Name: 쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 학습하세요 쥐 해마 치아이랑에서 수지상 가지화를 평가하는 실시간 추적 및 확장 심도 영상법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 신경생물학 연구에서 신경 구조의 정량적 분석을 가능하게 합니다.

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이 연구는 LuMind Foundation, Research Down Syndrome 및 Alzheimer's Association(AS)의 보조금으로 지원되었습니다. CP는 Arkansas State University의 College of Nursing and Health Professions의 교수진 개발 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

참고 : 실험은 재향 군인 팔로 알토 보건 의료 시스템에서 동물 연구위원회의 승인을 윤리적 기준에 따라 수행되었다. 1. 골지 - 콕스 염색 <ol><li> 뇌 적출 염색 <ol><li> 1 일에 깊이 일어난 과다 출혈를 통해 안락사 전에 100 ㎎ / kg 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진 (xylazine)와 쥐를 마취. </li><li> 조심스럽게 두 개관을 제거하고 뇌를 해부. <ol><li> 제 소뇌의 상부에 만곡 시저를 배치, 두개골 위에 피부를 제거하고 부드럽게 후각 망울 향하는 방향으로 이동하는, 외측 지적 시저의 끝 중앙 고랑에 두 개관 평행 통해 잘라. 양쪽에이 과정을 반복합니다. </li><li> 후각 전구쪽으로 선회하면서 두 개관을 들어 올려 끊다 수술 pincet을 사용합니다. 그런 다음, 거꾸로 두개골을 뒤집어 광학 통해 잘라 픽업을 사용하여신경과 뇌를 풉니 다. 마지막으로, 난원 매그넘의 수준에서 척수에서 뇌를 분리 픽업을 사용한다. </li></ol></li><li> 즉시 시판, 희석 골지 - 콕스 솔루션의 15 ml의 뇌를 체험. 실온에서 어두운 곳에서 캡핑 된 20 ㎖의 유리 병에서 골지체 용액 뇌 보관. </li><li> 둘째 날, 천천히 솔루션을 부어 15 ml의 신선한 골지 - 콕스 솔루션으로 교체. 뇌가 들어있는 병을 요점을 되풀이하고 어둠 속에서 또 다른 구일에 대한 방해받지 둡니다. </li></ol></li><li> 단면 및 매립 <ol><li> 11 일에, 탈수 DDH 2 O에서 제조 된 30 % 자당 용액에 머리를 놓으십시오. 12시간 후 새로 제조 한 30 % 자당과 솔루션을 변경합니다. 4 ° C에서 3 일간 30 % 자당 용액에 머리를 품어. </li><li> 블레이드가 덮여 때까지 14 일에, 30 % 자당 용액에 vibratome의 저수지를 입력합니다. 1m에 속도를 설정합니다m / s의 0.95 mm의 진폭. </li><li> 과도한 습기를 제거하고 coronally 잘라 면도날을 사용하여 소뇌를 제거 킴과 머리를시킨다. </li><li> 단단히 superglue를 사용하여에 vibratome 플랫폼으로 전체 뇌를 탑재하고 2-4 분 동안 설정할 수 있습니다. 저수지에 부착 된 뇌와 플랫폼을 삽입하고 뇌의 정상에 블레이드를 조정합니다. </li><li> 에 vibratome를 사용하여, 모든 3 뇌 후 블레이드를 변경 기억, 실온에서 150 μm의 두께 섹션으로 뇌 슬라이스. </li><li> 작은 끝이 브러시를 사용하여 저수지에서 섹션을 들고 DDH 2 O.에서 만들어진 0.3 % 젤라틴을 포함하는 페트리 접시로 몰입 섹션을 배양 접시에 남아 있지만, 각각의 슬라이드에 0.5 ml의 0.3 % 젤라틴의 추가 확산 코트 superfrost + 슬라이드에 브러시를 사용합니다. </li><li> 조심스럽게 페트리 접시에서 침지 된 부분을 선택하고 젤라틴 슬라이드에 배치합니다. 