화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

이 절차의 전반적인 목표는 인간 배아 줄기 세포 및 전사체 연구를 기반으로 하는 두 가지 체외 발달 독성 테스트 시스템을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 배아 섬유아세포에서 인간 배아 줄기세포를 배양함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 인간 배아 줄기 세포가 세 가지 배아층의 세포를 모두 생성할 수 있는 배아체를 형성하도록 하거나 신경외배엽 전구세포로 분화

다음으로, 배아체 또는 신경외배엽 전구세포는 분화 중에 다른 농도의 관심 화합물로 처리됩니다. 마지막 단계는 세포의 생존력을 평가하고 RNA를 분리하는 것입니다. 궁극적으로 전사체 마이크로어레이 분석을 사용하여 처리되지 않은 대조 세포와 비교하여 관심 화합물로 처리된 세포의 RNA 발현 변화를 보여줍니다.인간 네오닉 줄기 세포 및 DNA 매크로 영역을 기반으로 인간 관련 발달 독성 효과를 모니터링할 수 있는 in vitro 방법론을 확립했습니다.

이 방법론은 제약 및 화학 산업에서 잠재적인 약물 및 환경 독성 물질의 안전성 검사를 위해 적용할 수 있습니다. 이 방법은 매우 초기 신경 발달에 대한 화학 물질의 영향과 같은 발달 독성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 실온에서 줄기세포 배지 보충제를 해동하고 400ml의 기초 줄기세포 배지에 100ml를 추가합니다.

다음으로, 기저막 매트릭스를 얼음에서 해동한 다음 보충된 부피의 매트릭스를 24ml의 냉각된 dmm에 추가합니다. 제조업체가 권장하는 F 12 기초 배지는 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합한 다음 혼합물 2ml를 12개의 별도의 6cm 플레이트에 첨가합니다. 매트릭스가 플레이트를 코팅하는 동안 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 배지를 제거하고 2ml의 줄기 세포 배지를 추가합니다. 다음으로, 인간 배아가 들어 있는 인큐베이터에서 4개의 합류 플레이트를 제거합니다. 입체경 하에서 동반된 intext 프로토콜에 설명된 대로 준비된 마우스 배아 섬유아세포 공급층에서 자란 9개의 세포를 1밀리리터 피펫 팁을 사용하고 플레이트에서 분화된 콜로니를 제거합니다.

미분화 군체는 경계가 잘 정의되어 있고 세포가 조밀한 반면, 분화된 세포는 경계에서 증식을 시작하고 세포의 크기가 더 큽니다. 배지를 흡입하고 4ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 2ml의 줄기 세포 배지를 입체경의 8과 함께 추가합니다.

26 게이지 바늘로 군체를 각각 6-9 조각으로 자르고 1 밀리리터 피펫 팁으로 덩어리를 긁어냅니다. 자른 집락을 50ml 매 튜브에 부드럽게 모아 200G에서 5분 동안 펠릿으로 만듭니다. 다음으로, 스내트를 흡인하고 12ml의 줄기세포 배지에 세포를 재현탁합니다.

20마이크로리터의 세포 현탁액을 유리 슬라이드에 놓고 현미경으로 덩어리의 수를 세십시오. 현탁액의 농도를 밀리리터당 150 덩어리로 조정한 다음 각 6cm 플레이트에 2밀리리터의 현탁액을 추가합니다. 플레이트를 앞뒤로 그리고 좌우로 움직여 세포를 균일하게 분포시킨 다음 격일로 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.

배지를 조심스럽게 교체하십시오 분화된 콜로니를 제거한 후 Vbo 96 웰 플레이트의 각 웰에 40마이크로리터의 멸균 5% 블록 공중합체 용액을 추가하고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 콜로니가 포함된 컨웰링 플레이트를 제거하고 1ml 피펫 팁으로 실체 현미경으로 차별화된 콜로니를 골라냅니다. 그런 다음 플레이트에서 배지를 흡인하고 4ml의 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.

다음으로, 각 플레이트에 2밀리리터의 무작위 분화 배지를 추가합니다. 통로 도구를 사용하여 H 9개의 세포 군체를 균일한 크기의 덩어리로 자릅니다. 세포 스크레이퍼로 덩어리를 긁어내고 50ml 팔콘 튜브 원심분리기에 부드럽게 모읍니다.

콜로니는 5분 동안 200G으로 뭉친 다음 스내트를 흡인하고 세포와 무작위 분화 배지를 밀리리터당 1000 덩어리로 재현탁합니다. 다음으로, 멀티 채널 피펫의 도움으로 V 바닥 96 웰 플레이트에서 블록 공중 합체를 흡인하고, 100 마이크로 리터의 콜로니 현탁액을 각 웰에 첨가하고, 400 G에서 4 분 동안 섭씨 4도에서 플레이트를 원심 분리하여 V 자형 웰의 바닥에 덩어리를 응집시킨 다음 더 넓은 보어 200 마이크로 리터 팁을 사용하여 4 일 동안 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 96웰 플레이트에서 배아체를 제거하고 멸균 122mm 정사각형 플레이트에 넣습니다.

