Name: 전체 담배 연기에의 Organotypic 3D 기관지와 코 조직 문화 모델의 반복 노출의 영향 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 배우세요 담배 연기가 3D 기관지와 코 조직 모델에 미치는 영향을 평가하는 방법을. 섬모 운동 측정과 전사체 분석을 통해 호흡 독성학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 원고의 자신의 검토를 위해 모리스 스미스와 Marja Talikka에게 감사의 말씀을 전합니다.

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
<li>Port, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+CYP1B1+in+the+aerodigestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesi%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract.</a> Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).</li>
<li>Hoeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network-based+approach+to+quantifying+the+impact+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Toda%22%5BJournal%5D)">A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances.</a> Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).</li>
<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+3402%3A+Tobacco+and+tobacco+products+--+Atmosphere+for+conditioning+and+testing%22">ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing</a>. , International Organization for Standardization. (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , The R Core Team. (2011).</li>
<li>Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mapping+of+probes+to+genes+for+Affymetrix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatic%22%5BJournal%5D)">Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips.</a> BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).</li>
<li>Hermida, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confero%3A+an+integrated+contrast+data+and+gene+set+platform+for+computational+analysis+and+biological+interpretation+of+omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomic%22%5BJournal%5D)">Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data.</a> BMC genomic. 14, 514(2013).</li>
<li>Thomson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+biological+impact+using+transcriptomic+data+and+mechanistic+network+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+applied+pharmacolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models.</a> Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).</li>
<li>Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+applied+by+cilia+depend+linearly+on+their+frequency+due+to+constant+geometry+of+the+effective+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journa%22%5BJournal%5D)">The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke.</a> Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sc%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

