Name: 막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에 대장균 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 학습하세요 대장균에서 막 단백질의 GFP 융합 발현 및 세제 적합성을 스크리닝하는 방법을. 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 단일 분산성과 단백질 안정성을 평가하고 구조 생물학 연구에 적합한 후보를 선별할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

OPPF-UK는 영국 의학 연구 위원회(Medical Research Council, MR/K018779/1)와 멤브레인 단백질 실험실(Membrane Protein Laboratory)의 자금 지원을 받습니다(보조금 099165/Z/12/Z).

발현 벡터의 1. 건설 <ol><li> 사용하여 PCR 주입 서열 13 각각에 절단 가능한 C 말단 또는 N 말단 GFP-을 His6 융합체를 추가 벡터 pOPINE-3C-GFP 및 POPIN-N-GFP를 이용하여 병렬로 96 발현 플라스미드까지 구축 클로닝. 주 : GFP가 세포질에서 발현 될 필요가 보낸 벡터의 선택은 이와 세포질 N 말단 세포 외 C 말단 우리 POPIN-N-GFP 및 대한을 사용 가진 단백질, 단백질의 토폴로지에 의해 결정되고 세포 외 N 말단과 세포질 C 말단은 우리가 pOPINE-3C-GFP를 사용합니다. 두 말단이 세포질 어디 C- 말단에 태그를하지 기능 이유가없는 한 우리는 pOPINE-3C-GFP를 사용합니다. </li><li> 도시 확장명 혼입 프라이머 막 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 증폭 : pOPINE-3C-GFP (정방향 프라이머 - AGGAGATATACCATG는 프라이머 역 - CAGAACTTCC을AGTTT)과 POPIN-N-GFP (정방향 프라이머 - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG은 - ATGGTCTAGAAAGCTTTA) 프라이머 역. </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 반응을 분석한다. 일단 깨끗한 PCR 제품이 얻어졌다 (1 배 DpnI 반응 버퍼의 5 μL 메이크업) 각 웰에 5 U DpnI를 추가합니다. 96- 웰 포맷으로 자성 비드를 이용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 참고 : DpnI 템플릿 벡터를 제거하기 위해 추가됩니다 게놈 DNA를 주형으로 사용하는 경우이 단계가 필요하지 않습니다. </li><li> PCR 플레이트의 각 웰에 적절한 선형화 된 벡터의 1 μL (100 NG)를 추가한다. </li><li> 정제 된 PCR ㎕의 멀티 채널 피펫 추가 X를 사용하여 PCR 플레이트의 적절한 우물에 삽입합니다. 모든 제품은 10-250 NG의 범위에 있는지 확인하십시오. </li><li> 우물의 물 (9-X) μl를 추가하고 건조 다운에서 융합 시약을 포함하는 튜브에 전체의 10 μl를 전송합니다. 30 초 동안 그대로 둡니다. </li><li> 피펫 팅 아래로 간단히 내용을 섞는다. 이전원래 PCR 플레이트와 실에 반응. </li><li> 열 순환기에 42 ° C에서 30 분 동안 품어. </li><li> 즉시 TE 40 μl를 반응이 완료되는 즉시 얼음에 반응을 전송하고 추가 (10 mM 트리스, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA). </li><li> 한 번에 동결 또는 관할 세포로 변환. 변환의 높은 역량의 50 μL 나누어지는 (&gt; 5 × 10 9 형질 전환 / μg의) 능력 E. 당 희석 된 반응의 3 μl를 사용 대장균 세포. </li><li> LB 한천 배지 1 ㎖를 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 당 웰의 24 웰 조직 배양 플레이트로 보충 추가 (클로닝, 구조의 2 × 번호 웰을 준비). </li><li> 생장 플레이트 후, 생장을 따라 밖으로 25㎕를 24 웰 조직 배양 플레이트를 함유하는 아가 상에 배양 한 5 희석액 25 μL. </li><li> 부드럽게 판을 기울여 세포를 확산. </li><li> 37 ° C 또는 플로에 10 ~ 15 분 동안 뚜껑 접시를 건조실온에서 w 후드. </li><li> 뚜껑을 교체하고 거꾸로 판을 켜고 밤새 37 ° C를 품어. </li><li> 두 식민지와 미니 준비 벡터를 선택합니다. </li><li> PCR은 구조 특정 역방향 프라이머 및 벡터 특정 정방향 프라이머 (예 pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA 태그 GG)를 사용하여 구조를 확인합니다. </li></ol> E. 2. 변환 대장균 E의 XPRESSION 변종 참고 : 이전에이 프로토콜, E.을 수행하기 대장균 유능한 세포를 만든 분주 이전 13 설명 ​​된대로 -80 ° C에서 냉동 저장됩니다. 막 단백질 발현이 정기적으로 두 균주에서 상영되어, Lemo21 (DE3)과 C41 (DE3) pLysS를. 