막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에

본 절차의 전반적인 목표는 구조 및 기능 분석을 위해 SIA coli에서 발현된 막 단백질을 식별하는 것입니다. 먼저, 박테리아를 수확하고 용해한 뒤 SDS page로 분석하여 Ingel 형광을 통해 올바르게 접힌 GFP 단백질을 시각화합니다. 두 번째 단계에서는 표적 막 단백질을 발현하는 것으로 판명된 e coli의 생산 규모를 확대하고, 단백질 발현 유도 후 세포로부터 전체 막 분획을 준비합니다.

마지막으로, 전체 막 분획을 네 가지 서로 다른 계면활성제로 가용화하고, 가용화된 GFP 단백질의 단분산성을 크기 배제 크로마토그래피로 분석합니다. 최종적으로, 형광을 통해 단백질을 모니터링하고 용출 프로파일을 도식화하여 시료 내의 응집 상태, 단분산성 및 유리 GFP를 평가할 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를 위한 재조합 막 단백질의 생산은 막 단백질의 낮은 용해성과 계면활성제로 추출된 후 나타나는 불안정성으로 인해 여전히 기술적으로 까다로운 과제로 남아 있습니다. 다양한 종의 오솔로그(ortholog)와 같이 막 단백질의 여러 변이체를 스크리닝하는 것이 막 단백질 발현의 성공률을 높일 수 있음이 경험적으로 밝혀졌습니다. 정확한 폴딩(folding) 여부를 확인하기 위해 녹색 형광 단백질과의 융합이 사용되었습니다.

막 단백질 및 e coli의 발현 스크리닝을 위한 GFP 기반 프로토콜의 첫 번째 단계에서는, 전세포 유래 계면활성제 용해물의 젤 내 형광을 이용하여 스크리닝된 발현 수준에 따라 추가 분석 대상이 될 막 단백질 구조체를 식별합니다. 이후 크기 배제 크로마토그래피와 결합된 형광 검출을 통해 막 단백질과 다양한 계면활성제의 선택 거동을 평가합니다. 이를 통해 계면활성제-단백질 복합체의 단분산성에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. IPTG로 유도된 박테리아 발현을 분석하려면, 먼저 하룻밤 동안 배양한 24-딥웰 블록에서 IPTG 처리된 e coli 1 mL를 96-딥웰 블록으로 옮겨 복제본을 만듭니다. 블록을 밀봉한 후, 실온에서 6,000 ×g로 10분 동안 원심 분리하여 세포를 가라앉힙니다.

그 후, 블록을 뒤집어 배지를 따라내고 페이퍼 타월 위에 가볍게 두드려 남은 액체를 제거합니다. 플레이트를 다시 밀봉하고 최소 20분 후에 영하 80 °C에서 세포를 보관합니다. 펠릿을 상온에서 20분 동안 해동한 다음, 멀티채널 피펫을 사용하여 200 µL의 용해 버퍼(lysis buffer)에 세포를 완전히 재현탁합니다.

세포에 20 µL의 DLPI 용액을 처리하고 1000 RPM, 4 °C에서 10분 동안 흔들어 섞어줍니다. 그런 다음 각 웰에 10% DDM 25 µL를 첨가하고 다시 60분 동안 흔들며 세포를 배양합니다. DDM 처리 후 딥웰 블록을 원심분리하고, 맑게 정제된 용해물 10 µL를 마이크로타이터 플레이트로 옮긴 후 SDS-PAGE 겔 로딩 버퍼 10 µL를 첨가합니다.

이제 각 웰에 10 µL의 용해 버퍼 용액을 로딩하고, 다이아프램이 바닥에 도달할 때까지 저온실에서 100~120 V의 정전압으로 2~2.5시간 동안 전기영동을 수행합니다. 융합 단백질을 검출하여 세포 배양 규모를 확대하기 위해 청색광 필터가 장착된 이미지 장치에 젤을 배치합니다. 컴피턴트 E. coli의 Eloqua를 형질전환한 후, 콜로니 하나를 선택하여 10 mL의 power broth에 접종하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 아침, 하룻밤 배양한 배양액 5 mL를 500 mL의 power broth에 희석하고, 250 RPM, 37 °C에서 진탕 배양을 계속합니다. 595 nm에서의 OD 값이 약 0.5가 되면, IPTG를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하여 발현을 유도한 후, 배양액을 다시 쉐이커에 넣고 이번에는 20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 원심분리를 통해 세포를 수확하고 펠릿을 -80 °C에서 보관합니다.