이 연구는 필립 모리스 인터내셔널 (Philip Morris International)에 의해 투자되었다.

여기서는 반복 CS 노출의 영향을 평가하는 인간의 Organotypic 기관지 비강 조직 모델의 적용 가능성을 보여 주었다. 동물 실험에 대한 대안으로, 노광 시스템의 수는 (예., Vitrocell, Cultex, ALICE 등) 시험관 내에서 에어로졸 노출 독성 평가를 위해 개발되었다. 이러한 노광 모듈도 본 연구 등 공수 오염 물질, 공기 중의 입자, 나노 입자의 독성 학적 평가를 위해 이용 될 수 있고, 우리는 더 큰 규모의 실험 간의 낮은 가변성을 허용 동시에 48 가지의 다른 샘플들까지 수용 할 수 Vitrocell 시스템을 사용 치료. 시험관 내에서 모든 에어로졸 노출, 조직 배양 오염의 위험은 저감 그 실험에 걸쳐 조직 배양의 취급에주의를 요구하는 주요 위험 남아있다. E 중 미량 천칭에 실시간 입자 침착을 측정xposure 실험은 노출 시스템에서 생성 된 CS 량은 기대에 부합하는 것을 모니터링 할 수 있습니다. 설정해서 온라인 측정을 정확하게 노광 전에 것은, 예 critial 때문에 마이크로 저울 (cm 2)의 영역의 차이, 또한 0으로 스케일을 설정하고, 측정 된 입자의 증착의 정확성 조직 배양 인서트 (0.33 cm 2), 우리는 배양 인서트의 영역에 최종 계산을 조정 된 미량 천칭에 증착 단지 33 %가 배양 인서트의 실제 증착을 반영한다. 꽉 접합 장벽 기능을 확인하고 상피 층의 중단을 평가하기 위해 봉사자의 측정은 우리가 여기에보고 구현하기 비교적 쉬운 과정이다. 비강 및 기관지 조직 모델 점액 생산 산재 배 세포를 포함하기 때문에, 정점 세척 봉사자 MEAS 전에 행할 필요하여 연산. 정점 세척 중요하므로 점액층의 존재 및 CS 노출의 영향 interferring 두께 캔 바이어스 티에르의 측정 가변성. 이 개념은 Hilgendorf 및 카코-2 세포의 투과성이 점액을 생산하는 술잔 세포 라인 HT29 (23)와 공동 배양에 의해 영향을 받았다있는 동료들에 의해보고 된 것과 일치한다. 바로 노출 전에 혀끝의 세척 CS에 대한 조직 반응을 방해 할 수 있기 때문에 점액 전에 봉사자 측정에 씻어해야합니다. 따라서, 측정은 노출 3 일 전에 수행 및 노출되기 직전되지 않습니다. 우리는 활동이 완만 한 CS 증가되었지만 CYP1A1 / CYP1B1 활동이 CS 노출 다음의 Organotypic 문화 모델에서 측정 될 수 있음을 보여 주었다. 이 약한 신호는 CYP1A1 / 1B1 기판의 장기간 배양에 의해 증폭 될 수있다 (예., 루시페린 - CEE), 예컨대 대24 시간 (데이터 미기재). 본 연구에서 CYP 활성 측정의 한계 중 하나는 효소 활성에 변화가 영향을받지 않도록 CYP 단백질 수준 또는 미래 연구를 위해 고려 될 수있는 세포 수로 정규화 결석 단백질 수준 또는 세포 수의 변화 중 하나에 의하여. 우리는 CS 노출은 비강과 기관지 조직 모델을 모두 제치고 섬모를 억제 보도했다. 비슷한 관찰 다양한 포유 동물 및 비 - 포유 동물 모델 (12)에서 수행 하였다. 섬모가 측정 치는 조직을 유사한 방식으로 처리하고 처리하도록 할 변화 매체가 구현되는 경우, 모든 샘플에 적용되어야한다, 예를 들면, 중요하다. Sutto와 동료들은 pH가 주파수 (24)를 때리고 포유 동물의 섬모에 영향을 보도했다. 따라서, 다른 compunds / 혼합물의 pH로 처리 한 세포 사이의 주파수를 치고 비교할 때조정은 모양체 박동 측정의 변동을 최소화하기 위해 고려되어야한다. 모양체 고해 주파수가 감소함에 따라 온도 강하 더욱이, 측정이 수행되는 온도는 중요하다. 본 연구에서 사용 된 온도, CO 2, 조습 갖추고 이러한 변화, 탑 스테이지 배양기에 의한 변동을 최소화. 그럼에도 불구하고, 우리는 CS 노출 후 기관지 조직에 주파수를 치는 섬모는 섬모 구타 노출 후 매우 방해 권리가 있음을 시사 매우 변수 (예., 하나 삽입 증가하고 다른 삽입 감소)이라고 관찰했다. 대조적으로, 우리는 비강 조직의 반응이 더 민감하고 일관성이 있음을 시사 CS 노광 후의 비강 조직에서 측정 모양체 비팅 주파수의 유무를 관찰했다. 이 비강 조직으로 독을 제거하기 위해 낮은 용량을 가지고 있음을 보여주는 이전의 출판물과 일치한다기관지 (25)와 비교. 마지막으로, 우리는 CS에 노출의 Organotypic의 기관지와 코 조직 모델에서 프로파일 유전자 발현이 생체 이물 대사에 CS의 영향을 설명 할 수 있음을 보여 주었다. 이전 출판 (15)에 자세히 설명한 바와 같이 흥미롭게도, CS에 노출 체외 모델에서 관찰의 Organotypic의 기관지에서 생체 이물 대사 변경과 코는 흡연자의 생체 내 상황의 유사. 유전자 발현 분석을 위해, 로봇 기기를 사용하면 높은 처리량 분석을 가능하게한다. 또한, 자동 핸들링 로봇은 상기 유전자 발현 결과의 일관성 및 정확성을 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, 조직 샘플의 신속한 수집 RNA 추출 중에 RNA의 분해를 방지하는 것이 중요했다. RNA 프로세싱 및 여기서 설명 transcriptomic 접근법은 또한 생체 조직 샘플에 적용될 수있다.