결과의 해석을 돕기 위해 그것을 예 양성 대조군, GFP 발현 플라스미드 또는 발현하는 것으로 알려져 GFP 융합 세포막 단백질과 빈 벡터 대조군을 포함하는 것이 도움이 될 수있다. <ol><li> 알리 해동quotted E. 얼음에 대장균. 유능한 세포의 각 나누어지는에 미니 수험 공부를 발현 플라스미드의 3 μl를 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 얼음에 믹스를 품어. </li><li> 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 열 쇼크. </li><li> 세포가 2 분 동안 얼음에 복구하고 각 튜브에 전원 국물의 300 μl를 추가 할 수 있도록 허용. </li><li> 37 ° C 정적 배양기에서 1 시간 동안 품어. </li><li> 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린과 35 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜 보충, 24 웰 조직 배양 플레이트에서 LB 한천을 준비합니다. Lemo21 (DE3)를 함유하는 웰에 0.25 ㎜의 최종 농도 람노 추가. 참고 제품 C41을 함유하는 웰에 독성이있을 가능성이있는 경우 (DE3) pLysS를 1 % (w / v) 글루코오스로 보충 될 수있다. </li><li> 전송 LB 아가 플레이트 상에 형질 전환 혼합물로부터 세포의 30 μL. 확산 및 1.13-1.15에 설명 된대로 판을 건조. </li></ol> 박 스타터 문화 3. 준비 참고 : 항상 오래된 변환 판에서 결코 변환 후 하룻밤 문화에게 일을 준비합니다. <ol><li> 50 ㎍ / ㎖의 카르 베니 실린과 35 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜 보충 96 웰 깊은 웰 플레이트의 각 웰에 0.7 ml의 전원 국물을 추가합니다. 0.25 mM의 최종 농도 Lemo21 (DE3)를 함유하는 웰에 추가 람노. 선택적으로, 1 % (w / v)의 글루코스 C41 (DE3) pLysS를 보충; 위 (2.6 주)를 참조하십시오. </li><li> 물론 각에 하룻밤 변환 판에서 하나의 식민지를 선택합니다. 가스 투과성 씰 블록을 밀봉합니다. </li><li> 하룻밤 37 ° C에서 작은 던져 (예 : 4.3 mm 궤도)와 인큐베이터에 큰 던져 (예를 들어 25mm 궤도) 또는 600 rpm에서와 배양기에서 250 rpm에서 블록을 흔들어. </li></ol> 4. 성장과 문화의 유도 <ol><li> 전원 국물의 3 ㎖를 각각 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린과 35 ㎍ / ㎖의 클로람페니콜 w 보충 추가24 잘 깊은 웰 플레이트의 엘. 3.1 절에 설명 된대로 L-람 노스 (포도당)를 추가합니다. 중복에 수확을 할 수 있도록 문화의 3 ㎖를 사용하여 가스 투과 실을 통해 물이 일부 증발을 허용 할 수 있습니다. </li><li> 24 잘 깊은 잘 블록의 각 웰에 Lemo21 (DE3) 또는 C41 (DE3) pLysS를 하룻밤 문화의 150 μl를 추가하여 식 문화를 설정합니다. </li><li> 595 nm에서의 평균 OD 때까지 37 ° C에서 블록을 흔들어는 ~ 판을 통해 0.5입니다. </li><li> 1.0 mM의 IPTG의 최종 농도로 배양 물에 IPTG를 첨가하여 발현을 유도한다. </li><li> 20 ℃에서 진탕 배양 하룻밤 (18 ~ 20 시간)을 성장. </li></ol> 에 - 겔 형광에 의한 표현의 5. 분석 <ol><li> 중복에 수확. 광장 아니라, 원뿔 바닥, 96 웰 깊은 잘 블록에 각 웰에서 문화의 양도 1 ml의. 주 : 추수 중복 블록 또는 파손시의 교류 직류 시험을 허용원하는 경우 세제를했습니다. </li><li> 블록을 밀봉하고 10 분 동안 6,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> 블록 전환과 미디어를 가만히 따르다. 남은 용지를 배출 종이 타월 위에 가볍게 블록을 누릅니다. </li><li> 20 분 이상 동안 -80 ℃에서 저장 판 봉쇄. 선택적으로,이 시점에서 실험 때 편리 처리 블록을 떠난다. </li><li> 실온에서 20 분 동안 펠릿 드 로스트. </li><li> 용해 완충액 (50 mM의에 NaH 2 PO 4, 300 mM의 NaCl을 10 mM의 이미 다졸, 1 % (V)의 200 μL 완전히 세포를 재현 탁 4 ° C에서 멀티 채널 피펫 또는 진탕 기 (10 분 동안 1,000 RPM)를 사용하여 / V 트윈 20) NaOH를 사용하여 8.0으로 산도를 조정합니다. </li><li> (물 2 ㎖의 최종 부피 20 μL DNaseI (4000 단위 / ㎖), 20 mg의 라이소자임, 2​​0 μL 프로테아제 억제제 칵테일) DLPI 20 μL의 용액을 추가한다. 4 ℃에서 (~ 1,000 RPM)을 진탕 10 분 동안 품어. </li><li&gt; 10 % N -Dodecyl의 β-D-말토 (DDM)의 25 μl를 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 (~ 1,000 RPM)을 진탕 60 분 동안 품어. </li><li> 원심 분리기 4 ° C에서 30 분 동안 6,000 XG에 깊은 웰 블록. </li><li> 마이크로 타이 플레이트에 분해물의 10 μl를 전송 및 SDS PAGE 겔 로딩 버퍼 (100 mM 트리스, 산도 6.8, w 4 %의 10 μl를 추가 / SDS V, 0.2 % w 브로 모 페놀 블루, 10 % V / V의 β V / 머 캅토 에탄올, 20 % v / V를 글리세롤).