쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스 모델의 해마에서 수지상 가지화의 정도를 연구하는 것입니다. 이것은 두 가지 다른 방법을 통해 달성됩니다. 첫 번째 방법에서는 수상돌기를 각 섹션의 전체 두께에 걸쳐 실시간으로 수동으로 추적합니다.

추적 후 전체 수지상 나무를 재구성하고 분석할 수 있습니다. 팬 다이어그램을 사용하여 서로 다른 마우스에서 파생된 다양한 팬 다이어그램의 분석을 객관적인 비교 수단으로 사용할 수 있습니다. 두 번째 방법은 확장된 피사계 심도 이미징을 통해 수지상 수목화를 시각화하는 것입니다.

마지막으로, 파노라마 방법을 사용하여 다수의 고배율 이미지를 함께 스티칭하여 전체 관심 영역에서 수상돌기의 정성적 및 정량적 평가를 위한 하나의 고해상도 복합 이미지를 생성하고, 이러한 절차를 시연하는 것은 GI mobi가 될 것입니다. AMI 연구는 제 연구실에서 진행됩니다. 기존 금속에 비해 이러한 기술의 주요 장점은 사용의 용이성과 수집 및 데이터 수집 속도입니다.

이 방법은 영향을 받은 뇌 영역의 수지상 형성 평가 및 수상돌기에 대한 다양한 치료법의 효과 평가와 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차에서는 마우스 뇌가 4% 파라폼 알데히드에 고정된 후 하루 후에 섭씨 4도에서 48시간 동안 탈수를 위해 자당 용액에 넣습니다. 자당에서 뇌를 제거하고 드라이 아이스 위에 놓인 구리 블록에 직접 놓습니다.

블록을 OCT로 채우고 후각구를 랜드마크로 사용하여 뇌의 방향을 표시합니다. 저온 유지 장치를 사용하여 섭씨 마이너스 20도에서 70미크론 두께의 절편을 절단하고 동결 보호 용액에 넣고 사용할 때까지 섭씨 마이너스 20도를 유지합니다. 메탄올에 든 과산화수소에 절편을 실온에서 30분 동안 배양한 다음 TBS에서 섭씨 37도에서 30분 동안 예열합니다.

0.3% Triton 및 Normal Horse 혈청으로 절편을 실온에서 45분 동안 배양한 후 다음 날 DCX 항체로 염색합니다. TBS에서 절편을 3회 연속 세척하고 실온에서 2시간 동안 비오틴화 말 antigo로 절편을 배양합니다. TBS에서 각각 10분씩 세 번 연속으로 세척하고 B, C 조명으로 1.5시간 동안 배양합니다.

실온에서 DAB 용액에 과산화수소를 첨가하고 이 용액에서 즉시 절편을 5분 동안 배양한 후 얼음처럼 차가운 TBS로 3회 세척한 후 1회 세척하여 반응을 종료합니다. 실온에서 TT BS로 세탁하십시오. 일련의 에탄올 용액을 사용하여 섹션을 탈수합니다.

각 5 분, 클리어와 자일 렌, 그리고 DPX를 사용하여 슬립을 커버합니다. 섹션이 완전히 건조된 후 날카로운 날로 슬라이드 표면의 여분의 DPX를 청소하고 현미경의 스캐닝 스테이지에 한 번에 하나씩 놓습니다. 시각화 시스템은 스캐닝 스테이지 조이스틱이 장착된 현미경과 12비트 컬러 카메라로 구성됩니다.

그런 다음 neuro lucita 프로그램을 시작하고 새 데이터 파일을 엽니다. 마우스 포인터로 아무 곳이나 클릭하여 화면에 참조 점을 배치하면 프로그램 창의 도구 패널에서 모든 아이콘이 활성화됩니다. 그런 다음 도구 모음에서 조이스틱 무료 아이콘을 클릭하고 조이스틱을 사용하여 해마의 치상 회랑을 찾습니다.

프로그램 창의 도구 탭에 있는 첫 번째 섹션에서 serial section manager를 선택합니다. 창의 왼쪽 하단 모서리에 있는 새 섹션 아이콘을 클릭하여 직렬 섹션 설정 창을 엽니다. 그런 다음 직렬 섹션 설정 창을 선택하고 해마 영역이 포함된 총 섹션 수를 입력합니다.

그런 다음 평가 간격을 선택하고 단면의 두께를 입력합니다. 도구 모음에서 자유형 윤곽선 그리기 아이콘을 클릭하여 치열 이랑 영역 추적을 시작합니다. 그런 다음 치열 과립 세포층의 윤곽을 그립니다.

확대 메뉴에서 100배를 선택합니다. 그런 다음 섹션에 이머젼 오일 한 방울을 추가하고 대물렌즈를 100x로 전환합니다. 이 목표 아래에서 치상 과립 세포체와 수상돌기를 찾습니다.