폐는 오염 물질 및 담배 연기 성분(CS)과 같은 다양한 독성 물질을 포함할 수 있는 흡입된 공기에 직접적이고 지속적으로 노출됩니다. 이러한 독성 물질에 대한 노출이 호흡기 조직에 미치는 영향을 연구하는 것은 생체 내 노출과 유사한 방식으로 수행할 때 가장 유익합니다. 고전적인 2D 침지 세포 배양(예: 정상 인간 기관지 상피 세포(NHBE))과 비교하여 3D 유기형 조직 모델은 생체 내 인간 기도 상피의 형태학적, 생리학적, 분자적 측면을 더 잘 요약합니다 1,2: 3D 조직 모델에는 생체 내에서 관찰된 세포 유형의 다양성이 포함되어 있습니다, 분화된 상피 세포, 섬모 및 비섬모 세포, 배상 세포 및 기저 세포를 포함합니다. 그들은 기능적으로 긴밀한 연접을 가지고 있으며 점액섬모 표현형 1-3을 나타냅니다. 또한, 배양물은 공기-액체 계면의 투과성 다공성 막에서 성장할 수 있으므로 정점 측에서 에어로졸에 직접 노출될 수 있습니다(기저 측은 배양 배지에 잠겨 있음) 3-5. 드보르작(Dvorak)과 동료들은 기관지 조직 모델의 유전자 발현 프로파일이 인간의 기관지 칫솔질에서 얻은 것과 유사하다고 보고했다 3. 또한, Mathis와 동료들은 CS에 대한 이러한 조직 모델의 반응이 흡연자로부터 얻은 기관지 상피 세포와 비흡연자로부터 얻은 세포 간에 관찰된 차이와 유사하다는 것을 보여주었습니다 6. 마지막으로, 기관지 조직 모델은 최대 몇 개월 동안 배양될 수 있기 때문에 4,5, 잠재적으로 테스트 항목의 장기 노출의 영향을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 
세포독성 평가는 화학적 모욕 후 또는 특정 화합물 또는 혼합물의 독성을 평가하기 위해 측정되는 일반적인 매개변수입니다. 예를 들어, 멤브레인 무결성은 발광 분석법으로 측정할 수 있으며 세포 배양 7에 대한 용량 의존적 세포독성 효과를 측정할 수 있습니다. 그러나 저독성 농도에서 화합물의 병태생리학적 영향을 평가하려면 다른 매개변수를 측정해야 합니다. 예를 들어, 경상피 전기 저항(TEER) 분석을 사용하여 측정된 조직 무결성은 밀착 접합의 기능을 보장하고 상피층의 파괴를 모니터링합니다 8,9. 섬모 박동 빈도는 또한 호흡기 조직에 대한 CS 관련 효과를 측정할 수 있습니다. 상기도와 하호흡기와 접해 있는 섬모 내벽의 정상적인 박동 빈도는 기도 감염을 예방하는 데 중요하다 10. 호흡기 상피의 각 섬모 원주 상피 세포는 200-300개의 섬모가 특정 주파수로 박동하여 산재된 잔 세포에 의해 방출되는 점액에 갇힌 감염원 또는 흡입된 미립자 물질을 제거합니다 11. CS에는 섬모 박동을 억제할 수 있는 화학 물질이 포함되어 있으며12 이는 호흡기의 보호를 감소시킵니다. 이 연구는 유기형 조직 모델에서 섬모 박동을 측정할 수 있음을 보여줍니다. 이 접근법을 통해 상피 세포가 유기형 조직 배양에서 정상적인 기능을 발휘하는지 여부를 평가할 수 있습니다. CS는 또한 호흡기에서 이종생물 대사 반응을 활성화하여 담배 연기 성분을 대사합니다 13. 조직 모델의 I상 생체 대사 효소인 CYP1A1 및 CYP1B1의 활성을 측정할 수 있습니다. 또한, 이전에 보고된 바와 같이, 전체 유전자 발현은 유기형 기관지 조직 모델 6,14,15에서 측정할 수 있습니다. 전사체 데이터 및 네트워크 기반 시스템 생물학 접근법을 활용하여 CS가 생체 이물 대사에 미치는 영향을 평가합니다 15. 