주의! 샘플을 끓여하지 마십시오. </li><li> 로드 단계 5.11에서 시료 10 μL / 웰 SDS 페이지 젤 (들) 상 및 염료 전면 하단 (2-2.5 시간)에 도달 할 때까지 차가운 방에서 100 ~ 120 V (정전압)에서 실행합니다. </li><li> (GFP 융합 단백질을 검출하는 푸른 빛 필터 예 :) 이미 저에 젤을 놓습니다. 노출 시간은 밝은 밴드가 포화되지 않도록 선택된다. </li></ol> 세포 배양 6. 스케일 업 <ol><li> 관할의 나누어지는 변환 <em&gt; E. 대장균은 2 절에서 설명. </li><li> (3 절에 설명 된대로 보충) 전원 국물 10 ㎖에 식민지를 선택하고 37 ° C에서 하룻밤 성장. </li><li> 500 ml의 전원 국물에 하룻밤 문화의 5 mL를 희석. </li><li> 595 nm에서 OD 때까지 37 ° C에서 250 rpm으로 진탕 성장은 ~ 0.5입니다. </li><li> 1.0 mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 발현을 유도한다. </li><li> 20 ° C에서 250 rpm으로 진탕 하룻밤 성장. </li><li> 원심 분리하여 수확 세포를 15 분 동안 5,000 XG에. </li><li> 취소 상층 액. 세포 펠렛을 -80 ℃에서 보관 될 수있다. </li></ol> 막 7. 준비 <ol><li> 세포 펠렛의 g 당 5 ㎖의 부피로 1X PBS pH가 7.5을 실온에서 해동하고 재현 탁 세포 (필요한 경우); 점도가 콧물 일관성에 감소 할 때까지 필요에 따라 볼륨을 높입니다. 10 ㎍ / ㎖의 하나의 최종 농도 1 mM의,의 DNase I의 최종 농도의 MgCl 2를 추가세포 펠릿 20g 당 프로테아제 억제제 타블렛 사전 패키지. 30 KPSI의 압력에서 냉장 세포 장애 물질을 사용하여 열려있는 세포를 휴식. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 30,000g에서 끊어지지 세포와 파편 펠렛. 초 원심 분리 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 4 ° C에서 1 시간 동안 20 만 XG에서 초 원심 분리기에서 상층 액을 회전시켜 총 막 분획을 수집합니다. </li><li> 상층 액을 제거한다. </li><li> 세포 균질기를 사용하여 빙냉 PBS 10 ㎖의 pH 7.5에서의 막 펠렛을 다시 일시. 막 재현 탁 1 ml를 각각의 세제가 필요합니다. 선택적으로,이 단계에서, 플래시는 -80 ℃에서 액체 질소에 저장 막 현탁액을 동결. </li></ol> 막 분획 8. 가용화 및 분석 <ol><li> 해동 막 분획 (필요한 경우), 각각의 세제가 용해에 사용하는, 1.5 ml의 막으로 현탁액의 분취 량 900 ㎕를 마이크로 polyallomer centrifuGE의 튜브. </li><li> 지정된 1.5 ㎖의 튜브에 1 %의 최종 농도로 각각의 새로 제조 된 세제를 100 μL (10 % w / DDM, DM의 V 솔루션 Cymal LD​​AO-6)을 추가한다. 진핵 세포 막 단백질 콜레스테롤 헤 미숙시 네이트 (0.2 % 최종 농도)의 가용화 세정제에 첨가 할 수있다. </li><li> 가벼운 교반과 함께 1 시간 동안 4 ° C에서 혼합물을 품어. </li><li> 45 분 동안 4 ° C에서 150,000g에서 보장 튜브가 적어도 절반 가득, 벤치 탑 초 원심 분리기와 세제 불용성 부분을 펠렛과 상층 액을 유지합니다. 주 : 세제 가용화 효과는 PBS의 동일 용적에 재현 탁 세제 불용성 분획으로 가용화 막 GFP 형광을 측정하여 형광 플레이트 판독기를 사용하여 추정 될 수있다. </li><li> 다른 세제 모노 - 분산 분석 : 막 단백질 복합체 형광 감지 된 크기 배제 크로마토 그래피를 이용하여 (FSEC). </li><li> FSEC 분석을 위해 / 분 0.3 ml의 유속으로 완충액 (20 mM 트리스 pH가 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 0.03 %의 DDM)를 실행하여, 분자량 5,000,000 넓은 분별 범위 크기 배제 칼럼, 예를 들어 5000 평형화 . 모든 샘플이 버퍼를 사용하여, 그것은 각 시험 세제 변경되지 않습니다 즉. </li><li> / 분 0.3 ml의 유속으로 컬럼 상 가용화 된 막 100 ㎕를 주입한다. 형광 광학계 (488 nm에서 여기 및 512 nm에서 방출)을 이용하여 용출 프로파일을 모니터한다. 인라인 형광 모니터를 사용할 수없는 경우, 분획을 수집하고 플레이트 판독기에서 형광을 판독. </li><li> 그래픽 디스플레이에 대한 스프레드 시트 프로그램으로 가져 용리 부피와 형광 강도 데이터. </li><li> 섹션 5에 기술 된 바와 같이 겔의 형광에 의해 가용화 된 막 물질을 분석한다 잔존. </li></ol>

