막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에 대장균

이 절차의 전반적인 목표는 구조 및 기능 분석을 위해 SIA coli에서 발현되는 막 단백질을 식별하는 것입니다. 첫째, 박테리아를 수확하고 거짓말을 하고 Ingel 형광에 의해 올바르게 접힌 GFP 단백질을 시각화하기 위해 SDS 페이지에서 분석합니다. 두 번째 단계에서는 관심 있는 막 단백질을 발현하기로 결정된 대장균의 생산을 확대하고 단백질 발현 유도 후 세포에서 총 막 분획을 준비합니다.

마지막으로, 총 멤브레인 분율은 4가지 다른 세제와 세제의 단일 분산성에 용해됩니다. 용해됩니다. GFP 단백질은 크기 배제 크로마토그래피로 분석됩니다. 궁극적으로, 단백질은 형광법과 샘플의 응집 mono dispersity 및 free GFP를 평가하기 위해 플롯된 elucian 프로파일로 모니터링할 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를 위한 재조합 막 단백질의 생산은 용해도가 낮고 세제로 추출되면 불안정성을 유전하기 때문에 기술적으로 어려운 과제입니다. 경험에 따르면 서로 다른 종의 ortholog와 같은 멤브레인 단백질의 여러 변이체를 스크리닝하면 멤브레인 단백질 발현의 성공률을 높일 수 있습니다. 녹색 형광 단백질에 대한 융합은 진정한 접힘을 보고하는 데 사용됩니다.

막 단백질 및 대장균의 발현 스크리닝을 위한 GFP 기반 프로토콜의 첫 번째 단계는 전체 세포에서 세제 용해물의 잉겔 형광을 사용하여 스크린의 발현 수준에 따라 추가 분석을 위한 막 단백질 구조를 식별하고, 멤브레인 단백질 및 다양한 세제를 선택하는 거동은 크기 배제 크로마토그래피와 결합된 형광 검출을 사용하여 평가됩니다. 이것은 세제 단백질 복합체의 단일 분산성에 대한 정보를 제공합니다. IPTG에 의한 세균 발현을 분석하기 위해서는 먼저 하룻밤 배양 24개의 깊은 우물 블록에서 1밀리리터의 IPTG 처리된 전자 배양 복제품을 96개의 깊은 우물 블록으로 옮기고 블록을 밀봉한 다음 실온에서 6, 000배 G에서 10분 동안 세포를 회전시킵니다.

그런 다음 블록을 뒤집어 미디어 디캔팅을 하고 종이 타월로 가볍게 두드려 남아 있는 액체를 배출합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 최소 20분 후에 섭씨 영하 80도에서 셀을 보관하십시오. 펠릿을 실온에서 20분 동안 해동한 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 용해 완충액에 세포를 완전히 재현탁합니다.

20 마이크로 리터의 DLPI 용액으로 세포를 10 분 동안 1000 RPM과 4 °C로 흔들어 처리했다. 그런 다음 각 웰에 25마이크로리터의 10%doda 멀티사이드를 추가하고 진탕하면서 60분 동안 세포를 더 배양합니다. DDM 처리 원심 분리기 후, 깊은 우물은 10 마이크로 리터의 맑은 용해물을 차단하고 마이크로 타이터 플레이트로 옮긴 다음 10 마이크로 리터의 SDS 페이지 겔 로딩 버퍼를 추가합니다.

이제 웰당 10마이크로리터의 용해물 완충 용액을 겔에 로드하고 다이어프램이 바닥에 닿을 때 2-2.5시간 동안 냉장실에서 100-120볼트 사이의 일정한 전압으로 겔을 실행합니다. 블루라이트 필터가 있는 이미저에 젤을 올려 융합 단백질을 검출하고 세포 배양을 확대합니다. 유능한 대장균의 Eloqua를 변형시킨 후 군체를 10ml의 파워 브로스 형태로 선택하여 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 성장시킵니다.