체외 노출 시스템을 사용하여 유기형 3D 기관지 및 코 조직 모델을 주류 CS에 노출시키고 신선한 공기 노출(대조군)과 비교하여 이 노출에 대한 조직 반응을 측정하는 데 사용되는 방법론이 여기에 자세히 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MucilAir-human fibroblasts-bronchia</td><td>Epithelix S&aacute; rl, 스위스 제네바</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>MucilAir Culture Medium</td><td>Epithelix S&aacute; rl, 스위스 제네바</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F 참조 담배</td><td>켄터키 대학교</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr> <tr><td>30포트 회전목마 흡연기 SM2000</td><td>Philip Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CiliaMetrix 카메라 및 소프트웨어</td><td>La Haute &Eacute; cole de Gestion (HESGE), 제네바, Switzlerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMIL 현미경&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 광원</td><td>Titan Tool Supplies, Buffalo, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>젓가락 전극 STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr> <tr><td>EVOMXTM 상피 전압계&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr> <tr><td>루시페린 검출 시약&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNA 라이저 기기&nbsp;</td><td>로슈</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=</td><td></td></tr><tr><td>QIAcube&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Agilent 2100 바이오분석기&nbsp;</td><td>애질런트</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip 고처리량 3' IVT Express Kit</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>스캐너 3000 7G&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 담배 연기에의 organotypic 3d 기관지와 코 조직 문화 모델의 반복 노출의 영향 평가

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

담배 연기(CS)는 폐 생물학에 큰 영향을 미치며 만성 폐쇄성 폐 질환 또는 폐암과 같은 폐 질환의 발병을 초래할 수 있습니다. 질병 발병의 기저 메커니즘을 이해하려면 CS 노출이 폐 조직에 미치는 영향을 직접 조사하는 것이 중요합니다. 그러나 이 접근 방식은 폐 조직 샘플링이 복잡하고 침습적이기 때문에 역학 연구에서 구현하기 어렵습니다. 또는 조직 배양 모델을 통해 폐 조직에 대한 노출 영향 평가를 용이하게 할 수 있습니다. 정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포 배양과 같은 수중 2D 세포 배양은 전통적으로 이러한 목적으로 사용되어 왔습니다. 그러나 생체 내 노출 상황과 유사한 방식으로 연기에 직접 노출될 수 없습니다. 최근에 개발된 3D 조직 배양 모델은 공기-액체 계면(ALI)에서 배양할 수 있기 때문에 생체 내 상황을 더 잘 반영합니다. 그들의 기저 측면은 배양 배지에 잠겨 있습니다. 반면에, 그들의 정점 측면은 공기에 노출됩니다. 또한, 다양한 유형의 세포를 포함하는 유기형 조직 배양은 생체 내 조직의 생리학을 더 잘 나타냅니다. 이 연구에서는 인간 유기형 기관지 및 코 조직 모델을 주류 CS에 노출시키기 위한 체외 노출 시스템의 활용을 보여줍니다. CS가 조직에 미치는 기능적 영향을 평가하기 위해 섬모 박동 빈도와 사이토크롬 P450s(CYP) 1A1/1B1의 활성을 측정했습니다. 또한, 분자 수준에서 CS에 의한 변화를 조사하기 위해 노출 후 조직에서 유전자 발현 프로파일을 생성했습니다. CYP1A1/1B1 활성의 경미한 증가는 공기에 노출된 조직과 비교하여 CS에 노출된 조직에서 관찰되었습니다. 네트워크 및 전사체학 기반 시스템 생물학 접근법은 흡연자로부터 얻은 기관지 및 코 상피 세포에서 관찰된 것과 유사한 CS에 의한 생체 이물 대사의 변화를 입증하기에 충분히 강력했습니다.