<ol><li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial%2C+archaean%2C+and+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).</li>
<li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+human+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray+diffraction+analysis+of+three-dimensional+crystals+of+bovine+rhodopsin+obtained+from+mixed+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles.</a> J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).</li>
<li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin%3A+A+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), 739-745 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li>
<li>Schlegel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+membrane+protein+overexpression+in+the+Escherichia+coli+strain+Lemo21%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3).</a> J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).</li>
<li>Chun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+partner+toolchest+for+the+stabilization+and+crystallization+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors.</a> Structure. 20 (6), 967-976 (2012).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).</li>
<li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li>
<li>Busso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+protein+complexes+using+multiple+Escherichia+coli+protein+co-expression+systems%3A+a+benchmarking+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study.</a> J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).</li>
<li>Sonoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+membrane+protein+detergent+stability+for+improving+throughput+of+high-resolution+X-ray+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures.</a> Structure. 19 (1), 17-25 (2011).</li>
<li>Low, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analytical+gel+filtration+screening+of+integral+membrane+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies.</a> Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

이 문서에서 설명하는 프로토콜에서 GFP 기자 벡터에 결찰 독립적 인 복제는 빠르게 E. 여러 막 단백질의 상대적 표현을 화면에 형광 검출과 결합 대장균. 벡터는 일차 식의 검사가 추가 주 복용 네 일에 할 수있다. 에 - 겔 전체 세포의 세제 용 해물의 형광 발현이 보조 화면에 추가 분석을 위해 히트 순위하는 데 사용됩니다. 제시된 주요 표현 화면이 떨어져 깊은 우물 블록 세포 성장에 적합한 진탕 배양기에서 어떤 전문 장비를 필요로하지 않습니다. SBS 96 웰 플레이트를 포함하는 모든 다른 액체 취급 멀티 채널 피펫을 이용하여 수행 될 수있다. 프로토콜은 용이하게 다른 표정 조건 (예, 저온) 하에서 성장 다른 E. 콜라이 균주를 포함하도록 수정 될 수있다. 람 노스의 수준을 적정 LEMO21 (DE3)의 경우 (0 내지 2.0 mM의)몇몇 막 단백질 (7)의 발현 수준을 증가시킬 수 전사 속도를 조절하기 위해 추가. 가혹한 세제 봉입체에서 단백질을 용해하기 때문에 오탐 (false positive)을 줄 수 있지만 DDM 이외의 세제는 기본 화면에 추출에 사용될 수 있습니다. 분명히, 더 초기 화면이 정교하게, 더 많은 시간이 소요되는 실험. 보조 화면은 기본 화면에서 식별 식 히트로부터 총 막 분획을 제조하는 것을 포함한다. 이는 E.의 막 융합 단백질의 위치 파악을 확인하므로 중요한 단계 대장균 세포. 다른 세제에서 GFP 융합 단백질의 후속 추출 세제 - 단백질 복합체의 모노 - 분산도를 평가하기 위해 가용화 된 물질의 형광 검출 된 크기 배제 크로마토 그래피에 의해 모니터링된다. 그것을위한 가장 적합한 세제를 식별 때문에 다른 중요한 단계후속 처리를 위해 하류 세포막 단백질의 가용화. 그러나 경험은 세제 (들)의 선택의 더 최적화가 아직 정제 및 결정화하는 동안 필요한 될 수 있음을 보여줍니다. 상대적으로 작은 미셀 크기 (예 : LDAO)를 포함 해 다른 세제의 균일 한 행동의 증거는 적어도 원핵 생물의 막 단백질 (14)에 대한 결정을 회절 잘 형성하는 성향의 좋은 지표가 될 것으로 보인다. 이러한 점에서도 2B에 세포막 단백질 위해 도시 프로파일 매우 유리한 나타난다. GFP 리포터를 사용하는 중요한 장점은 정제되지 않은 샘플에서의 발현의 빠른 판독을 제공한다는 것이다. 단점은 GFP 융합 단백질은 결정화를위한 단백질의 정제 동안 제거되어야한다는 것이다. 여기에 사용 된 벡터의 경우 리노 바이러스 3C 프로테아제 사이트 GFP의 절단을 가능하게한다. 대안으로, 간단만 이후 정제 폴리 히스티딘 또는 다른 친 화성 태그를 추가 벡터에 화면에서 확인 된 후보 단백질, 클론을 다시합니다. 이 GFP에 융합 발현에 필요하지 않다고 가정합니다. 막 단백질 발현 및 가용화 검색에 GFP를 융합에 사용하는 주요 대안은 히스티딘 태그를 추가하는 것이다. 그러나 이러한 접근법은 전형적으로 다수의 변형 평가를 위해 매우 시간이 소모 될 것이다 막 분획 (15)으로 시작 요구한다. 요약하면,이 문서에서 설명하는 프로토콜의 주요 목적은 세포막 단백질 서열의 다수 신속 발현 및 세제 용해의 측면에서 평가 깊은 분석을 위해 우선 순위가되도록 변형 가능하게하는 것이다.

이는 멤브레인 단백질이 인간 게놈을 비롯한 모든 게놈 서열 1에서 코딩하는 유전자의 약 20 ~ 30 %를 차지하고있는 것으로 추정되었다. 약물 표적 대사, 에너지 생성의 예를 수송하고 많은 생물학적 과정에서의 중요한 역할을 감안할 때, 자신의 세 차원 구조를 결정하는 데 큰 관심이있다. 그러나 수용성 단백질과 비교하여, 막 단백질은 고도로 언더 나타내는 단백질 데이터 뱅크에있다. 사실, PDB (에서 99,624 출시 구조의 <a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ) 만 471 ( <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ) 막 단백질로 분류됩니다. 이것은 자연적으로 상대적으로 낮은 수준으로 발현되는 막 단백질 작업의 기술적 어려움을 반영; 로돕신은 몇 가지 예외를 제외하고 3,4 중 하나입니다. 재조합 버전의 과발현이종 세포에서의 생산은 종종 전체 레벨을 제한 막 미스 폴딩 타겟팅 불량을 초래한다. 한 번 표현 막 단백질의 추출 및 가용화에 가장 적합한 세제를 선택하면 이후의 정화가 어렵고 조심 최적화가 필요합니다. 대장균은 72 % (차지 막 단백질에 대한 가장 일반적으로 사용되는 발현 숙주 남아 <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> 세균 출처 거의 독점적 최신인지 해결 구조). 특정 E. 콜라이 균주 C41 (DE3) 및 C43 (DE3)은, 막 단백질의 과발현을 유도하고, 따라서 다른 BL21 관찰 독성 5,6 균주 효과를 피하기 있지 않은 고립되었다. 재조합 막 단백질 발현 수준을 조정하는 것은 생산 6,7의 레벨을 최적화하는 중요한 것으로 보인다. 6-8을 악용하기 위해 여러 orthologues을 포함하여 여러 버전의 평가를 요구하고있다. 따라서, 병렬로 복수의 막 단백질의 발현을 스크리닝하는 방법이 필수적이다. 한가지 일반적으로 사용되는 방법은 단백질을 정제 할 필요없이 추적 할 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 가능 단백질을 융합한다. 이러한 방식으로, 다른 세제에서의 발현 수준의 안정성 및 행동에 관한 정보는 비 - 정제 된 물질 9-12 소량으로 평가 될 수있다. 이 문서에서 우리는 E.에서 막 단백질의 클로닝 및 발현 검사에 대한 간소화 된 프로토콜을 설명 대장균은 생산 및 세제의 후속 특성의 기자로 GFP 융합을 사용하여 : 단백질 빌려lexes (그림 1).

