Name: 화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 28 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기세포를 이용한 발생 독성 시험 시스템으로 화학 물질 안전성을 평가하는 방법을. 이 기법은 전사체 분석을 통해 인간 관련 독성 효과를 모니터링하고 동물 실험을 줄이는 데 기여합니다.

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탁월한 기술 지원을 제공해 주신 M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani 및 Cornelia Böttinger에게 감사드립니다. 이 연구는 독일연구재단(RTG 1331)과 독일연구부(BMBF)의 보조금으로 지원되었습니다.

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<li>Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: 
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<li>Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: 
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<li>Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1">http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1</a> (2014).</li>
<li>Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: 
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독성 시험에 대한 전통적인 접근법에 따라서 테스트 비용과 시간이 많이 소요하게 광범위한 동물 연구를 포함한다. 또한, 종간의 차이로 인해 전임상 동물 안전 연구는 인간을위한 관련 잠재적 인 약물의 독성 효과를 예측하는 항상 유효하지 않습니다. 인간이 아닌 영장류, 가장 예측, 여전히 윤리적 강하고 socioeconomical 요구는 빠르게 체외 시험에 민감하고 강력한 개발하는 현대 사회에 의해 제기되고 있지만 인간의 안전과 관련된 시스템. 인간 배아 줄기 세포의 독특한 능력은 그러므로 약물 안전성 시험 6,21위한 전통적인 접근법에 대한 대안으로서 제안되었다 민감한 toxicogenomics 접근법과 조합하여 생체 내 인간 발달 과정 recapitulating 모든 체세포 형태로 분화한다. &#39;ESNATS&#39;프로젝트 아래 &#39;UKK&#39;테스트 시스템을 예측하기 위해 개발 된transcr...