아래에 설명 된 결과에서의 Organotypic 조직 건강, 금연로부터 격리 차 인간 상피 세포, 백인 기증자이었고, 섬유 아세포 (15)를 사용하여 재구성 하였다. 3D 기관지와 코 조직 모델 체외 기관지와 코의 Organotypic 모델에서 세포 수준 인간의 호흡기 상피 세포 (그림 2)에서 유사. CS 노출 비강의 Organotypic 기관지 조직 모델 반복적 공기 - 액체 계면에서 주류 CS에 노출 될 수있다. 여기에 도시 된 결과를 사용 흡연 노출 실험 절차는도 1에 도시되어있다. 섬모 박동의 기록 속눈썹 박동이 동영상에 도시 된 바와 같이 공기에 노출 된 조직에서 기록되었다. CS 노출은 섬모 박동 주파수의 감소와 관련이 : 주위에 관찰 강한 피크를노출 노출 된 가짜 및 이전 4 Hz로는 CS 노출 (그림 3) 이후 더 이상 관찰되지 않는다. 이 감소 된 주파수는 점액과 감염원 (22)를 제거 덜 효율적 치는 속눈썹을 만들 것입니다. 봉사자 및 CYP1A1 / 1B1 활동의 측정 봉사자는 조직이 여전히 기능에 마지막 노출 후 48 시간을 측정 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, CYP1A1 / 1B1 활성은 노출 종료 후 48 시간을 측정 하였다. CS에 노출 된 조직에서 티에르 값이 크게 차이가 없었다 연기의 더 큰 세포 독성 효과가 있다는 것을 확인하는 공기에 노출 된 조직에 비해 이 농도. 48 시간 후 - 노출에서, 조직의 CYP1A1 / 1B1 활동은 약간 노출 (그림 4) 다음과 같은 조직의 방어 메커니즘의 완만 한 증가를 나타내는 증가 하였다. 유전자 발현 양상 및 네트워크 기반 시스템 양방향ology 접근법 생체이 대사의 변화에​​ CS 노출의 영향을 연구 조직을 48 시간 노출 후 시점에서 수집 하였다. 이어서, 마이크로 어레이 분석은 유전자 발현 프로필 및 CS- 공기에 노출 된 조직을 생성하기 위해 수행 하였다. 생체 이물 대사에 CS 노출의 영향은 유전자 발현 양상에서 활용 네트워크 기반 시스템 생물학 접근 방식을 사용하여 조사하고로 이전 (15) 보도했다. 네트워크 기반 시스템 생물학 접근 방식을 사용하여 생체 이물 대사 네트워크 모델의 백본 노드의 수준에서 CS 노출에 영향을 멋지게 (그림 5) 시험 관내 사이 및 생체 데이터 세트의 상관 관계를 보여줍니다. 대조적으로, 각각의 유전자 발현 변화의 차원에서, 열악한 상관 관계 관내 (대 비 흡연자가 흡연) 및 생체 내 (공기에 노출 된 노출 대 CS) 사이에서 관찰되었다. 의 Organotypic 기관지 조직 모델 CS의 반복 노출의 그림 1. 도식 절차 약어 :. CYP, 사이토 크롬 P450s; CS, 담배 연기, 봉사자, transepithelial 전기 저항. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" /> 도 2의 Organotypic 비강 기관지 상피 조직 배양 모델. 만화 공기 - 액체 계면에서 기관지 (A)와 코 (B) 조직 배양 삽입물을 도시. 이전 15보고 체외 모델은 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 된 세포의 꼭대기 층에 표시된 섬 모세포 (기관지에 대한 C, 비강 용 D)를 포함. 모델은 중요 아세포와 공동 배양 하였다<html> 성장 및 상피 세포의 분화를 위해 (화살표로 표시). 기도 혈통 마커의 얼룩 : 이전에 15보고 P63 (코 기관지에 대한 E, F)와 MUC5AC (기관지에 대한 G는 코에 대한 H)가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" /> 그림 3. 