다음으로, 10ml 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 배아체를 정사각형 플레이트에서 15ml 매 튜브로 옮깁니다. 배아체를 2분 동안 가라앉힌 다음 스내트를 흡인하고 5ml의 PBS로 배아체를 세척합니다. 다시 말하지만, 배아체가 2분 동안 가라앉을 때까지 기다린 다음 상층액을 흡인합니다.

이번에는 배아체를 5ml의 무작위 분화 배지에 재현탁합니다. 다음으로, 배아체를 10cm 세균 플레이트로 옮기고 10ml의 무작위 분화를 추가합니다. 보통. 수평 셰이커에서 섭씨 37도와 5%CO2에서 플레이트를 배양합니다.

50RPM에서 대표 배아체는 5일, 9일 및 14일에 대해 표시됩니다. 격일로 매체를 조심스럽게 교체하여 15ml를 모두 새로운 무작위 분화로 교체하십시오. 보통. 분화에 대한 약물 효과를 평가하려면 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 10일 동안 5일째에 배지에 약물을 추가하기 시작합니다.

멸균 피펫을 사용하여 10cm 플레이트의 배아체를 15mm 매 튜브에 모읍니다. 2분 동안 가라앉히도록 한 다음 상층액을 흡인합니다. 5ml의 PBS로 세척하고 뉴클레아제가 없는 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

그들이 정착하고 스내트 레이즈를 흡인할 수 있도록 하십시오. 1ml의 트리올 시약에 배아체를 현탁시키고 1밀리리터 주사기가 있는 24게이지 바늘에 용액을 약 15회 통과시켜 세포를 파괴합니다. 다음으로, 각 샘플에 200마이크로리터의 클로로포름을 추가합니다.

내용을 짧게 와동하고, 그 후에 12, 4 섭씨 온도에 15 분 동안 000 G에 표본을 분리기를 설치하고, 다른 층의 어떤 방해도 없이 1.5 밀리리터 관에 있는 상등액을 모으십시오. 그런 다음 식힌 70% 에탄올을 상층액에 같은 부피로 넣고 흔들어 내용물을 부드럽게 섞습니다. 혼합물 700마이크로리터를 미니 스핀 컬럼으로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 최종 용리 단계에서 RNA를 정제합니다.

22마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 스핀 컬럼에 바르고 1분 동안 12, 000G에서 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 수집 튜브를 제거하고 RNA를 얼음 위에 놓습니다. H 9개 세포의 합류 T 25 플라스크당 1ml의 예열 디스크 공간을 추가하고 섭씨 37도에서 9분 동안 플라스크를 배양합니다.

그런 다음 2ml의 예열을 추가합니다. 변위된 처리된 세포까지 배지를 세척하고 5ml 피펫으로 위아래로 5회 부드럽게 피펫팅합니다. 세포 용액을 매 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 플라스크를 9ml의 세척 매체로 세척하고 세포가 있는 튜브에 추가합니다. PT는 500 G.Then에 3 그리고 반 분 동안 그것의 세포를 snat를 제거하고 세척 매체의 10 밀리리터에 있는 세포를 resuspend합니다. 500G에서 3분 30초 동안 세포를 다시 PT한 다음 sup natant를 제거하고 세포를 4ml의 인간 배아 줄기 세포 배지에 재현탁시키고, 0.5ml의 세포 현탁액과 4.5ml의 신선한 배지를 유사분열적으로 비활성화된 마우스 배아 섬유아세포를 포함하는 신선한 PBS 세척 T 25 플라스크에 추가합니다.

매일 플라스크의 매체를 교체하십시오. 10cm 접시에 PBS에 0.1% 젤라틴을 바르고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하여 인간 배아 줄기 세포를 수확하고 세포가 분리되는 동안 T 25 플라스크에 1ml의 acuta를 추가합니다.

330마이크로리터의 동결된 기저막 매트릭스에 6.6ml의 저온 매체를 추가합니다. 40마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 여과하고 여과된 용액 1ml를 사용하여 6웰 플레이트의 각 웰을 덮습니다. 세포는 나중에 Accutane을 가진 인간적인 배아 세포의 30 분 배양 후에 입히는 판에 도금되고, Hess 매체의 1.5 밀리리터를 추가해서 반응을 멈춥니다.

