경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

이 절차의 전체적인 목적은 생검된 골격근 조직에서 분리한 미토콘드리아의 호흡 조절을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 경피 바늘 생검을 통해 소량의 근육을 얻음으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 균질화를 통해 생검된 근육에서 미토콘드리아를 분리하는 것입니다.

다음으로, 분리된 미토콘드리아를 원심분리하고 샘플을 젖은 거즈(cheesecloth)에 통과시켜 세척하여 비미토콘드리아 분획물로부터 분리합니다. 마지막 단계로, 분리된 미토콘드리아를 플레이팅하여 세포 외 플럭스 분석(extracellular flux assays)을 통해 산소 소비율을 시각화하는 호흡 측정 분석을 수행합니다. 최종적으로, Seahorse 세포 외 플럭스 분석기를 사용하여 분리된 미토콘드리아의 호흡 조절을 조사합니다.

기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 20 mg 정도로 매우 적은 양의 근육 조직만으로도 가능하며, 실험 간 변동성을 제한한다는 점입니다. 이러한 특징 덕분에 이 기술은 임상 연구 응용 분야에 적합합니다. 이 기술은 환자의 미토콘드리아 기능 장애를 진단하는 데 활용될 수 있습니다.

근육 생검 및 미토콘드리아 분리는 텍스트 설명만으로는 부족하며 시각적으로 보여주는 것이 가장 효과적인 정밀한 조작이 필요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 국소 생검을 수행하려면 1% lidocaine을 투여하되, 근육 내로 침투하지 않도록 주의하십시오. 그 후 10분 동안 대기하십시오.

충분한 마취를 위해, 근막 하부 영역과 근건 접합 부위를 피해 근육의 정지점과 기점 사이의 중간 영역에서 생검 조직을 채취하십시오. 이를 위해 먼저 경피 바늘을 사용하고, 근막의 팝핑(pop) 현상이나 저항감을 가이드로 삼으십시오. 마취용 바늘로 깊이를 추정한 후, 좁은 메스 날로 이를 확인하고 근막을 통해 4~5 mm 절개하십시오.

바늘을 절개 부위를 통해 근육 내로 삽입될 때까지 전진시킵니다. 창(window)을 여러 방향으로 돌려가며 여러 개의 샘플을 수집합니다. 60 cubic centimeter 시린지를 사용하여 지속적인 흡입력을 가하면서, 근육 샘플이 경피 바늘 내부로 2~4회 서로 다른 방향으로 들어왔다 나갔다 하도록 반복합니다.

흡인을 중단하고 바늘을 제거하십시오. 보조자가 천자 부위를 5분 동안 강하게 압박하도록 합니다. 지혈을 위해 바늘을 흡입 튜브에서 분리하고 윈도우와 배럴에서 근육 샘플을 조심스럽게 꺼냅니다.

더 많은 근육 조직이 필요한 경우 이 절차를 반복하여 두 번째 채취를 수행합니다. 핀셋을 사용하여 근육 샘플에서 보이는 혈전(blood clots)을 모두 제거합니다. 그런 다음 샘플의 무게를 측정하고 즉시 얼음이 담긴 튜브에 넣습니다.

차가운 ECCO를 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline) 또는 DPBS로 세척합니다. 날카로운 가위와 핀셋을 사용하여 샘플에서 눈에 보이는 결합 조직을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 DPBS 버퍼로 표본을 3~4회 충분히 세척합니다.

혈액을 제거하기 위해 샘플을 얼음처럼 차가운 DPBS에 보관하고 가능한 한 빨리 처리하십시오. 생검 후 45분 이내에 근육 샘플에서 힘줄이나 지방 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 여분의 조직 일부를 소량 떼어 -80°C에서 보관하십시오.

이는 웨스턴 블롯과 같은 다른 실험에도 사용될 수 있습니다. 근육 조직을 즉시 잘게 다집니다. 멸균 가위를 사용하여 조직을 자른 후, 조직 1g당 0.2mg의 농도로 CP1 완충액에 용해된 nagars와 같은 Sistine 단백질 ACE 억제제 500µL에서 1mL에 현탁합니다.

샘플이 충분히 현탁될 때까지 잘게 다집니다. 그 후 실온에서 5분 동안 배양한 다음 얼음으로 옮기며, 이때 균질기를 철저히 세척했는지 확인하십시오. 사전에 한천(agar)으로 처리된 다진 조직을 균질화하십시오.

자동 균질기를 사용합니다. 이 과정 전반에 걸쳐 샘플을 얼음 위에 유지하십시오. 각 조직 샘플을 2초간 펄스로 4회 균질화합니다.

자동 균질기를 10,000 RPM 속도로 설정하여 사용한 후, 샘플을 다시 얼음에 놓습니다. 조직 간에는 프로브를 70% ethanol로 세척한 다음 증류수로 세척하십시오. 이제 균질화된 조직을 동일한 부피의 chapel Perry one 또는 CP one 버퍼로 세척합니다.

그런 다음 조직을 2배 부피의 CP two 완충액으로 세척합니다. 다른 원심분리관(conical tube)에 물을 동일한 부피까지 채워 균형 튜브를 맞춥니다. 내용물을 원심분리관에 모아 4°C에서 600 g로 10분 동안 원심분리합니다. 모든 입자가 거즈에 걸리지 않고 통과할 수 있도록 거즈를 미리 적셔둡니다.