섬모 치는 주파수. 섬모 박동 주파수 (CBF)는 전 및 노출 후 공기에 노출과 문화 측정 하였다. CBF는 CS 노출 후 본 낮게 나타났다 (두 삽입 대표 결과가 복제 1 (R1로 표시) 및 복제되는 2 (R2)). 광고 / 52325 / 52325fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. CYP1A1 / CYP1B1 활동과 봉사자의 측정. 왼쪽 pannels는 기관지 (A)과 코 (B) 조직 모델에서 CYP1A1 / CYP1B1 활동을 나타냅니다. 오른쪽 패널은 기관지 (C)과 코 (D) 조직 모델 티에르 측정을 나타낸다. SD ± 수단이 표시됩니다. 요약 : CS, 담배 연기, CYP 시토크롬 P450; 봉사자, transepithelial 전기 저항; RLU, 상대 luminescense 장치. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" /> 생체이 대사의 맥락에서 CS 노출의 영향 평가 그림 5. 네트워크 기반 시스템 생물학 방법. 유전자 발현 수준의 변화는 생체이 대사 네트워크 모델의 백본 노드의 활성화 (A)를 계산하는 데 사용 된 </<html> 강한&gt; 이전 게시 (15)에보고. 오른쪽 그림은 NPA 방식을 사용하여 &quot;차동 네트워크 백본 값」라고도 백본 노드의 정량의 개념을 도시한다. 청색 타원은 백본 노드의 활성을 나타낸다 (예., 기능 층) 및 녹색 공은 유전자의 발현을 나타낸다 (예., 전사 층). 의 Organotypic 기관지 조직에서 CS 노출의 영향 GSE16008 (노출 후의 48 시간에서 하 비갑개를 burshing에 의해 기관지와 코 점막 상피에 의해 수집 된 인간 기관지 상피에 흡연의 것과 비교 하였다 (체외은 공기에 노출이 대 CS는 노출) ) (생체, 흡연자 대 비 흡연자의) (B). 인 세트는, 유전자 발현의 상관 관계는 시험 관내 및 생체 내 사이에 데이터 셋 변경한다. 요약 : CS, 담배 연기, NPA 네트워크 교란 진폭.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 프로토콜의 목적은 인체 유기형 3D 기관지 및 코 조직 모델을 공기-액체 계면에서 주류 담배 연기(CS)에 노출시키는 것입니다. 그런 다음 시토크롬 P450 활성 분석, 섬모 박동 측정 및 시스템 생물학 접근 방식을 사용하여 CS가 조직에 미치는 영향을 조사합니다.

전체 담배 연기에의 Organotypic 3D 기관지와 코 조직 문화 모델의 반복 노출의 영향 평가

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

이 절차의 전반적인 목표는 Organotypic 3D 기관지 및 코 조직 배양 모델이 전체 담배 연기에 반복적으로 노출될 경우 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 공기 액체 계면에서 기관지, 기관지 및 비강 조직 배양 모델을 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 흡연 기계로 에어로졸을 생성하고 실험 설계에 따라 조직 배양물을 노출 시스템에서 노출시키는 것입니다.다음으로, 배양의 섬모 박동 빈도와 조직 무결성을 측정하여 노출 영향을 평가합니다. 마지막 단계는 마이크로어레이 기술을 사용하여 에어로졸에 의해 유도된 전사체 교환을 측정하는 것입니다. 궁극적으로, 네트워크 기반 시스템 생물학 접근 방식은 전체 담배 연기가 조직 배양에 미치는 영향을 보여주는 데 사용됩니다.