세포막을 준비하려면, 세포 펠렛 1g당 5mL의 PBS를 사용하여 실온의 세 번째 펠렛을 재현탁하며, 점도가 낮아져 흐르는 상태가 될 때까지 필요에 따라 부피를 늘립니다. 그 후, 최종 농도가 1mM이 되도록 염화마그네슘을, 최종 농도가 10µg/mL가 되도록 DNA를, 그리고 세포 펠렛 20g당 기성품 프로테아제 억제제 정제 1정을 세포에 첨가합니다.

다음으로, 30 KPSI의 압력에서 냉각된 세포 파쇄기를 사용하여 세포를 파쇄한 후, 30,000 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심 분리하여 파쇄되지 않은 세포와 잔해를 펠렛화합니다. 상층액을 초원심 분리 튜브로 옮기고, 200,000 ×g, 4 °C에서 1시간 동안 상층액을 원심 분리하여 전체 막 분획을 수집합니다. 그런 다음, 사용할 각 계면활성제에 대해 막을 가용화할 수 있도록 세포 균질기를 사용하여 막 펠렛을 10 mL의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁합니다.

막 현탁액 900 µL를 1.5 mL 폴리 원심분리 튜브에 분취합니다. 그런 다음, 각각 새로 조제한 계면활성제 100 µL를 해당 1.5 mL 튜브에 넣고 4 °C에서 완만하게 교반하며 배양합니다. 한 시간 후, 벤치탑 초원심분리기를 사용하여 계면활성제 및 가용성 분획을 펠렛화하며, 이때 튜브가 최소 절반 이상 채워져 있는지 확인하고 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 또는 FEC 분석을 위해 상층액을 보관합니다.

다음으로, 넓은 분획 범위를 가진 equator 크기 배제 컬럼을 분당 0.3 milliliters의 유속으로 흐르는 버퍼를 사용하여 평형화합니다. 그 후, 동일한 유속으로 가용화된 막 샘플 100 microliters를 컬럼에 주입하고 형광 광학 장치를 사용하여 용출 프로파일을 모니터링합니다. 마지막으로, 용출 부피와 형광 강도 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 가져와 그래프로 표시하고, 남은 가용화 막 물질을 인젤 형광 분석으로 분석합니다.

앞서 입증한 바와 같이, 해당 단백질 가족은 박테리아의 세포 분열에 필수적입니다. 이 이미지들은 해당 컨스트럭트 중 24/47개에 대한 대표적인 겔 형광 시각화 결과를 보여줍니다. 밴드의 강도는 발현 수준을 나타냅니다.

예를 들어, lane scene four의 융합 단백질은 두 균주 모두에서 잘 발현되었습니다. 하지만 낮은 분자량의 밴드가 추가로 나타나는 것은 많은 lane에서 단백질이 부분적으로 분해되었음을 시사합니다. GFP 단독 크기에 해당하는 밴드가 관찰됩니다.

예를 들어, C 41 DE 3 PLyS 균주에서는 G 4와 H 4가 완전히 분해되어 유리 GFP 상태로 존재합니다. 반면 LEMO 21 DE 3에서는 이 그래프들에서 일부 온전한 단백질이 관찰됩니다. 1차 스크리닝에서 우수한 성능을 보인 두 가지 컨스트럭트를 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과, 테스트한 4가지 계면활성제 중 어느 것을 사용하느냐에 따라 단백질의 거동이 어떻게 달라지는지 알 수 있습니다.

예를 들어, 이 단백질은 Dool Multiside에서 응집이 거의 없는 대칭형 피크만을 나타내어, 이후 정제 과정에서 해당 계면활성제가 선택되었습니다. 반면, 다른 융합 단백질은 테스트한 모든 계면활성제에서 유사한 프로필을 보였습니다. 이 프로토콜은 예를 들어, 서로 다른 발현 조건에서 배양된 다양한 e coli 균주와 1차 및 2차 스크리닝의 추가 계면활성제를 포함하도록 쉽게 확장할 수 있습니다.

요약하자면, 이 프로토콜의 주요 목적은 다수의 막 단백질을 대상으로 발현 및 가용화 효율을 스크리닝하여 추가 분석을 위한 후보 물질을 발굴하는 것입니다.