젖은 치즈클로스(cheesecloth)에 상층액을 통과시켜 여과액을 수집하고 펠렛은 버림으로써 대부분의 비미토콘드리아 분획을 제거합니다. 그 다음 상층액을 4°C에서 10,000 g으로 10분 동안 초원심분리합니다. 펠렛을 4 mL의 CP2 버퍼에 현탁시킨 후, 앞서와 동일한 방식으로 다시 한번 원심분리합니다.

상층액을 버리고 펠렛을 2 mL의 CP one 버퍼에 재부유시킵니다. 이때, 단백질 정량 분석에 사용할 소량의 분취액을 별도의 시험관에 옮겨 둡니다. 나머지 샘플을 CP one 버퍼로 재부유시킨 후 원심분리합니다.

이전과 마찬가지로, 단백질 플레이트는 앞선 원심분리 단계에서 표준물질과 함께 준비되어야 함에 유의하십시오. 마지막으로, 최종 펠렛을 최소량의 미토콘드리아 분석 용액 또는 질량으로 재현탁합니다. XF 분석을 수행하여 분당 피코몰 산소량(pico moles of oxygen per minute)으로 산소 소비율(OCR) 또는 산소의 절대 수준 및 pH를 시각화합니다.

데이터 출력 단계에서, 텍스트 프로토콜에 기재된 최종 농도가 되도록 1X 질량의 화합물을 10배 농도로 희석하여 플레이트 기반 호흡 측정기의 포트 A부터 D까지 추가하십시오. 필요한 웰 수에 맞게 충분한 양의 화합물을 준비하십시오.

앞서 측정된 단백질 계산 값을 사용하여 첨가할 미토콘드리아의 농도를 결정합니다. 24웰 플레이트의 웰 간 변동성을 최소화하기 위해, 웰당 1 µg, 2.5 µg 및 5 µg의 미토콘드리아를 적정하여 최적의 미토콘드리아 양을 결정합니다.

먼저 10 x 미토콘드리아를 차가운 1 x mass plus 기질에 희석하십시오. 그다음, 각 웰에 이 현탁액 50 µL를 분주하십시오. 이때 background 측정값으로 사용할 4개의 웰에는 50 µL의 mass만 넣고 남겨둡니다.

기기 보정을 수행하기 위해 이전에 준비한 상단 카트리지와 함께 미리 적신 보정 플레이트를 호흡 측정계에 넣습니다. 테스트 플레이트 실행을 준비하기 위해 플레이트를 4°C에서 2000 g로 20분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리 후,

각 웰에 1x mass, plus succinate 및 rotten known 450 µL를 조심스럽게 첨가합니다. 플레이트를 XF 분석기로 옮기기 전, 현미경으로 미토콘드리아를 관찰하여 웰에 균일하게 부착되었는지 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 제공된 레스피로미터 설정을 사용하여 레스피로미터로 미토콘드리아 호흡을 실시간으로 순차적으로 측정합니다. 여기 제시된 것은 미토콘드리아 1 µg, 2.5 µg 및 5 µg을 사용하여 예상되는 복합체 II에 의한 전형적인 레스피로미터 프로파일입니다.

전반적으로 미토콘드리아의 양이 많을수록 OCR이 증가합니다. 이 분석에서 계산된 호흡 제어 비율(respiratory control ratio) 또는 RCR은 7.95이며, 이는 미토콘드리아 표본의 품질이 매우 높음을 나타냅니다. 서로 다른 양의 미토콘드리아 분석 시 결과의 일관성을 비교하기 위해 변이 분석(analysis of variants) 또는 ANOVA를 수행하고 제곱합을 계산하였습니다. 제곱합(sum of squares) 또는 SS는 상태 2(state two), 상태 3(state three), 탈커플링(uncoupled) 상태의 antimycin A, 그리고 상태 2와 상태 3 측정치에 대한 RCR에 대해 일원 분산 분석(one way)으로 제시되었습니다.

Innova는 ANTIMYCIN 및 RCR과 마찬가지로 통계적으로 유의미했습니다. 그룹 간 상태 3 비결합(state three uncoupled)에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 웰당 5 µg의 미토콘드리아를 처리했을 때 다른 농도와 비교하여 가장 낮은 SS를 나타냈음을 의미합니다.

이 그래프는 초기 근육 시료의 크기에 따라 어느 정도의 미토콘드리아 단백질을 기대할 수 있는지 나타내는 지침 역할을 합니다. 예상대로, 처리된 근육의 양과 최종 시료의 총 미토콘드리아 단백질 함량 사이에는 강한 상관관계가 있습니다. 숙련된 후 적절하게 수행한다면, 이 기술은 3시간 이내에 완료될 수 있습니다.

근육 생검 후에는 생검한 조직이 잘 치유될 수 있도록 환자가 향후 3일 동안 아스피린, 이부프로펜 또는 기타 일반 의약품 비스테로이드성 소염진통제를 복용하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 다음으로, 향후 하루 반 동안은 격렬한 활동을 하지 않도록 해야 하며, 특히 충격이 가해지는 활동은 피해야 합니다. 농구, 트램펄린, 툴러리(tillery)와 같은 활동은 금지되지만, 일상적인 활동은 가능합니다.

또한 해당 부위를 24시간 동안 건조하게 유지하도록 요청하되, 처음 물에 닿을 때는 샤워를 통해 우리가 세척하지 못한 피부 상의 모든 박테리아가 절개 부위로 들어가지 않도록 합니다. 이 영상을 시청하신 후에는 S lateral 골격근 조직을 생검하고, 미토콘드리아를 분리하며, 호흡 제어 능력을 측정하는 방법에 대해 더 잘 이해하시게 될 것입니다.