<table><tbody><tr><td>pOPIN-N-GFP</td><td>애드진 (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pOPINE-3C-GFP</td><td>애드진 (www.addgene.org)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C41(DE3)pLysS</td><td>Lucigen (http://lucigen.com/)</td><td>60444-1</td><td></td></tr><tr><td>LEMO21(DE3)</td><td>New England Biolabs</td><td>C2528H</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD EcoDry 클로닝 시스템, 96</td><td>Rxns 클론테크/타카라</td><td>639688</td><td></td></tr><tr><td>파워 브로스</td><td>분자 치수 (http://www.moleculardimensions.com/)</td> <td>MD12-106-1</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA Free; 프로테아제 억제제 칵테일&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>L-Rhamnose 모노하이드레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83650</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일&nbsp;</td><td>시그마 -알드리치</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>시그마 -알드리치</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>리소자임</td><td>시그마 알드리치</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤 헤미숙시</td><td>네이트 시그마 알드리치</td><td>C6512</td><td></td></tr><tr><td>CYMAL-6 (6-시클로헥실-1-헥실-&베타;-D-말토사이드)</td><td>아나트레이스</td><td>C326</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-도데실 &베타;-말토사이드)</td><td>제네론</td><td>D97002</td><td></td></tr><tr><td>DM (n-Decyl &beta;-maltoside)</td><td>Generon</td><td>D99003</td><td></td></tr><tr><td>LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)</td><td>Generon</td><td>D71111</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip Eq384 8&nbsp; 채널 1-30 &마이크로; l</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>4672030</tr><tr><td>Rainin 피펫 Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 &micro; l LTS 스페이서</td><td>Anachem</td><td>LA6-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>Rainin 피펫 라이트 XLS+ 8ch 2-20 &마이크로; l LTS</td><td>Anachem</td><td>L8-20XLSPLUS</td><td></td></tr><tr><td>피펫 Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 &micro; l LTS 팁</td><td>Anachem</td><td>L8-1200XLS</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 V 바닥 딥 웰 블록</td><td>Porvair 과학</td><td>360115</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark 형광 단백질 표준</td><td>생명 기술</td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 10% 비스-트리스 미디 단백질 겔, 26 웰</td><td>라이프 기술</td><td>WG1203BOX</td><td></td></tr><tr><td>XCell4 SureLock 미디 세포</td><td>생명 기술</td><td>WR0100</td><td></td></tr><tr><td>Vibramax 100</td><td>Heidolph</td><td>544-21200-00</td><td></td></tr><tr><td>텐션 롤러 부착</td>물 <td>Heidolph</td><td>549-81000-00</td><td></td></tr><tr><td>ptima L-100 초원심분리기 작동 45-Ti 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP 초원심분리기 TLA-55 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>플로어 스탠딩 원심분리기, Avanti J-26S XPI 실행 JA-17 및 JS-5.3 로터&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14535</td><td></td></tr><tr><td>Prominence UFLC와 RF-20A 형광 검출기</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose 6 10/300 GL 크기 제외 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SSI5R-HS SHEL LAB 바닥 모델 쉐이킹 인큐베이터, 5 Cu.Ft. (144&nbsp; L), 30-850 rpm</td><td>Shel Lab&nbsp;</td><td>SSI5R-HS</td><td></td></tr><tr><td>Innova44R 인큐베이터</td><td>New Brunswick /Eppendorf</td><td>Innova44R</td><td></td></tr><tr><td>TS 시리즈 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1&nbsp; PH (40 kpsi)</td><td></td>L-람노스 일수화물 PL083016 <td></td><td>상수 시스템</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>83650</td><td></td></tr></tbody></table>

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

구조적 및 기능적 연구를위한 재조합 막 단백질의 생산으로 인해 낮은 수준의 발현과 한번 세제 가용화 많은 막 단백질의 고유 한 불안정성 기술적 도전 남아있다. 프로토콜은 GFP의 형광에 의해 검출 된 대장균에서 발현와 GFP 융합으로 막 단백질의 결찰 독립적 인 복제를 결합한 기술되어있다. 이것은 다수의 세포막 단백질의 구조와 식 스크리닝 / 시간과 노력을 투자를 더욱 적합한 후보를 식별 할 수 있도록 변형. GFP 리포터는 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 다음 GFP 형광을 시각화하여 표현의 기본 화면에서 사용된다. 자유 GFP의 부재에 의해 지시 된 바와 같이 최소한의 손실로 높은 발현 수준을 모두 보여 막 단백질은, 보조 스크린으로 선정된다. 이러한 구조는 스케일링 총 막 분획을 제조하고, 가용화되고네 가지 세제의 D. 세제 불용성 물질을 제거하는 초 원심 이어 해물 형광 검출 크기 배제 크로마토 그래피 (FSEC)에 의해 분석된다. GFP 형광에 의해 크기 배제 프로파일 모니터링 다른 세제의 막 단백질의 모노 - 분산도 및 무결성에 대한 정보를 제공한다. 단백질 : 거의 또는 전혀없는 GFP 및 최소 집계와 대칭 피크 용출 세제 조합은 이후 정제를위한 후보입니다. 위의 방법, E.의 이종 표현을 사용하여 SED (모양, 신장, 분할 및 포자 형성) 박테리아의 47 종에서 단백질의 대장균을 분석 하였다. 이들 단백질은 일반적으로 열 경막 도메인을 가지며 세포 분열에 필수적인. 결과는 보여 그 E.에서 SED는의 orthologues의 생산 대장균은 GFP 융합 단백질의 발현 수준에 대하여 정직하게 매우 가변적이다. 실험 전추가 조사를 위해 일부를 dentified.