에 의해 뇌 부분의 방향을그들의 측면에 아닌 꼭대기에 그들을 감동. </li><li> 약 10 분 후, 코팅은 조직이 완전히 건조 30 % 수크로오스 전에 섹션. 그 후 공기는 3 일간 슬라이드 랙에 어두운 곳에서 준비한 슬라이드를 건조. </li><li> DDH 2를 사용 O. 배일 시판의 10 배 희석하여 현상액 7-10 분 동안 솔루션을 개발하는 슬라이드를 담가. DDH 2 O.에서 슬라이드 3 회 씻어 </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 증류 DDH O.이 다시 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 에탄올 용액을 준비 </li><li> 10 분 각각에 대해 점점 더 높은 에탄올 솔루션에 슬라이드를 만끽. </li><li> 10 분마다 100 % 에탄올 용액을 3 번 슬라이드를 담근다. </li><li> 그들이 커버 미끄러 때까지 최종 솔루션에 섹션을 유지, 5 분마다 100 %에 크실렌 3 회 연속 슬라이드를 만끽 해보세요. </li><li> DPX (크실렌 디 -n- 부틸 프탈레이트) 매체를 장착 (AB의 충분한 양을 배치플라스틱 이전 피펫을 사용하여 각 슬라이드 아웃 1.5 mL)을 첨가 하였다. 조심스럽게 거품을 방지하기 위해 커버 슬립을 배치합니다. </li><li> 공기 건조 커버 미끄러 뇌 섹션 수평으로 3 일 동안. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin 염색 <ol><li> 깊이 (1.1.1 참조) 동물을 마취. </li><li> 인산 버퍼 (12)에 만든 갓 준비 4 % 파라 포름 알데히드와 심장 관류를 수행합니다. </li><li> 흔들 통에 밤새 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드의 45 ml의의 두뇌 (1.1.2 참조) 및 저장 압축을 풉니 다. </li><li> 30 % 자당 용액에 머리를 전송하고 4 ℃에서 48 시간 동안 완전한 탈수 기다립니다. 자당에서 뇌를 제거하고 드라이 아이스에 배치 구리 블록에 직접 배치합니다. </li><li> 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물과 블록을 작성하고 랜드 마크로서 후각 망울을 사용하여 뇌의 방향을 표시합니다. </li><li> 저온 유지 장치를 사용하여 -20 ºC에서 70 미크론 두께 부분을 잘라 놓습니다동결 방지제 용액 (0.05 M 인산 나트륨 완충액에서 25 % 에틸렌 글리콜 25 % 글리세롤, pH를 7.4)에 -20 ℃에서 사용할 때까지 유지한다. </li><li> 50 % 동결 방지제 50 % 메탄올 용액을 확인합니다. 이 용액에 0.5 % 과산화수소 (용적 / 용적)을 추가한다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션 부유 섹션. </li><li> 조직 학적 오븐에 배치하여 30 ~ 40 분 TBS에서 37 ºC (TBS 버퍼)의 따뜻한 섹션. </li><li> 면역 염색 전에 실온에서 45 분 동안 0.3 % 트리톤 3 % 정상 말 혈청 섹션을 인큐베이션. 0.3 % 트리톤 1 % 정상 말의 혈청 TBS 500 : 밤새 일을 희석 DCX 항체의 3 ㎖ 용액에 4 ºC에서 섹션을 품어. </li><li> 다음 날은 TBS에서 섹션을 (10 분마다)를 연속 3 회 반복한다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 (TBS 200 1) 바이오틴 말 방지 염소와 섹션을 품어. TBS에서 섹션을 (10 분마다)를 연속 3 회 반복한다. </li><li> t을 품어실온에서 1.5 시간 동안 : ABC 라이트 (1,000 일)와 밑단. </li><li> 2 O 2 DAB 10 mg을 1 M 트리스 - 염산 (PH 7.6) 15 ㎖에 용해 (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) 솔루션 중 하나 태블릿에 30 % H의 5 μl를 추가합니다. 