다음날 아침, 5ml의 하룻밤 배양물을 500ml의 파워 브로스로 희석하고 250RPM과 37°C에서 흔들면서 배양물을 계속 성장시킵니다. 595나노미터에서 OD가 약 0.5일 때 IPTG를 최종 농도 1밀리몰에 첨가하여 발현을 유도한 다음 이번에는 섭씨 20도에서 밤새 배양액을 셰이커에 다시 넣습니다. 다음날 아침, 원심분리로 세포를 수확하고 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

세포막을 준비합니다. 세 번째 실온 펠릿을 세포 펠릿 1g당 PBS 5밀리리터에 다시 현탁시키고 점도가 묽은 농도로 감소할 때까지 필요에 따라 부피를 늘립니다. 그런 다음 염화 마그네슘을 최종 농도 1밀리몰 DNA에 첨가하여 최종 농도 밀리리터당 10마이크로그램으로 만들고 세포 펠렛 20g당 사전 포장된 단백질 분해효소 억제제 정제 1정을 세포에 추가합니다.

다음으로, 30 KPSI의 압력에 냉각된 세포 교란기를 사용하여 세포를 끊고 30, 000배 G 및 4°C에서 15분 동안 깨지지 않은 세포와 파편을 펠릿으로 만듭니다. supinate를 ultracentrifugation tube로 옮기고 200, 000 번 G 및 섭씨 4도에서 1 시간 동안 supinate를 회전시켜 총 막 분획을 수집합니다. 그런 다음 세포 균질기를 사용하여 멤브레인 펠릿을 10밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS에 다시 현탁시켜 사용할 각 세제의 멤브레인을 용해시킵니다.

900마이크로리터의 멤브레인 현탁액을 1.5밀리리터 폴리 센트리파이 튜브로 분취합니다. 그런 다음 갓 준비한 세제 100마이크로리터를 적절한 1.5ml 튜브에 넣고 혼합물을 온화한 식물과 함께 섭씨 4도에서 배양합니다. 한 시간 후, 벤치탑 초원심분리기로 세제와 용해성 분획물을 펠릿화하여 튜브가 절반 이상 찼는지 확인하고 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 또는 FEC 분석을 위해 앙와위병을 유지합니다.

다음으로, 분당 0.3ml의 속도로 실행되는 흐름 버퍼가 있는 넓은 분별 범위를 가진 적도 크기 제외 컬럼. 그런 다음 100마이크로리터의 용해된 멤브레인 샘플을 동일한 유속으로 컬럼에 주입하고 형광 광학 장치를 사용하여 elucian 프로파일을 모니터링합니다. 마지막으로, 그래픽 표시를 위해 elucian volume 및 fluorescence intensity 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 가져오고 잉겔 형광으로 나머지 가용화된 멤브레인 물질을 분석합니다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 단백질 계열은 박테리아 세포 분열에 필수적입니다. 이 이미지에서는 24 OUTTA 47 상기 구조체의 겔 형광 시각화의 대표자가 표시됩니다. 밴드의 강도는 표현 수준을 나타냅니다.

예를 들어, 레인 장면 4의 융합 단백질은 두 균주 모두에서 잘 발현됩니다. 그러나, 추가적인 저분자량 대역은 단백질이 많은 레인에서 부분적으로 분해되었음을 시사합니다. GFP에만 크기가 해당하는 밴드가 있습니다.

예를 들면, G 4 및 H 4개는 C 41 DE 3 P 사기 S 긴장에 있는 자유로운 GFP에 완전하게 나뉘어진다. LEMO 21 DE three에서는 이 그래프에 일부 온전한 단백질이 있습니다. 형광 검출 크기 배제에 의해 1차 스크리닝에서 잘 수행된 2개의 구성물을 분석한 결과, 4가지 세제 중 어느 것이 테스트되었는지에 따라 단백질이 어떻게 다르게 작용하는지 알 수 있습니다.

예를 들어, 이 단백질은 Dool Multiside에서 깔짚 응집과 대칭적인 피크만 제공하여 후속 정제를 위한 세제로 선택되었습니다. 대조적으로, 다른 융합 단백질은 테스트된 모든 세제에서 유사한 프로필을 나타냈습니다. 이 프로토콜은 예를 들어, 1차 및 2차 스크리닝 모두에서 상이한 발현 조건 및 추가 억제 하에서 성장한 상이한 대장균 균주를 포함하도록 쉽게 확장될 수 있습니다.

요약하면, 이 프로토콜의 주요 목적은 추가 분석을 위한 후보 물질을 식별하기 위해 발현 및 세제 처리 측면에서 많은 수의 막 단백질을 스크리닝할 수 있도록 하는 것입니다.