단백질 (모양, 신장, 분할 및 포자 형성)의 SED는 제품군은 박테리아 세포 분열에 필수적이다. 이 필수적인 단백질은 일반적으로 세포 내부 모두 아미노산과 카르복시 말단에 열 횡단 도메인을 가지고있다. 전술 한 프로토콜을 예시하기 위해 47의 SED는 orthologues는 벡터 pOPINE-3C-eGFP는 내로 클로닝 하였다. 구조의 소규모 발현 화면 개의 E .coli 균주 행했다, 0.25 mM의 존재하에 성장 Lemo21 (DE3)는 일상적 막의 발현에 사용되는 누설 발현 및 C41 (DE3) pLysS 균주를 차단할 람노 단백질 5-8. 유도 배양 세제의 가용화 용 해물은 SDS 폴리 아크릴 아미드 전기 영동으로 분석 하였다. 겔의 형광을 사용하여 표현 GFP 융합 단백질은 47 SED는 구조체 중 38 개의 균주 사이 제작했다 시각화하는 것으로 나타났다. 흥미롭게도 두 발현 균주의 차이가 있었다. (38) 구조를 표현 중 단지 18 두 균주 만 만 C41 (DE3) pLysS를에 Lemo21 (DE3)와 (6)으로 표현 (14)에서 생산되었다. 전반적으로, C41 (DE3) pLysS를 (24 대 38)에 비해 Lemo21 (DE3)에 대한 높은 성공률이 있었다. 그러나 일부 단백질이 변형 구체적으로 나타난 관찰은 모두 선별하는 것이 유용하다는 것을 의미한다. (47) 또한 SED 24 대표적인 데이터 구조는도 1에 도시되어있다. 밴드의 강도는, 상기 두 균주에서 잘 추가적인 표현 예도 1a 및도 1b에 잘 C4의 융합 단백질 발현 수준의 지표를 제공한다 저 분자량의 밴드는 부분적으로 분해 된 단백질임을 시사한다. 많은 차선에서 혼자 GFP에 크기에 해당하는 밴드가있다. 단백질의 무결성의 질적 평가를 무료로 GFP 융합 단백질의 상대적 강도를보고에 의해 수행 될 수있다;예 G4 및 H4 완전히 일부 손상 단백질 (그림 1A)이있다 Lemo21 (DE3)에있는 반면, C41 (DE3) pLysS를 (그림 1B)에서 무료로 GFP로 분류됩니다. (38) 발현 단백질 중 14 무료 GFP의 밴드의 강도는 (자유 GFP 대역의 세기는 융합 단백질과 융합 단백질의 소수의보다 큰 (21), (3) 융합 단백질의 것과 유사 / 38) 표현 예 F6 그림 1A에서 G6는 융합 단백질에 비해 상대적으로 작은 무료 GFP가있다. 과 G6 (작은 무료 GFP) 표현되었다 500 ml의 세포 배양에서 제조 된 총 막 분획 (무료 GFP와 융합 단백질에 대한 강도 높은 대역) 기본 화면 B5에서 잘 표현 된 구조의 두 가지. 재현 탁 멤브레인 분액으로 나누어 형광 감지 된 크기 배제 크로마토 그래피 (FSEC)로 분석 하였다. FSEC 프로파일은 Figur에 제시되어있다E 2a 및도 2b는 각각 및 SED는 두 단백질 테스트 사 세제에 다르게 행동을 보여준다. 한 경우 (그림 2 A : 샘플 B5)은 단백질은 따라서 이후의 정화에 대한 선택의 세제 것 DDM에 약간의 집계와 대칭 피크를했다. 반면 다른 융합 단백질에 의해 (그림 2B : 샘플 G6)는 테스트 한 모든 세제에 유사한 프로필을했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> 그림 1 : E.에서 막 단백질 발현을 선별 워크 플로 다이어그램 대장균은 GFP 기자를 사용하여. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> 그림 2 :에 - 겔 형광을 이용하여 막 단백질 발현의 기본 화면. </strongE.의&gt; 세제 해물 콜라이 SDS-PAGE로 분석 하였다 세포 및 겔 블루 에피 조명 및 28분의 530 필터를 사용하여 몇 군데. 결과는 (96 웰 플레이트에서의 위치에 따라 A4-H6 표시) (24) 구조에 대한 표시됩니다. 자유 GFP 및 GFP 융합 단백질 밴드의 위치가 표시된다. Lemo21 (DE3). (B) C41 (DE3) pLysS 균주에서 발현 된 단백질에서 발현 (A)을 단백질. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> 도 3 :. 세포막 단백질 발현의 보조 화면 형광 감지 된 크기 배제 크로마토 그래피 (FSEC)를 사용하여 총 막 분획 4 개의 다른 세제 추출하고, 가용화 된 막 단백질은 형광 검출기에 결합 FPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토 그래피로 분석 하였다. FSEC 대한 프로파일 (A) 막 단백질 및 B5 (B) </strong&gt; 막 단백질 G6. 응집 된 단백질 가용화 GFP 융합 단백질 및 무료 GFP에 대응 피크의 위치가 표시되어있다. 테스트 세제는 프로필 아래에 표시됩니다.

녹색 형광 단백질에 융합을 기반으로 대장균에서 재조합 막 단백질의 발현에 대한 심사에 대한 효율적인 접근 방법이 제시된다.