5 분 동안이 솔루션에 즉시 섹션을 품어. </li><li> 빙냉 TBS 실온에서 TBS에서 세척 한 다음에 세 번 세척하게하여 반응을 정지. </li><li> 크실렌 맑은 에탄올 용액의 시리즈 (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 5 분마다)를 이용하여 부분을 탈수하고, 단계 1.3에서와 같이 DPX를 사용하여 슬립 커버. </li></ol> 3. 시각화 <ol><li> 섹션의 완전한 건조에 이어, 날카로운 블레이드와 슬라이드의 상단에 초과 DPX를 제거하고 현미경 스캐닝 스테이지에 배치합니다. 스캐닝 시스템은 스테이지, 조이스틱, 및 12 비트 컬러 카메라가 장착 된 현미경으로 구성된다. </li><li> 프로그램을 시작합니다. 새로운 데이터 파일을 엽니 다. </li><li> 장소임의의 장소에서 마우스 포인터를 클릭하면 화면상의 기준점. 이 프로그램 윈도우의 도구 패널에서 모든 아이콘이 활성화됩니다. </li><li> 도구 모음에서 &quot;조이스틱 무료&quot;아이콘을 클릭 한 다음 첫 번째 섹션에서 해마의 치아 이랑의 위치를​​ 조이스틱을 사용합니다. </li><li> 프로그램 창의 &#39;도구&#39;탭에서 &quot;직렬 과장&quot;을 선택합니다. 윈도우의 왼쪽 하단에 &quot;새 절&quot;아이콘을 클릭합니다. 이것은 &quot;직렬 섹션 설정&quot;창이 열립니다. </li><li> 직렬 제 설정 창을 선택하고 해마 영역을 포함하는 섹션의 총 수를 입력합니다. 평가 간격을 선택합니다. 섹션 절단 두께 (DCX 70 μm의 골지 염색 섹션 150 μm의)를 입력합니다. </li><li> 도구 모음에서 &quot;프리 핸드 윤곽선 그리기&quot;아이콘을 클릭하여 치아 이랑 (dentate gyrus) 영역을 추적을 시작합니다. 이가있는 과립 세포층 개요. &lt;/ 리&gt; <li> &quot;확대&quot;메뉴에서 &quot;100 배&quot;를 선택합니다. 섹션에 침지 기름 한 방울을 추가하고 100X에 목표를 전환합니다. 이러한 목표 아래 이가있는 과립 세포 기관과 수상 돌기를 찾습니다. </li><li> 선택된 신경 세포에 초점 도구 모음에서 &quot;신경 추적&quot;아이콘을 클릭합니다. 이가있는 과립 전지 본체의 원주를 추적. 추적이 완료되면 바로 &quot;마침 셀 바디&quot;를 선택합니다. </li><li> x, y 및 z 방향에서 수동 수지상 추적을 시작하고, 조이스틱 및 Z 모터 노브를 사용하여 각 지점을 따른다. 분기 또는 삼 분기 노드에서 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭시 드롭 다운 메뉴에서 해당 옵션을 선택합니다. 이러한 노드에서 발생하는 각 분기를 추적합니다. 각 지점의 끝에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 &quot;종료&quot;를 선택합니다. </li><li> 프로그램 창의 화살표 키 아이콘을 사용하여 무작위로 다른 이가 과립 셀을 선택하고 대하여 descr와 동일한 절차를 따라단계 3.9-3.10에 ibed. 전체 추적을 저장합니다. </li><li> 신경 추적 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 실험 그룹의 첫 번째 마우스에서 첫 번째 NRX 데이터 파일을 엽니 다. 실험 집단의 두 번째 마우스의 NRX 파일을 추가합니다. 이 그룹의 모든 NRX 파일이 추가 될 때까지 계속합니다. </li><li> 분석 탭에서 &quot;팬에서 다이어그램&quot;을 선택합니다. 이 팬에서 분석 창을 엽니 다. 