다양한 유형의 세포로 분화하는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)의 능력은 시험 관내 독성 시험 한 질병 모델링 및 재생 의학 (2)의 새로운 시대를 열었다. 줄기 세포는 자기 복제 할 수있는 능력, 자신의 만능 상태를 유지하고, 전문 세포 3,4로 분화에 부여된다. hESC의의 특성 또한 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSC) 또는 핵 이식 (5)에 의해 생성 된 세포와 같은 다른 사람 다 능성 줄기 세포에서 발견되는 (용량은 모든 주요 세포 타입을 구별하기 위해). 예를 들어, 많은 다른 hESC의 라인은 세포 (13, 14)과 같은 신경 (6), 신장 세포 (7), 신경 능선 세포 (8), 심근 9-12, 또는 간세포로 분화되었다. 또한, hESC의 자발적 배아 체 (사채) (19, 20)의 세 가지 배엽 15 ~ 18의 세포로 분화 할 수 있습니다. 전자아 흘리 배아 개발은 마이크로 어레이 기술 (15)를 사용하여 transcriptomics하여 mRNA의 수준에서 포착 된 다른 배엽과 관련된 다양한 유전자의 발현에 의해 조절된다. 이러한 노력은 hESC의 / hiPSC 및 transcriptomics 분석 (검토를 위해 21, 22 참조)를 기반으로 장기 특정 독성 모델의 설립 귀착되었다. 이러한 모델은 실험 동물은 항상 인간의 안전을 예측하지 않습니다 사용하여 전임상 연구 등의 독성 연구를위한 실험 동물의 전통적인 사용에 장점을 가지고있다. 환자에서 발생하는 약물에 의한 부작용은 종종 인간과 실험 동물 사이에 차이가 신진 대사 또는 신호 처리와 관련이 있습니다. 종의 차이는 인간에서 발생 독성의 안정적인 조기 발견을 방지하고 있으며, 이러한 탈리도마이드 (23, 24) 및 디 에틸 25, 26 등의 인스턴스 의약품으로 인한 기형으로 시장에서 철수했다. Thalidomide 쥐 또는 마우스의 모든 발생 독성을 표시하지 않았습니다. 메틸 수은 (27) 등의 환경 화학 물질은 다양한 종류의 신경계에 대한 태아 발생 독성에 나 섰으나 인간의 표현은 동물 모델 어려운되었습니다. 종 특이성 문제의 문제를 해결하기 위해, 다른 프로젝트에서 일하는 과학자 등으로 의심되는 인간의 독성 물질을 사용하여 배아 독성, 신경 독성, 심독성, 간독성 및 신 독성에 대해 서로 다른 모델의 개발에 종사하는 ReProTect, ESNATS 형사 같은 줄기 세포를 기반으로 인간에 ​​영향을 미친다. 유럽​​ 컨소시엄 프로젝트 &#39;배아 줄기 세포 기반 소설 대체 시험 전략 (ESNATS)&#39;에서 다섯 테스트 시스템이 설정되어있는 것. 하나의 테스트 시스템 소위 UKK (U niversitäts K linikum K OLN) 테스트 시스템은 부분적 초기 인간 배아 발달을 캡처한다. 이 S에서템 인간 배아 H9 세포는 세 배엽 (외배엽, 내배엽과 중배엽) 15 배엽 특정 서명 어피 메트릭스 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여 프로파일 transcriptomics에 의해 포착 된 것으로 차별화된다. 탈리도마이드 (28), 발 프로 산, 메틸 수은 16,17 또는 시토신 아라 비노 시드 (15)과 같은 다양한 발달 독성 물질이 시스템에서 테스트되었고, 독성 특정 유전자 서명은 얻어졌다. 제 2 테스트 시스템에서, 테스트 시스템이므로 1 UKN1 (K onsta N Z의 U의 niversity)라고 H9 세포를 6 일 동안 신경 외배엽 전구 세포 (NEP)로 분화된다. 이는 같은 PAX6와의 Otx2 같은 신경 유전자 마커의 높은 발현에 의해 입증된다. 분화 동안 육일을 위해, NEP 세포는 이러한 VPA, 메틸 수은과 같은 발달 신경 독성 물질에 노출되어있다. 독성 물질 별 탈 규제 transcriptomics 프로필 obtai되었습니다어피 메트릭스 마이크로 어레이 플랫폼 16,29를 사용하여뿐만 아니라 네드. 21 세기의 독성에 대한 새로운 비전은 테스트 시스템은 장기 독성 물질의 배양의 끝에 생체 내에서 조직 병리학, 또는 사체 변경과 같은 표현형 설명을 생성 할뿐만 아니라 것을 상상한다. 오히려 분석법 기계론 3 정보를 제공하고 있음이 정보는 소위에 매핑 될 수 있다는 것을 시사 불리한 결과 경로 (AOP) 유해 효과 (30)에 대한 과학적 근거를 제공 할 것이다. 그러한 정보를 제공하기 위해 적용된 테스트 시스템은 높은 품질의 강력한 표준 작업 절차 문서화 인스턴스로서, 31으로 제어되어야한다. 또한, 시간에 따른 변화는 높은 해상도로 매핑 할 필요가있다. 이 동기화 변경 32 테스트 시스템을 필요로한다. 여기에 설명 된 UKN1 및 UKK 테스트 시스템은 이러한 요구 사항에 최적화되어있다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>11320082 Dulbecco의 Modified Eagle 배지:영양 혼합물 F-12</td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>10828028 녹아웃 세럼 교체</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>GlutaMAX 보충제</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>MEM 비필수 아미노산 솔루션</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-0144</td><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수, 칼슘 없음, 마그네슘</td></tr><tr><td>mTeSR 매체</td><td>없음 Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>V 바닥 판</td><td>VWR</td><td>734-0483</td><td>플레이트, Microwell, V BTTM, 96 Well, 멸균 1 * 50 ST</td></tr><tr><td>V 바닥 플레이트 뚜껑</td><td>VWR</td><td>634-0011</td><td>뚜껑, Microtitre 플레이트, Cond. 링 1 * 50 ST</td></tr><tr><td>펜/스트렙</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>15140-122</td><td>페니실린-스트렙토마이신, 액체</td></tr><tr><td>증류수</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>15230-089.</td><td>멸균 증류수</td></tr><tr><td>인간 FGF-2 (bFGF)</td> <td>Millipore</td><td>GF003AF-100UG</td><td>섬유 아세포 성장 인자 기본, 인간 재조합, 동물 무료</td></tr><tr><td>필터 0.22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>Stericup-GP, 0.22 &mu; m, 폴리에테르설폰, 250ml, 방사선 멸균</td></tr><tr><td>StemPro EZPassageTM Disposablte</td><td>Invitrogen</td><td>23181010</td><td></td></tr><tr><td>BD MatrigelTM, hESC 인증 Matrix</td><td>Stemcell Technologies</td><td>354277</td><td>5ml 바이알</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater 안정화 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td>이는 동결되지 않은 샘플에서 RNA 무결성을 안정화하고 보호합니다.</td></tr><tr><td>70 &뮤; m 세포 여과기</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>70 &mu를 가진 세포 여과기; m 나일론 메쉬</td></tr><tr><td>35 &mu; m 뚜껑 셀 여과기, 5&nbsp; ml 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>5ml 폴리스티렌 라운드 바닥 테스트 튜브, 셀 스트레이너 캡 (35&nbsp; &뮤; m)</td></tr><tr><td>50ml 멸균 폴리프로필렌 튜브</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>50ml 폴리프로필렌 튜브(원뿔형 바닥 포함), 멸균</td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>CELLSTAR 필터 캡 세포 배양 75cm2 플라스크</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>10296010</td><td></td></tr><tr><td>96웰 광학 바닥 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Blue</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>Apotransferin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>LS002104</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스</td><td>기브코 인비트로젠</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco 인비트로젠</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 DMEM</td><td>기브코 Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R & D Systems</td><td>719-NG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom AG</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 Y-27632</td><td>Tocris Biosciences</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris Biosciences</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>셀레늄</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-5261</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td colspan="4">List of Kits</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit</td><td>Affymetrix</td><td>900721, 22, 23</td><td>이 키트는 마이크로어레이의 혼성화 세척 및 염색에 필요한 모든 시약을 제공합니다.</td></tr><tr><td>Rnase-Free DNase 세트</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">장비 목록</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX71</td></tr><tr><td>Genechip Hybridization Oven - 645</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genechip Fluidics Station-450</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix 유전자 칩 스캐너-3000-7 G</td><td>Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M5</td><td>분자 장치</td><td></td><td> &#160; &#160; &#160;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">List of softwares</td></tr><tr><td>Prism 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GCOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Partek Genomic Suite 6.25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>기능 주석을 위한 온라인 도구 DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

