨가하여 누적 농도 반응을 생성합니다. 추가할 때마다 다음 농도를 추가하기 전에 조직 반응이 안정기에 접어들 때까지 기다립니다.
더 이상 조직의 톤을 변경하지 않거나 전체 반응 곡선이 안정될 때까지 계속 추가합니다. 오히려, 흉부 대동맥을 알파 원 아드레날린성 수용체 길항제 POZ sim에서 1시간 동안 배양한 후 알파 원 아드레날린 작용제 페닐 린을 조직 배스에 첨가하고 누적 수축 반응 곡선 페닐 린의 최대 및 절반 최대 수축을 생성하였다. 차량에만 제어 조직이 녹색으로 표시되어 있습니다.
절반 최대치는 약물의 유효 농도를 식별합니다. razin 처리 된 조직에 대한 동일한 측정이 검은 색으로 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 격리된 조직 수조에서 평활근 기능을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 프로토콜은 조직 배양 시스템을 사용하여 분리된 평활근의 등장성 수축 측정을 설명합니다. 평활근 톤의 준비 및 시험을 상세히 설명하고 조직 생존성 유지의 중요성을 강조합니다.
The isolated tissue bath assay enables precise measurement of smooth muscle contractility, providing critical data for target validation in cardiovascular and metabolic disease programs. By quantifying agonist potency and antagonist efficacy in intact tissue, this method supports mechanistic de-risking of pharmacological interventions before lead optimization. Its reproducibility and scalability make it a valuable tool for early discovery workflows requiring functional validation of vascular targets.
The isolated tissue bath functions as a discovery-stage assay that informs target selection and lead identification by providing functional readouts of receptor-mediated smooth muscle responses.