마크 &quot;수상 돌기&quot;을 확인하고 쥐의이 그룹 (그림 1)에 대한 수상 돌기의 길이와 분기 패턴을 묘사 표시를 클릭합니다. </li></ol> 4. EDFI 참고 :이 방법은 각 필드의 급속 Z 축 통해 다수의 이미지를 기록하고 Z 축에 걸쳐 모든 화소가 포함 포커싱 2D 화상을 생성하는 것을 가능. 결과는 수집 된 이미지에서 모든 초점을 맞춘 픽셀을 포함하는 합성 이미지 될 것입니다. <ol><li> 디지털 캠에 ​​현미경을 연결시대. 현미경에 연결된 스캔 무대에서 첫 번째 섹션을 배치하고 10 배 목표로 전환합니다. 관심의 영역으로 무대를 이동합니다. </li><li> 비디오 캡처 프로그램을 시작합니다. </li><li> 녹음 버튼을 누릅니다. 즉시 녹화 버튼을 누르면 같이, 4 초 총 부의 상단에서 하단으로 이동 매크로 포커스 노브를 사용. 결과 비디오 파일을 저장합니다. </li><li> 파일을 열고 파일 압축 형식으로 저장하여 비 압축 형식으로 AVI 비디오 파일을 변환 ImageJ에 프리웨어를 사용한다. </li><li> 이미지 분석 프로그램을 시작하고 AVI 파일을 엽니 다. &quot;프로세스&quot;메뉴로 가서 &quot;필드의 확장 깊이&quot;을 클릭합니다. 해당 비디오 파일을 선택합니다. &quot;출력&quot;옵션에서 &quot;복합 베스트 초점 이미지 생성&quot;을 선택합니다. </li><li> &quot;집중 분석&quot;옵션에서 &quot;표준화 된 조명&quot;과 &quot;최대 지역 대비&quot;옵션을 선택합니다. 그런 다음, &quot;Cre 호텔을 선택&quot;먹었다. 결과 이미지는 z 축에 걸쳐 모든 화소 포커스 (도 2)를 나타낸다. </li><li> 결과 이미지를 저장합니다. </li></ol> 5. 매우 높은 해상도 이미지를 생성 주 :이 방법은 사용자가 자동​​으로이 자동화 방식으로 저배율과 고배율 고해상도 이미지에서 매우 높은 해상도의 이미지를 생성 할 수있다. <ol><li> 현미경에 연결된 스캔 무대에서 첫 번째 섹션을 놓습니다. 현미경은 디지털 카메라에 접속된다. 관심의 영역으로 무대를 이동합니다. </li><li> 화상 취득 프로그램을 시작한다. </li><li> 10 배 목표를 사용하여 획득하고 10 % 이상 중복을 가지고 확인하는 관심 영역에서 높은 해상도 (3116 X 4076) 이미지를 저장합니다. </li><li> 실행 이미지 합성 편집기는 이미지를 스티치합니다. </li><li> 파일 (File) 메뉴로 이동하고, &quot;새 파노라마&quot;을 클릭합니다. 이미지 세인트 된 폴더를 선택OR 연산. 같은 지역하고 &quot;확인&quot;에 속하는 이미지를 선택합니다. </li><li> 보도는 &quot;수출 디스크에&quot;버튼을 누르면 이미지를 저장합니다. 이 이미지는 분석 및 / 또는 데모 (도 3)에 사용될 수있는 관심 영역의 매우 높은 해상도의 화상을 나타낸다. </li></ol>

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여기서 두 가지 방법 RTI와 EDFI와 함께 기존의 염색 방법을 사용하여 성숙하고 새로 태어난 뉴런의 수상 돌기 arborization의 정도를 정량화하는 기술되었다. 뉴런의 고해상도 영상의 획득은 차례로, 해마의 신경 세포를 표적 치료 전략을 평가하는 수단을 제공하며, 신경 퇴행성 장애의 해로운 영향을 테스트하기 위해 매우 유용한 방법을 제공한다. RTI의 방법은 심층 데이터 arborization 지형의 범위에 속하는 캡처하기 위해 이용되었지만, EDFI 방법은 개인 세그먼트 또는 나무의 복잡도에 관한 정보를 제공하지 못한다. 그럼에도 불구하고, EDFI 방법의 장점은 고가의 하드웨어의 구입을 요구하지 않으며, 시간이 덜 소모되고 있다는 사실에 놓여. 이미지 분석 프로그램이 비디오 파일에서 EDFI을 수행하는 데 사용 하였다. 높은 해상도와 빠른에 갖는 액세스카메라는 각 필드의 두께에 걸쳐 많은 수의 화상을 수집 할 수...