-omics 기술이 잠재적 인 약물의 체외 독성 시험에 대한 새로운 지평을 열어 효율적인 프로토콜은 조합의 다양한 조직으로 인간 만능 줄기 세포를 구별한다. 이러한 분석 용 고체 과학적 근거를 제공하기 위해서는, 현상시 코스 및 시스템 생물학 방법에 의해, 기본 규제 메커니즘 정량적 정보를 얻기 위해 중요하다. 두 분석 따라서 이러한 요구 사항 여기를 조정하고있다. UKK 테스트 시스템에있어서, 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) (또는 다른 다 능성 세포) 자발적 세 배엽 세포의 생성을 허용하도록, 배아 체에서 14 일 동안 분화하도록 남겨진다. 이 시스템은 초기 인간 배아 발달의 주요 단계를 되풀이되었습니다, 세포가 분화하는 동안 화학 물질에 노출 될 경우는, 인간 고유의 초기 배아 독성 / 기형을 예측할 수있다. UKN1 테스트 시스템의 populat에 ​​hESC의 미분에 기초신경 외배엽 전구 이온 (NEP) 육일에 대한 세포. 이 시스템은 초기 신경 발달을 되풀이되었습니다 초기 발달 신경 독성 및 화학 물질에 의해 유발 후생 유전 학적 변화를 예측한다. 두 시스템은, 전 사체 마이크로 어레이 연구와 함께, 생체 독성을 확인하기에 적합하다. 또한, 이들은 시스템 생물학 분석 입력 데이터를 생성하도록 조합하여 사용될 수있다. 이 테스트 시스템은 동물의 대용량을 필요로하는 기존의 독성 연구에 비해 많은 장점을 갖는다. 테스트 시스템은 약물 개발 및 화학적 안전성 평가를위한 비용의 절감에 기여할 수있다. 이들의 조합은 특히 특별히 신경 발달에 영향을 미칠 수있는 화합물에 빛을 비춰.