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

본 절차의 전반적인 목표는 구조 및 기능 분석을 위해 SIA coli에서 발현된 막 단백질을 식별하는 것입니다. 먼저, 박테리아를 수확하고 용해한 뒤 SDS page로 분석하여 Ingel 형광을 통해 올바르게 접힌 GFP 단백질을 시각화합니다. 두 번째 단계에서는 표적 막 단백질을 발현하는 것으로 판명된 e coli의 생산 규모를 확대하고, 단백질 발현 유도 후 세포로부터 전체 막 분획을 준비합니다.마지막으로, 전체 막 분획을 네 가지 서로 다른 계면활성제로 가용화하고, 가용화된 GFP 단백질의 단분산성을 크기 배제 크로마토그래피로 분석합니다. 최종적으로, 형광을 통해 단백질을 모니터링하고 용출 프로파일을 도식화하여 시료 내의 응집 상태, 단분산성 및 유리 GFP를 평가할 수 있습니다.구조 및 기능 연구를 위한 재조합 막 단백질의 생산은 막 단백질의 낮은 용해성과 계면활성제로 추출된 후 나타나는 불안정성으로 인해 여전히 기술적으로 까다로운 과제로 남아 있습니다. 다양한 종의 오솔로그(ortholog)와 같이 막 단백질의 여러 변이체를 스크리닝하는 것이 막 단백질 발현의 성공률을 높일 수 있음이 경험적으로 밝혀졌습니다. 정확한 폴딩(folding) 여부를 확인하기 위해 녹색 형광 단백질과의 융합이 사용되었습니다.막 단백질 및 e coli의 발현 스크리닝을 위한 GFP 기반 프로토콜의 첫 번째 단계에서는, 전세포 유래 계면활성제 용해물의 젤 내 형광을 이용하여 스크리닝된 발현 수준에 따라 추가 분석 대상이 될 막 단백질 구조체를 식별합니다. 이후 크기 배제 크로마토그래피와 결합된 형광 검출을 통해 막 단백질과 다양한 계면활성제의 선택 거동을 평가합니다. 이를 통해 계면활성제-단백질 복합체의 단분산성에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. IPTG로 유도된 박테리아 발현을 분석하려면, 먼저 하룻밤 동안 배양한 24-딥웰 블록에서 IPTG 처리된 e coli 1 mL를 96-딥웰 블록으로 옮겨 복제본을 만듭니다. 블록을 밀봉한 후, 실온에서 6,000 ×g로 10분 동안 원심 분리하여 세포를 가라앉힙니다.그 후, 블록을 뒤집어 배지를 따라내고 페이퍼 타월 위에 가볍게 두드려 남은 액체를 제거합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 최소 20분 후에 영하 80 °C에서 세포를 보관합니다. 펠릿을 상온에서 20분 동안 해동한 다음, 멀티채널 피펫을 사용하여 200 µL의 용해 버퍼(lysis buffer)에 세포를 완전히 재현탁합니다.세포에 20 µL의 DLPI 용액을 처리하고 1000 RPM, 4 °C에서 10분 동안 흔들어 섞어줍니다. 그런 다음 각 웰에 10% DDM 25 µL를 첨가하고 다시 60분 동안 흔들며 세포를 배양합니다. DDM 처리 후 딥웰 블록을 원심분리하고, 맑게 정제된 용해물 10 µL를 마이크로타이터 플레이트로 옮긴 후 SDS-PAGE 겔 로딩 버퍼 10 µL를 첨가합니다.이제 각 웰에 10 µL의 용해 버퍼 용액을 로딩하고, 다이아프램이 바닥에 도달할 때까지 저온실에서 100~120 V의 정전압으로 2~2.5시간 동안 전기영동을 수행합니다. 융합 단백질을 검출하여 세포 배양 규모를 확대하기 위해 청색광 필터가 장착된 이미지 장치에 젤을 배치합니다. 컴피턴트 E. coli의 Eloqua를 형질전환한 후, 콜로니 하나를 선택하여 10 mL의 power broth에 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 하룻밤 배양한 배양액 5 mL를 500 mL의 power broth에 희석하고, 250 RPM, 37 °C에서 진탕 배양을 계속합니다. 595 nm에서의 OD 값이 약 0.5가 되면, IPTG를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하여 발현을 유도한 후, 배양액을 다시 쉐이커에 넣고 이번에는 20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 원심분리를 통해 세포를 수확하고 펠릿을 -80 °C에서 보관합니다.세포막을 준비하려면, 세포 펠렛 1g당 5mL의 PBS를 사용하여 실온의 세 번째 펠렛을 재현탁하며, 점도가 낮아져 흐르는 상태가 될 때까지 필요에 따라 부피를 늘립니다. 그 후, 최종 농도가 1mM이 되도록 염화마그네슘을, 최종 농도가 10µg/mL가 되도록 DNA를, 그리고 세포 펠렛 20g당 기성품 프로테아제 억제제 정제 1정을 세포에 첨가합니다.다음으로, 30 KPSI의 압력에서 냉각된 세포 파쇄기를 사용하여 세포를 파쇄한 후, 30,000 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심 분리하여 파쇄되지 않은 세포와 잔해를 펠렛화합니다. 상층액을 초원심 분리 튜브로 옮기고, 200,000 ×g, 4 °C에서 1시간 동안 상층액을 원심 분리하여 전체 막 분획을 수집합니다. 그런 다음, 사용할 각 계면활성제에 대해 막을 가용화할 수 있도록 세포 균질기를 사용하여 막 펠렛을 10 mL의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁합니다.막 현탁액 900 µL를 1.5 mL 폴리 원심분리 튜브에 분취합니다. 그런 다음, 각각 새로 조제한 계면활성제 100 µL를 해당 1.5 mL 튜브에 넣고 4 °C에서 완만하게 교반하며 배양합니다. 한 시간 후, 벤치탑 초원심분리기를 사용하여 계면활성제 및 가용성 분획을 펠렛화하며, 이때 튜브가 최소 절반 이상 채워져 있는지 확인하고 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 또는 FEC 분석을 위해 상층액을 보관합니다.다음으로, 넓은 분획 범위를 가진 equator 크기 배제 컬럼을 분당 0.3 milliliters의 유속으로 흐르는 버퍼를 사용하여 평형화합니다. 그 후, 동일한 유속으로 가용화된 막 샘플 100 microliters를 컬럼에 주입하고 형광 광학 장치를 사용하여 용출 프로파일을 모니터링합니다. 마지막으로, 용출 부피와 형광 강도 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 가져와 그래프로 표시하고, 남은 가용화 막 물질을 인젤 형광 분석으로 분석합니다.앞서 입증한 바와 같이, 해당 단백질 가족은 박테리아의 세포 분열에 필수적입니다. 이 이미지들은 해당 컨스트럭트 중 24/47개에 대한 대표적인 겔 형광 시각화 결과를 보여줍니다. 밴드의 강도는 발현 수준을 나타냅니다.예를 들어, lane scene four의 융합 단백질은 두 균주 모두에서 잘 발현되었습니다. 하지만 낮은 분자량의 밴드가 추가로 나타나는 것은 많은 lane에서 단백질이 부분적으로 분해되었음을 시사합니다. GFP 단독 크기에 해당하는 밴드가 관찰됩니다.예를 들어, C 41 DE 3 PLyS 균주에서는 G 4와 H 4가 완전히 분해되어 유리 GFP 상태로 존재합니다. 반면 LEMO 21 DE 3에서는 이 그래프들에서 일부 온전한 단백질이 관찰됩니다. 1차 스크리닝에서 우수한 성능을 보인 두 가지 컨스트럭트를 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과, 테스트한 4가지 계면활성제 중 어느 것을 사용하느냐에 따라 단백질의 거동이 어떻게 달라지는지 알 수 있습니다.예를 들어, 이 단백질은 Dool Multiside에서 응집이 거의 없는 대칭형 피크만을 나타내어, 이후 정제 과정에서 해당 계면활성제가 선택되었습니다. 반면, 다른 융합 단백질은 테스트한 모든 계면활성제에서 유사한 프로필을 보였습니다. 이 프로토콜은 예를 들어, 서로 다른 발현 조건에서 배양된 다양한 e coli 균주와 1차 및 2차 스크리닝의 추가 계면활성제를 포함하도록 쉽게 확장할 수 있습니다.요약하자면, 이 프로토콜의 주요 목적은 다수의 막 단백질을 대상으로 발현 및 가용화 효율을 스크리닝하여 추가 분석을 위한 후보 물질을 발굴하는 것입니다.