시냅스의 수와 구조의 동적 변경은 개발, 노화의 특징, 그리고 수많은 신경 퇴행성 질환 1-3. 시냅스 정보를 수신하고 통합하는 신경 세포의 능력은 돌기 형태와 시냅스 연결의 동적 변경에 따라 달라집니다. 실제로 양의 상관 관계는인지 기능 4에 영향을 모두 돌기 척추 및 시냅스 번호 사이에 존재합니다. 따라서, 수지상 척추 수의 감소가 돌기 척추 정량에 큰 관심을 자극, 신경 장애 5-7의 숫자에인지 기능 장애와 관련 된 것은 놀라운 일이 아니다. 그럼에도 불구하고, 척추 밀도 정량화 수지상 트리 걸쳐 시냅스의 지형 및 분배에 관한 유용한 정보를 생성하지 못하는 시간 소모적이고 지루한 작업이 남아있다. 다행히, 염색 방법 (예를 들어, 골지체 - 콕스와 doublecortin (DCX)) 함께정교한 영상 기술로 현재 장벽을 극복하고 신뢰성 있고 신속하게 수지상 arborization의 고해상도 이미지를 생성하기 위해 이용 될 수있다. 골지 - 콕스 염색 방법은 모든 뉴런 8 수지상 arborization의 상태를 평가하기 위해 배치 될 수 있지만, DCX는 신경이 모두 발생 주어진 특히 치아 이랑 (dentate gyrus)과 뇌실 영역 (9), 중요한 고려 사항에 새로 태어난 뉴런에 라벨을 배포 할 수 있습니다 수명 (10, 11)에 걸쳐이 지역. 염색 후, 두 개의 촬상 방법은 수지상 특성을 평가하기 위해 배치되었다 : ⅰ) 실시간 영상 (RTI) 및 필드 영상 (EDFI)의 Ⅱ) 확장 깊이. RTI의 기술은 추적 및 개별 수지상 세그먼트와 가지를 따라 arborization의 길이와 순서를 정량화 평균을 제공한다. 그러므로 그것은 전체 면적과 각 수지상 트리가 차지하는 부피를 추정을 가능하게한다. 이상의 S를pecifically, RTI의 방법에서 사용자는 연속 세그먼트를 식별하고 추적 소프트웨어 뉴​​런 수지상 구조의 X, Y, Z 좌표를 수집로 반복적으로 초점을 다시 맞 춥니 및 3D에 수지상 구조의 궤도를 재구성한다. 비교적, EDFI 방법은, 합성 화상을 생성하는 전체의 z 축에 대한 정보를 제공함으로써 다소 두꺼운 조직 표본에서 수지상 밀도를 평가하기위한 비교적 간단하고 신속한 방법을 제공한다. 이를 위해, 사용자는 단면의 두께에 걸쳐 고해상도 비디오 파일을 기록하고, 화소에 초점이 완전히 상기 점을 식별하는 비디오 프레임들을 검색하는 소프트웨어를 사용한다. 계속해서, 포커싱 된 화소가 병합 및 고해상도, 복합 2D 화상으로 통합된다. 이 합성 이미지에 관계없이 z 축에서 자신의 위치에 초점 있던 모든 픽셀이 포함되어 있습니다. 이러한 2 차원 영상의 정성 및 정량 분석​​은 밀도를 결정하기 위해 후속 적으로 사용될 수있다수지상의 필드마다 분파. 마지막으로, 관심의 전체 영역에서의 분석 및 평가를위한 수지상 매우 높은 해상도의 이미지를 생성하는 파노라마 방법을 제시한다. 이 기술은 매우 고해상 비싼 디지털 카메라에 대한 액세스의 부족을 극복하기 위해 배치 될 수있다. 이 방법을 사용하면, 하나가 X 축 및 Y 축을 따라 다른 위치에 일련의 이미지를 캡쳐 한 후 자동으로 함께 스티칭 프리웨어를 사용 (예를 들어, 이미지 합성의 편집자). 특히,이 방법은 다소 넓은 영역에서 수지상 arborization의 정량적 평가를 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>변형된 Golgi-cox 염색 용액&nbsp;</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>매장 4&deg; C 1x</td></tr><tr><td>개발 솔루션 (재고 10x)</td> <td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>매장 4&deg; C 30</td></tr><tr><td>% 자당을</td> 사용할 때까지, <td>시그마</td><td>CAS # 57-50-1</td>은 <td>신선하게 만듭니다 &nbsp; ddH2O</td></tr><tr><td>0.3% 젤라틴</td><td>시그마</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>등급 에탄올 용액 (20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95%. 100%)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX 중간</td><td>EMS&nbsp;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>Superfrost (+) 흰색</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>커버슬립 22x50mm (VWR #48393-059)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066</td><td>4</td></tr><tr><td>C DAB</td><td>Sigma</td><td>CAS 번호 91-95-2 &nbsp;</td><td>-20</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>트리스</td><td>시그마</td><td>CAS 번호 77-86-1 &nbsp;</td><td>해당 없음</td></tr><tr><td>ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>12비트 카메라&nbsp;</td><td>Q상상&nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida System</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>이미지 복합 편집기</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS 요소</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 arborization의 평가