호흡기 독성학에서 기존 방법의 이러한 기술의 주요 장점은 이러한 접근 방식이 동물 실험에 대한 대안을 찾기 위한 규제 기관의 요구 사항과 일치하며, 인간의 호흡기에서 발생하는 조건을 모방하여 비액체 계면에서 성장한 세포에 대한 단기 담배 연기 노출의 영향을 평가할 수 있다는 것입니다. 실험을 시작하려면 0.7ml의 예열 배양 배지를 멸균 24웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 다음으로, 조직 포장을 제거하고 조직 배양 삽입물을 새로 준비된 24웰 플레이트로 옮깁니다.인큐베이터에서 조직 배양을 유지하고 배지 교체 기간 동안 이틀에 한 번씩 배지를 교체합니다. 광학 현미경으로 조직을 검사하여 오염이 없고 매체 누출이 없는지 확인합니다. 노출 실험 3일 전에 200마이크로리터의 배양 배지로 조직 배양물의 정점 면을 세척합니다.다음으로, 체외 시스템의 기후 챔버와 배양 기본 모듈을 섭씨 37도로 예열합니다. 예열된 후 배양 기본 모듈에 행당 17.5ml의 미디어를 채웁니다. 인큐베이터에서 조직을 제거하고 배양 플레이트에서 조직 배양 삽입물을 체외 노출 시스템의 배양 베이스 모듈로 옮깁니다.그런 다음 재배 기본 모듈을 유리 뚜껑으로 덮습니다. 주류 담배 연기 또는 cs에 노출시키기 위해 조직을 기후 챔버로 옮깁니다. 보정된 30포트 캐러셀 흡연기를 사용하여 담배 연기를 생성합니다.담배를 표준으로 피우되 길이는 55밀리리터에서 약 35밀리미터입니다. 2초에 걸쳐, 1분에 2회, 8초의 펌프 배기 시간에 걸쳐 퍼프합니다. 발생하는 주류 담배 연기는 축적되어 체외 노출 시스템으로 방출됩니다.6-7분 동안 조직을 노출시킨다. 조직을 배양 플레이트에 다시 옮긴 후 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 인큐베이터에서 조직 배양 플레이트를 제거하고 CLIA 박동을 안정화하기 위해 실온에서 30분 동안 후드 아래에 둡니다.안정화 후 cliometrics 소프트웨어에 연결된 광학 현미경으로 조직을 관찰합니다. 다음으로, 섬모 박동의 빈도를 기록하고 1 분, 48 시간 동안 3 초마다 주파수를 측정합니다. 노출 후 인간 기관지 상피 조직의 정점 쪽에 200마이크로리터의 배양 배지를 첨가하고 조직을 건드리지 않고 조직 배양의 정점 쪽에 새로 추가된 배지에 젓가락 전극을 삽입하여 조직 저항을 측정합니다.측정 후 진공 펌프에 연결된 페이스트 피펫을 사용하여 조직 배양의 정점 쪽에서 배지를 부드럽게 제거하고 조직을 인큐베이터로 되돌립니다. 사이토크롬 P four 50 효소 활성을 측정하려면 이전에 준비된 Lucifer 및 CEE 기질로 새 플레이트를 준비하고 삽입물을 해당 플레이트 커버로 옮기고 조직 삽입물을 밤새 배양합니다. 배양 후 각 조직 삽입물에서 50마이크로리터의 배양 배지를 실온에서 96웰 불투명 백색 광도계 플레이트로 옮깁니다.그런 다음 각 웰에 50마이크로리터의 루시퍼 검출 시약을 추가하고 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 광도계로 발광을 측정합니다. 인큐베이터에서 3D 조직형 조직 삽입물 플레이트를 수집하고 플레이트의 각 삽입물을 차가운 PBS로 세 번 세척하고 세척 사이에 과거 피펫으로 PBS를 흡인합니다.마지막 세척 후 PBS를 흡입하고 인서트가 건조되지 않도록 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 멤브레인이 블레이드에 평평하게 놓일 때까지 플레이트에서 각 인서트에 대한 인서트 멤브레인을 잘라냅니다. 