UKK 테스트 시스템 중의 메틸 수은 노출 세포 독성 분석은 IC 10 값 메틸 수은의 세포 독성 (10 % 가능성의 감소) (도 1)를 얻었다 H9 EB를 행 하였다. 우리는 또한 마이크로 어레이 기반 (어피 메트릭스 플랫폼) 바이오 마커 연구를 시행 하였다. H9 사채는 14 일 동안 메틸 수은 (0.25 및 1 μM)에 노출되어있다. 14 일째에, 샘플 TRIZOL를 사용하여 수집되었고,이 RNA를 분리 하였다. 전사 프로파일 링은 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 칩을 사용하여 수행 하였다. 데이터는 PARTEK 게놈 스위트 TM 6.6로 분석되고있다. 첫 번째 데이터 개요는 주성분 분석 (도 2A), 벤 다이어그램의 생성 (도 2b)과 히트 맵의 구성 (도 2c)에 의해 수득 하였다. 주성분 분석은 유...

프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 및 사체 연구에 기초하여 두 개의 시험관 발생 독성 시험 시스템 (UKK 및 UKN1)를 설명한다. 테스트 시스템은 인간 발생 독성 위험을 예측하고, 동물 연구, 비용 및 화학 물질의 안전성 검사에 필요한 시간을 단축에 기여할 수있다.