green-fluorescent-protein-based-expression-screening-membrane

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Rugjee, K. N., et al. 녹농균에서 c-di-GMP 신호 전달을 조절하는 소분자를 스크리닝하기 위한 고처리량 설정 구축.  J. Vis. 경험. (2016).이 비디오는 c-di-GMP 민감성 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 유전자 변형 박테리아를 사용하여 순환 di-GMP 조절제의 스크리닝을 보여줍니다. 형광은 서로 다른 테스트 화합물을 포함하는 멀티웰 플레이트에서 측정됩니다. c-di-GMP 생성을 억제하는 화합물은 형광을 감소시킵니다. 그런 다음 데이터를 분석하여 박테리아에서 c-di-GMP 신호 전달의 잠재적 조절자를 식별합니다.

형광 리포터 단백질을 발현하는 박테리아를 이용한 고리형 di-GMP 조절제의 스크리닝 

이 비디오에서는 세제 가용화 후 대장균에서 녹색 형광 단백질(GFP) 융합 막 단백질 안정성을 스크리닝하기 위한 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 기술을 시연합니다. 유리 GFP가 거의 또는 전혀 없는 크기 배제 프로파일에서 대칭적인 피크를 나타내는 단백질은 분해 및 응집이 최소화된 정제된 단백질을 나타내며, 이는 이후에 구조 기능 분석을 위해 선택될 수 있습니다.

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins on Detergent Solubilization(형광 검출 크기 배제 크로마토그래피: 세제 용해 시 형광 멤브레인 단백질의 무결성을 확인하는 기술)

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

여기에서는 살아있는 세포에서 일체형 막 단백질의 방향과 토폴로지를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 간단한 프로토콜은 관심 단백질과 GFP 사이의 키메라의 선택적 단백질 분해 효소 민감도에 의존합니다.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

PCR 매개 유전자 변형은 시각화 및 효모 세포 및 단백질의 정량을 용이 칸디다 종의 형광 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 칸디다에서 형광 단백질 융합 (Eno1-FP)을 구축하기위한 전략을 제시한다.

에 형광 단백질 융합의 시대<em&gt; 칸디다</em&gt; 종

합성 생물학 비정규 아미노산의 co-translational 삽입을 사용 하 여 전례 없는 속성으로 단백질의 엔지니어링을 수 있습니다. 여기, 우리는 어떻게 소설 형광 분 광 속성, "금" 형광 성 단백질 (GdFP), 불리는 GFP 형 fluorophore의 spectrally 레드 이동 변종 생산 대장균 에서 선택적 압력 관 (SPI)를 통해 제시.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

여기, 우리 향상 된 녹색 형광 단백질 표현 대장균을 사용 하 여 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

이 프로토콜 세부 단계, 비용, 그리고 대장균을 생성 하는 데 필요한 장비-셀 추출 물 및 단백질 합성 반응을 시험관에서 4 일 안에 구현. 광범위 한 응용 프로그램에 대 한이 플랫폼의 유연한 특성을 활용 하 여 우리는 적응 되 고 최적화 될 수 있는 반응 조건 논의.

대장균-셀 무료 단백질 합성 기반: 강력 하 고 유연 하며 액세스할 수 있는 플랫폼 기술에 대 한 프로토콜

학습하세요 대장균에서 막 단백질의 GFP 융합 발현 및 세제 적합성을 스크리닝하는 방법을. 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피를 활용하여 단일 분산성과 단백질 안정성을 평가하고 구조 생물학 연구에 적합한 후보를 선별할 수 있습니다.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에

더 많은 동영상 탐색