블레이드에서 균질화 튜브로 조직을 옮기고 튜브의 뚜껑을 조입니다.그런 다음 흔들고 소용돌이치게 하여 드라이아이스에 올려 놓습니다. 균질화 기기로 샘플을 해동하고 분쇄합니다., 45초 동안 000RPM에서 균질화 기기. 실온에서 5분 동안 그대로 두었다가 샘플에 클로로포름 140마이크로리터를 넣고 다시 15초 동안 와동시킵니다.균질화 튜브에서 위상 고정 튜브로 전체 샘플을 이송합니다. 써모 쉐이커에 올려 놓고 실온에서 1400RPM으로 2분 동안 흔듭니다. 그런 다음 실온에서 2분 동안 그대로 두십시오.일단 동요가 완전하면, 12, 000 G.Transfer에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 관을 새로운 2 밀리리터 관으로 상층액을 회전시키십시오. RNA 침전 세척, 현탁액 및 정제를 따릅니다. 추출이 완료되면 RNA의 품질을 검사합니다.수량과 무결성을 평가하기 위해 액체 취급 시스템과 타겟 합성을 준비합니다. 추출된 RNA를 놓습니다. 플레이트와 필요한 모든 시약 및 실험실은 로봇에서 마모됩니다.먼저 RNA 농도가 정규화됩니다. 그런 다음 증폭에서 라벨링, 정제 및 단편화에 이르는 다음 단계를 위해 데크가 변경됩니다. 다음으로, 혼성화 혼합물을 단편화되고 표지된 A RNA의 33마이크로리터에 첨가하여 샘플을 변성시키고 200마이크로리터의 사전 혼성화로 어레이를 사전 적십니다.하이브리드화 세척 및 얼룩 키트에서 혼합하십시오. 그런 다음 섭씨 45도, 60RPM으로 설정된 하이브리드화 오븐에 칩을 10분 동안 넣습니다. 사전 혼성화 완충액을 제거하고 200마이크로리터의 샘플을 로드합니다.오븐에서 섭씨 45도, 분당 60회전수에서 16시간 동안 어레이를 배양합니다. 칩에서 칵테일을 흡입하고 마이크로어레이에 250마이크로리터의 세척 완충액을 채웁니다. 소프트웨어를 열고 소프트웨어 메뉴 표시줄에서 fluidics를 실행합니다.관심 모듈과 각 모듈에 대한 prime four 50 프로그램을 선택합니다. 칩의 바코드를 스캔하여 각 모듈에 올바른 칩을 할당하고 칩을 유체 시스템에 배치합니다. 마지막으로 스캐너가 따뜻한지 확인합니다.그런 다음 칩을 스캐너의 자동 로더에 로드하고 마이크로어레이를 스캔합니다. 비강 조직의 CELIA 박동 빈도 또는 CBF는 공기, 담배 연기 또는 cs에 노출되기 전과 후에 측정되었습니다. CBF와 코 조직은 cs에 노출된 후 느려졌습니다.CLIA의 박동 빈도가 낮으면 점액 및 감염원을 제거하는 효율성이 떨어집니다. 기관, 기관지 및 코 조직 모델에서 CS 노출의 영향을 연구하기 위해 마이크로어레이 분석이 수행되었습니다. 노출 후 48시간.이러한 체외 CS 영향은 기관지경 검사와 코 상피 칫솔질로 각각 채취한 인간 기관지 상피 조직에 대한 흡연의 영향과 비교되었습니다. 네트워크 기반 시스템 생물학은 in vivo 및 in vitro 데이터 세트의 백본 노드 간에 양의 상관 관계를 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 이것이 새로 개발 중인 연구 분야라는 것을 기억하는 것이 중요합니다.한쪽에는 두 가지 핵심 구성 요소가 있는데, 하나는 잘 특성화된 유료 에어로졸 노출 플랫폼이고, 다른 한쪽에는 특정 구조, 생화학적 및 기계적 단서, 조직 또는 표적 기관과 관련된 미세환경의 세포 세포 상호 작용을 가장 잘 모방하는 3차원 조직 배양 모델로 구성될 수 있는 관련 실험 시스템이 있습니다. 조사 중입니다.

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