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

이 절차의 전반적인 목적은 인간 배아줄기세포와 전사체 연구를 기반으로 한 두 가지 인 비트로(in vitro) 발달 독성 시험 시스템을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 생쥐 배아 섬유아세포 상에서 인간 배아줄기세포를 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 인간 배아줄기세포가 세 가지 배엽의 모든 세포를 생성할 수 있는 배아체(Embryoid bodies)를 형성하도록 하거나, 이를 신경외배엽 전구세포로 분화시키는 것입니다.다음으로, 분화 과정 중에 배아체 또는 신경외배엽 전구세포를 다양한 농도의 관심 화합물로 처리합니다. 마지막 단계는 세포의 생존력을 평가하고 RNA를 분리하는 것입니다. 최종적으로 전사체 마이크로어레이 분석을 사용하여, 관심 화합물로 처리된 세포의 RNA 발현 변화를 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하여 나타냅니다. 인간 신세포 및 DNA 매크로 영역을 기반으로, 우리는 인간과 관련이 있는 발달 독성 효과를 모니터링할 수 있는 인비트로(in vitro) 방법론을 구축하였습니다.이 방법론은 제약 및 화학 산업에서 잠재적 약물과 환경 독성 물질의 안전성 스크리닝에 적용될 수 있습니다. 이 방법은 화학 물질이 매우 초기 단계의 신경 발달에 미치는 영향과 같이, 발달 독성 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 먼저, 실온에서 줄기세포 배지 보충제를 해동한 후, 기초 줄기세포 배지 400 milliliters에 보충제 100 milliliters를 첨가하십시오.다음으로, 얼음 위에서 기저막 매트릭스를 해동한 후, 제조사의 권장 사항에 따라 보충된 부피의 매트릭스를 24 mL의 냉각된 dmm. F 12 기초 배지에 첨가하십시오. 피펫팅으로 부드럽게 위아래로 섞어 용액을 만든 다음, 이 혼합액 2 mL를 12개의 개별적인 6 cm 플레이트에 각각 넣으십시오. 매트릭스가 플레이트에 코팅될 수 있도록 플레이트를 상온에서 1시간 동안 배양하십시오.그런 다음 배지를 제거하고 줄기세포 배지 2 mL를 첨가합니다. 다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비된 마우스 배아 섬유아세포 피더 층에서 배양된 인간 배아 H9 세포가 포함된 컨플루언트 플레이트 4개를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 실체 현미경 하에서 1 mL 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 분화된 콜로니를 제거합니다.미분화 콜로니는 경계가 뚜렷하고 세포가 조밀한 반면, 분화된 세포는 경계로부터 퍼져 나가기 시작하며 세포의 크기가 더 큽니다. 배지를 흡입하여 제거하고 4 mL의 PBS로 세포를 세척하십시오. 그 후, 실체현미경 하에서 줄기세포 배지 2 mL를 첨가합니다.26 gauge 바늘을 사용하여 콜로니를 각각 6~9조각으로 자르고, 1 mL 피펫 팁으로 덩어리를 긁어냅니다. 잘린 콜로니를 50 mL falcon tube에 조심스럽게 수집한 후 200 G에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 이어서 상층액을 흡입하여 제거하고 12 mL의 줄기세포 배지에서 세포를 재부유시킵니다.세포 현탁액 20 µL를 유리 슬라이드 위에 떨어뜨리고 현미경으로 응집체의 수를 측정합니다. 현탁액의 농도를 mL당 150개 응집체가 되도록 조절한 후, 각 6 cm 플레이트에 현탁액 2 mL를 첨가합니다. 플레이트를 전후좌우로 흔들어 세포를 균일하게 분산시킨 다음, 세포 배양 인큐베이터에서 이틀 간격으로 플레이트를 배양합니다.배지를 조심스럽게 교체합니다. 분화된 콜로니를 제거한 후, Vbo 96웰 플레이트의 각 웰에 멸균된 5% 블록 공중합체 용액 40 µL를 첨가하고 상온에서 45분 동안 배양합니다. 콜로니가 confluence 상태인 플레이트를 배양기에서 꺼내 스테레오 현미경 하에서 1 mL 피펫 팁으로 분화된 콜로니를 채취합니다. 그 다음 플레이트에서 배지를 흡입하여 제거하고 4 mL의 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다.다음으로, 각 플레이트에 random differentiation medium 2 mL를 추가합니다. passage tool을 사용하여 H9 세포 콜로니를 균일한 크기의 덩어리로 절단합니다. cell scraper로 덩어리를 긁어내어 50 mL falcon tube centrifuge에 조심스럽게 수집합니다.콜로니를 400 ×g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 흡입 제거하고 세포를 무작위 분화 배지에 1,000 clumps/mL 농도로 재부유합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 V-bottom 96-well 플레이트에서 블록 공중합체를 흡입 제거하고, 각 웰에 콜로니 현탁액 100 µL를 첨가합니다. 