플라스크에서 세포를 긁어낸 다음 8ml의 Hess 배지를 추가로 추가합니다. 40 마이크로 미터 세포 스트레이너를 통해 10 밀리리터 피펫 필터 세포로 상하 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 용액을 생성 한 다음 500 G에서 3 분 동안 세포를 원심 분리 한 다음 500 G에서 3 분 동안 S 상등액을 제거하고 10 밀리리터의 중간 스핀 셀에 세포를 다시 현탁 탁탁 한 다음 상등액과 reus를 제거합니다. 암석 억제제 Y 2 7 6 3 2 를 함유하는 Hess S 배지 10 밀리리터에 세포를 10 마이크로 몰의 최종 농도로 현탁시킨다.

다음으로, 젤라틴이 코팅된 접시 플레이트에서 상등액을 제거하고 젤라틴이 코팅된 접시의 세포 현탁액을 제거하고 섭씨 37도에서 정확히 1시간 동안 배양합니다. 이 단계에서 hypoplast는 인간 배아 줄기 세포가 자유롭게 유지되는 젤라틴 코팅 플레이트에 정착합니다. 부유 시간은 매우 중요한데, 긴 배양은 줄기세포의 뭉침을 초래하고, 짧은 배양은 섬유아세포가 부착되었을 때 이러한 섬유아세포 중 일부만 제거되기 때문입니다.

플레이트의 배지를 사용하여 플레이트에서 부착되지 않은 줄기 세포를 부드럽게 씻어냅니다. 10 밀리리터의 Hess 배지로 플레이트를 두 번째로 세척하고 세포를 풀링하고, 500 G에서 3 분 동안 세포를 원심 분리하고, 생성 된 S 상등액을 제거하고, 10 마이크로 몰의 암석 억제제 Y 2, 7, 6, 3, 2 및 섬유 아세포 성장 인자 2 밀리리터 당 10 나노 그램을 함유하는 약 4 밀리리터의 조절 배지에 세포를 재현탁시킵니다. 다음으로, 세포를 trian blue와 혼합하고 혈구 분석기 플레이트에서 계수합니다.

18, 지하실 전에 접시에 평방 센티미터 당 000 셀. 멤브레인 코팅된 플레이트는 웰당 1.5ml의 배지로 세포를 덮고 섭씨 37도와 5%의 이산화탄소에서 배양합니다. 24시간 후, 배지를 새로 고칩니다 24시간 후, 섬유아세포 성장 인자 2 72시간 당 밀리리터당 10나노그램만 보충된 배지를 신선한 컨디셔닝 배지로 변경합니다.

세포를 파종한 후 배지를 녹아웃 혈청 대체 배지로 변경합니다. 이 시점을 차별화의 0일이라고 합니다. 다음 3일 동안 매일 새로운 배지로 세포를 새로 고칩니다.

넷째 날과 다섯째 날에 매체를 바꿀 경우, 25%N 2개의 보충된 매체 및 75%의 녹아웃 혈청 보충으로 구성된 a를 추가하십시오. 6일째 되는 날에 배지는 분석을 위해 세포를 수확합니다. 배아체는 다양한 연구에 사용할 수 있습니다.

다음은 다양한 농도의 메틸 수은이 세포의 생존력에 미치는 영향을 보여주는 세포 독성 연구의 예입니다. 이 그래프에서 포인트 24 마이크로 몰은 10 % 세포 사멸을 일으키고 1.61 마이크로 몰의 농도는 14 일 동안 노출 된 후 50 % 세포 사멸을 유발하는 것으로 확인되었습니다. 3개의 메틸 수은 처리 그룹의 배아체에서 분리된 RNA는 다양한 바이오마커를 살펴보기 위해 마이크로어레이에서 실행되었습니다.

포인트 25 마이크로몰 수은에 노출된 사람들은 빨간색으로 표시됩니다. 1마이크로몰 메틸 수은에 노출된 사람들은 파란색으로 표시되고 대조 RNA는 녹색으로 표시됩니다. 이 주요 성분 분석 맵은 각 처리 그룹의 유전적 특성이 서로 크게 다르다는 것을 보여주며, 모두 276개 이상의 유전자가 1마이크로몰 농도의 메틸 수은에 노출되었을 때 2배 이상 변형되었음을 보여줍니다.

그 유전자 중 30개는 또한 25 마이크로몰 지점에서 저농도 그룹에 의해 변형되었습니다. 이 히트 맵에서 1개의 마이크로몰 치료 그룹에서 변형된 유전자 중 233개는 하향 조절된 유전자였고 43개만이 처리에 의해 상향 조절되었음을 알 수 있습니다. 트리아졸 또는 발달 개미와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 셉티 고글, 내화학성 손 장갑 착용 및 흄 후드에서 모든 트리올 관련 작업 수행과 같은 예방 조치를 항상 고려해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

이 절차를 따릅니다. 염색, 페로스 형성과 같은 다른 방법은 표현형 앵커링과 같은 추가 질문에 답하기 위해 튜브 형성을 혼합할 수 있습니다.