그런 다음 선택한 뉴런에 초점을 맞추고 뉴런 추적 아이콘을 클릭합니다. 도구 모음에서 치상 과립 세포체의 둘레를 추적합니다. 추적이 완료되면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 Finish cell body를 선택합니다.

이제 수동으로 그리고 X, Y 및 Z 방향 수상돌기 추적을 시작하고 조이스틱 및 Z 모터 노브를 사용하여 각 분기를 따릅니다.분기 또는 삼분기 노드에서 해당 옵션을 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 각 분기의 끝에 있는 이러한 노드에서 발생하는 각 분기를 추적합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 ending을 선택합니다.

소프트웨어 창에서 화살표 키 아이콘을 사용합니다. 다른 치열 과립 세포를 무작위로 선택하고 방금 설명한 대로 추적 절차를 반복합니다. 전체 추적을 저장합니다.

이제 뉴런 분석을 위한 neuro lucita explorer를 시작합니다. 실험 그룹의 첫 번째 마우스에서 첫 번째 NRX 데이터 파일을 엽니다. 실험 그룹의 두 번째 마우스의 NRX 파일을 추가하고 이 그룹의 모든 NRX 파일이 추가될 때까지 계속합니다.

분석 탭에서 fan in diagram을 선택하여 fan in analysis 창을 열고, dendrites를 선택하고, 이 마우스 그룹에 대한 dendrites의 링크 및 분기 패턴에 대한 표시를 클릭합니다. 이 절차에서는 현미경을 디지털 카메라에 연결합니다. 현미경에 연결된 스캐닝 스테이지에 섹션을 놓고 10 x 대물렌즈로 전환합니다.

그런 다음 스테이지를 관심 영역으로 이동합니다. 비디오 캡처 프로그램을 시작하고 녹화 버튼을 누릅니다. 녹화 버튼을 누르자마자 매크로 초점 노브를 사용하여 총 4초 동안 섹션의 상단에서 하단으로 이동합니다 결과 비디오 파일을 저장하기 전에 이제 Image J 프리웨어를 사용하여 VI 비디오 파일을 압축되지 않은 형식으로 변환합니다.

이미지 분석 프로그램을 시작하고 VI 파일을 엽니다. 프로세스 메뉴로 이동하여 확장된 피사계 심도를 클릭합니다. 출력 옵션에서 해당 비디오 파일을 선택합니다.

초점 분석 옵션에서 Generate composite best focus image(복합 최적 초점 이미지 생성)를 선택합니다. normalized illumination 및 max local contrast 옵션을 선택합니다. 그런 다음 create를 클릭하여 Z축 전체에 걸쳐 초점이 맞춰진 모든 픽셀을 나타내는 결과 이미지를 생성합니다.

그런 다음 결과 이미지를 저장합니다. 이 단계에서는 현미경에 연결된 스캐닝 스테이지에 섹션을 배치합니다. 스테이지를 관심 영역으로 이동합니다.

그런 다음 10 x 대물렌즈를 사용하여 이미지 획득 프로그램을 시작하고, 관심 영역에서 고해상도 이미지를 획득 및 저장하여 이미지 간에 최소 10%의 겹침이 있는지 확인합니다. 그런 다음 이미지 합성 편집기를 실행하여 나중에 이미지를 스티칭합니다. 파일 메뉴로 이동하여 새 파노라마를 클릭합니다.

이미지가 저장된 폴더를 선택합니다. 그런 다음 동일한 영역에 속하는 이미지를 선택하고 확인을 누릅니다. 디스크로 내보내기 버튼을 누르고 이미지를 저장합니다.

이 이미지는 분석에 사용할 수 있는 관심 영역에 대한 매우 높은 해상도의 그림을 나타냅니다. 이 그림은 EDFI 방법을 사용하거나 사용하지 않은 수지상 수목화의 시각화를 보여줍니다. 최상의 초점 평면을 찾는 전통적인 방법은 EDFI 및 훨씬 더 높은 수지상 면적 값과 비교되었습니다.

EDFI 방법을 사용하여 찾았습니다. 서로 다른 분기 순서에서 수상돌기가 차지하는 길이와 부피의 정량화가 여기에 나와 있습니다. 최대 길이와 부피는 순서대로 달성되었습니다.

다음은 치열 과립 세포의 수지상 길이에 대한 히스토그램입니다. DCX 염색 DDR의 수지상 세그먼트의 대부분은 길이가 13-26이었습니다. 이 빨간색 점선은 이 절차에 따라 제시된 데이터의 정규 분포를 나타냅니다.

neuro Lucid와 같은 다른 고전적인 방법을 사용하여 수상돌기가 차지하는 부피와 면적에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 여기에서 보여드린 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 뉴런 구조의 변화를 평가하는 것뿐만 아니라 두꺼운 뇌 절편에서 미세아교세포와 같은 비뉴런 소구조를 평가하는 데 큰 도움이 될 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 비교적 짧은 시간 내에 뉴런 투영의 범위를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.