플레이트를 4 °C에서 4분 동안 400 ×g로 원심분리하여 V자형 웰 바닥에 클럼프를 응집시킵니다. 그 후 플레이트를 인큐베이터에 넣고 4일 동안 배양합니다. 와이드 보어 200 µL 팁을 사용하여 96-well 플레이트에서 배아체(embryoid bodies)를 옮겨 멸균된 122 mm 정사각형 플레이트에 넣습니다.다음으로, 10 milliliter 멸균 세롤로지컬 피펫을 사용하여 사각 플레이트에서 배아 본체를 15 milliliter 팔콘 튜브로 옮깁니다. 배아 본체가 가라앉을 때까지 2분 동안 기다린 후, 상층액을 흡입하여 제거하고 5 milliliter의 PBS로 배아 본체를 세척합니다. 다시 배아 본체가 가라앉을 때까지 2분 동안 기다린 후 상층액을 흡입하여 제거합니다.이번에는 배아체(embryo bodies)를 5 mL의 무작위 분화 배지에 다시 현탁합니다. 다음으로, 배아체를 10 cm 박테리아 플레이트로 옮기고 무작위 분화 배지 10 mL를 추가로 넣습니다. 플레이트를 수평 진탕기(horizontal shaker)에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양합니다.50 RPM에서 5일 차, 9일 차 및 14일 차의 대표적인 배아 본체가 나타나 있습니다. 격일로 배지를 조심스럽게 교체하며, 15 mL 전체를 새로운 무작위 분화 배지로 교체하십시오. 분화에 미치는 약물 효과를 평가하려면, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 5일 차부터 10일 동안 배지에 약물을 첨가하기 시작하십시오.멸균 피펫을 사용하여 10 centimeter 플레이트에서 배아 본체를 수집해 15 milliliter falcon 튜브에 담습니다. 2분 동안 가라앉힌 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 5 milliliter의 PBS로 세척한 후 nuclease free 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다.가라앉을 때까지 기다린 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 배아 본체를 1 mL의 triol 시약에 현탁시키고, 1 mL 주사기에 24게이지 바늘을 장착하여 용액을 약 15회 통과시켜 세포를 파쇄합니다. 다음으로, 각 시료에 200 µL의 클로로포름을 추가합니다.내용물을 짧게 볼텍싱한 후, 4°C에서 12,000 G로 15분 동안 샘플을 원심분리합니다. 다른 층이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 1.5 mL 튜브에 수집합니다. 그다음 상층액에 동일한 부피의 냉각된 70% ethanol을 첨가하고 흔들어 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 혼합액 700 µL를 미니 스핀 컬럼에 옮기고 제조사의 지침에 따라 최종 용출 단계에서 RNA를 정제합니다.스핀 컬럼에 nuclease free water 22 µL를 가하고 12,000 G에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 후 컬렉션 튜브를 제거하고 RNA를 얼음에 보관하십시오. confluent 상태의 T 25 플라스크당 H9 세포에 미리 데운 disc space 1 mL를 첨가하고, 플라스크를 37 °C에서 9분 동안 배양합니다.그런 다음 미리 데워둔 세척 배지 2 mL를 처리된 세포에 추가하고, 5 mL 피펫을 사용하여 부드럽게 5회 파이펫팅합니다. 이후 세포 현탁액을 팔콘 튜브로 옮깁니다.다음으로, 플라스크를 9 mL의 세척 배지로 세척한 후 이를 세포가 들어 있는 튜브에 추가합니다. 500 G에서 3분 30초 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다. 그 후 상층액을 제거하고 세포를 10 mL의 세척 배지에 재현탁합니다. 세포를 다시 500 G에서 3분 30초 동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 세포를 4 mL의 인간 배아줄기세포 배지에 재현탁합니다. 세포 현탁액 0.5 mL와 신선한 배지 4.5 mL를 유사분열이 억제된 마우스 배아 섬유아세포가 포함된 PBS 세척된 새로운 T 25 플라스크에 추가합니다.플라스크의 배지를 매일 교체하십시오. 10 cm 디시를 PBS에 희석한 0.1% gelatine으로 코팅하고 37 °C에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 그 다음, 배지를 제거하여 인간 배아 줄기 세포를 수확하고, 세포가 떨어져 나오는 동안 T 25 플라스크에 acuta 1 mL를 첨가하십시오.6.6 mL의 차가운 배지를 330 µL의 냉동 기저막 매트릭스(basement membrane matrix)에 추가합니다. 해당 용액을 40 µm 세포 스트레이너로 여과한 후, 여과된 용액 1 mL를 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주하여 덮습니다. 인간 배아 세포를 Accutane으로 30분간 배양한 후, 코팅된 플레이트에 세포를 플레이팅합니다. 1.5 mL의 Hess 배지를 추가하여 반응을 중단시킵니다.플라스크에서 세포를 긁어낸 후, Hess 배지 8 mL를 추가로 첨가합니다. 10 mL 피펫으로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만든 다음, 40 µm 세포 스트레이너로 세포를 여과하고 500 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포를 배지 10 mL에 재현탁한 후, 500 G에서 다시 3분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고, 최종 농도가 10 µM인 Rock inhibitor Y 2 7 6 3 2가 포함된 Hess S 배지 10 mL에 세포를 재현탁합니다.다음으로, 젤라틴 코팅 배양 접시에서 상층액을 제거하고, 젤라틴 코팅 배양 접시 위의 세포 현탁액을 37°C에서 정확히 1시간 동안 배양합니다. 이 단계 동안 하이포플라스트(hypoplast)는 젤라틴 코팅 플레이트에 가라앉고, 인간 배아 줄기세포는 부유 상태로 남게 됩니다. 부유 시간은 매우 중요한데, 배양 시간이 너무 길면 줄기세포가 뭉치게 되고, 너무 짧으면 섬유아세포가 부착될 때 일부의 섬유아세포만 제거되기 때문입니다.플레이트에 있는 배지를 사용하여 부착되지 않은 줄기세포를 플레이트에서 부드럽게 씻어냅니다. 10 milliliters의 Hess 배지로 플레이트를 두 번째로 세척하여 세포를 모은 후, 500 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 10 micromolar의 rock inhibitor Y 2, 7, 6, 3, 2 및 10 nanograms per milliliter의 fiberblast growth factor two가 포함된 약 4 milliliters의 조건화 배지에 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 세포를 trian blue와 혼합한 후 hemo cytometer 플레이트에서 세포 수를 측정합니다.기저막 형성 전 플레이트당 제곱센티미터당 18, 000 cells의 밀도로 세포를 분주합니다. Membrane coated plates의 각 웰에 1.5 milliliters의 배지를 넣어 세포를 덮고, 37 °C 및 5% carbon dioxide 조건에서 배양합니다. 24시간 후, 배지를 교체합니다. 다시 24시간이 지나면, 10 nanograms per milliliter의 fibroblast growth factor 2만 보충된 신선한 conditioned medium으로 배지를 교체하여 72시간 동안 배양합니다.세포를 파종한 후, 배지를 knockout serum replacement 배지로 교체합니다. 이 시점을 분화 0일 차로 정의합니다. 이후 3일 동안 매일 새로운 배지로 교체하여 세포를 배양합니다.4일차와 5일차에 배지를 교체할 때, 25%N two 보충 배지와 75% knockout serum replacement로 구성된 배지를 추가하십시오. 6일차에는 배지를 교체한 후 분석을 위해 세포를 수확합니다. 배아체(embryo bodies)는 다양한 연구에 활용될 수 있습니다.다음은 다양한 농도의 methyl mercury가 세포 생존율에 미치는 영향을 보여주는 세포독성 연구 사례입니다. 이 그래프를 통해 14일간 노출 후 24 micromolar 지점에서 10%의 세포 사멸이 발생하였고, 1.61 micromolar 농도에서 50%의 세포 사멸이 발생했음을 확인하였습니다. 세 가지 methyl mercury 처리군의 배아 몸체에서 분리한 RNA를 마이크로어레이로 분석하여 광범위한 바이오마커를 조사하였습니다.25 µM 수은에 노출된 샘플은 빨간색으로 표시되었습니다. 1 µM 메틸수은에 노출된 샘플은 파란색으로, 대조군 RNA는 녹색으로 표시되었습니다. 이 주성분 분석(PCA) 맵은 각 처리군 간의 유전적 특성이 유의미하게 다름을 보여주며, 1 µM 농도의 메틸수은에 노출되었을 때 276개 이상의 유전자에서 2배 이상의 발현 변화가 나타났습니다.그 중 30개의 유전자는 25 µM의 저농도 처리군에서도 변형되었습니다. 이 히트맵을 통해 1 µM 처리군에서 변형된 유전자 중 233개는 발현이 감소(downregulated)되었으며, 처리로 인해 발현이 증가(upregulated)된 유전자는 43개뿐임을 알 수 있습니다. 트리아졸(triazole) 또는 개발 단계의 개미를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 실험 절차를 수행하는 동안 안전 고글과 화학 저항성 장갑을 착용하고 모든 트리아졸 관련 작업을 흄 후드(fume hood) 내에서 수행하는 등의 예방 조치를 항상 고려해야 함을 잊지 마십시오.이 절차를 수행한 후, 표현형 앵커링(phenotypic anchoring)과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 염색이나 페로스(feros) 형성 등 튜브 형성 결과에 영향을 줄 수 있는 다른 방법들을 병행하여 수행할 수 있습니다.

human-pluripotent-stem-cell-based-developmental-toxicity-assays-for

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 인간의 배아 줄기 세포 집단에서 인간 간장 endoderm의 생성에 초점을 맞출 것이다.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

설명된 프로토콜을 통해 실험실은 프로그래밍 가능한 액체 처리 로봇과 96웰 플레이트를 사용하여 최소한의 노동력, 경험 및 장비 투자 비용으로 높은 처리량으로 확장 가능하고 접착력이 있는 줄기 세포 배양을 수행할 수 있습니다.  이 시스템에서 20회 이상 통과한 iPSC는 다능성, 정상 핵형을 유지했으며 심근세포로 분화되었습니다.

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

이 연구의 목적은 임피던스 기반 실시간 세포 분석기와 체외 독성 평가를 위한 HCS(High-Content Screening) 기반 플랫폼의 조합을 사용하여 15가지 담배 연기 성분의 생물학적 영향을 평가하는 것이었습니다. 이 연구는 테스트된 화합물의 효과적인 용량, 독성 및 작용 모드에 대한 정보를 제공합니다.

유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (HPHC)

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

선물이 epigenomically 안정 순 preimplantation epiblast 같은 만능 상태로, 대량, 효율적이 고 신속한 화학 귀선 기존의 혈통 액 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 대 한 프로토콜. 이 방법은 기존의 hPSC 라인의 광범위 한 레 퍼 토리에 걸쳐 감소 혈통 액 유전자 발현과 감독된 multilineage 차별화에 표시 되어 있는 개선에 발생합니다.

향상 된 Multilineage 차별화 힘으로 순진한 같은 상태로 기존의 인간의 Pluripotent 줄기 세포의 화학 귀선

이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축 기능 및 세포 무결성의 변화 분석은 비임상 약물 개발에 매우 중요합니다. 하이브리드 96웰 세포 분석 시스템은 임상 단계로의 안전한 전환에 필요한 신뢰할 수 있는 인간 관련 결과를 위해 실시간 및 생리학적 방식으로 두 파라미터를 모두 처리합니다.

전임상 심장 위험 평가를 위해 인간 iPSC 유래 심근 세포의 구조적 및 수축성 변화를 평가하기위한 하이브리드 세포 분석 시스템

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

이 연구에서 우리는 기형 유발 화학 물질을 식별하기 위한 시험관 내 세포 분석을 제시합니다. 인간 유도만능줄기(iPS) 리포터 세포에서 섬유아세포 성장 인자(FGF)/혈청 반응 인자(SRF) 신호 전달의 역학을 측정하고, 이 신호 전달 경로의 화학적 파괴를 정량화하여 기형 유발 위험을 평가했습니다.<br...

인간 유도만능줄기세포에서 섬유아세포 성장 인자 신호 파괴의 실시간 모니터링에 기반한 발달 독성 분석

배우세요 인간 배아 줄기세포를 이용한 발생 독성 시험 시스템으로 화학 물질 안전성을 평가하는 방법을. 이 기법은 전사체 분석을 통해 인간 관련 독성 효과를 모니터링하고 동물 실험을 줄이는 데 기여합니다.

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