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

수상돌기 가지화는 뉴런의 구조적, 기능적 무결성을 검사하기 위한 신뢰할 수 있는 마커로 나타났습니다. 실제로, 수지상 가지화의 복잡성과 정도는 이러한 세포의 시냅스 가소성과 잘 연관되어 있습니다. 이러한 구조에 대한 신경 장애의 해로운 영향을 특성화하고 치료 개입의 효과를 결정하기 위해 수지상 수목화를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법이 필요합니다. 그러나 이러한 구조를 정량화하는 것은 복잡하고 역동적인 특성을 감안할 때 만만치 않은 작업임이 입증되었습니다. 다행히도 정교한 이미징 기술을 기존의 염색 방법과 결합하여 수지상 수목 형성 상태를 평가할 수 있어 보다 신뢰할 수 있고 신속한 평가 수단을 제공할 수 있습니다. 다음은 야생형 마우스의 수지상 수목화를 특성화하기 위해 이러한 이미징 기술과 염색 방법을 결합한 방법의 예입니다. 이러한 보완적 이미징 방법은 해마 영역 내에서 다소 넓은 영역에 걸쳐 있는 수지상 수목화를 정성적 및 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

현존 및 새로 태어난 이가 과립 세포로부터 발생 arborization의 범위는 골지체 콕스 - 또는 DCX 염색법 (도 1)를 사용하여 야생형 마우스에서 분석 하였다. DCX 양성 세포 수지상 세그먼트는 13-36 미크론 긴 것으로 밝혀졌다. 수지상 길이의 정규 분포 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트하여 테스트 하였다 (D = 0.1217, P &lt;0.01, Liliefors의 p &lt;0.001;도 4 및도 5). arborization 순서 당 세그먼트 길이의 분석에서 가장 긴 세그먼트 arborization (38.38 + 1.45 μm의) 제의 순서로 나타났다. 비슷한 패턴은 표면 (111.98 + 3.93 평방 미크론) 및 볼륨 (27.93 + 1.03 입방 μm의)에 대한 발견되었다. 이러한 세그먼트에 의해 점유 된 세그먼트의 길이와 면적 및 / 또는 부피 사이의 선형 관계는 또한 시험 하였다...

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스 모델의 해마에서 수상돌기 분지(dendritic arborization)의 정도를 연구하는 것입니다. 이는 두 가지 서로 다른 방법을 통해 수행됩니다. 첫 번째 방법에서는 각 절편의 전체 두께에 걸쳐 수상돌기를 실시간으로 수동 추적합니다.추적 후에 전체 수상돌기 나무를 재구성하고 분석할 수 있습니다. 서로 다른 마우스에서 얻은 다양한 팬 다이어그램의 팬 다이어그램 분석을 이용하면 객관적인 비교 수단으로 사용할 수 있습니다. 두 번째 방법은 확장 초점 거리(extended depth of field) 이미징을 통해 수상돌기 분지화를 시각화하는 것입니다.마지막으로, 파노라마 방법을 사용하여 여러 개의 고배율 이미지를 하나로 병합함으로써, 관심 영역 전체의 수지상 돌기를 정성적 및 정량적으로 평가할 수 있는 하나의 고해상도 합성 이미지를 생성합니다. 이 절차는 본 연구실의 GI mobi. AMI 연구 워크플로우를 통해 입증될 것입니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술들의 주요 장점는 사용 편의성과 빠른 획득 및 데이터 수집 속도에 있습니다.이 방법은 영향을 받은 뇌 영역의 수지상 돌기 변화 평가 및 다양한 치료법이 수지상 돌기에 미치는 영향 평가와 같이 신경생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 본 절차에서는 4% Paraform aldehyde로 마우스 뇌를 고정한 하루 뒤, 탈수를 위해 4°C에서 48시간 동안 자당 용액에 넣어 둡니다. 자당 용액에서 뇌를 꺼내 드라이아이스 위에 놓인 구리 블록 위에 즉시 올립니다.블록을 OCT로 채우고 후각구(olfactory bulb)를 기준점으로 삼아 뇌의 방향을 표시합니다. 크라이오스탯(cryostat)을 사용하여 -20 °C에서 70 µm 두께의 절편을 제작한 후, Cryoprotectant 용액에 넣어 -20 °C에서 사용 시까지 보관합니다. 절편을 메탄올에 희석된 과산화수소에 넣고 상온에서 30분 동안 반응시킨 다음, TBS에서 37 °C로 30분간 가온합니다.다음 날 DCX 항체로 염색하기 전, 절편을 0.3% Triton과 정상 말 혈청(normal horse serum)이 포함된 용액에서 실온으로 45분 동안 배양합니다. 절편을 TBS로 3회 연속 세척하고, 비오틴화된 말 항- IgG(biotinylated horse anti- IgG)와 함께 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 절편을 TBS로 각각 10분씩 3회 연속 세척한 후, B, C light와 함께 1.5시간 동안 배양합니다.실온에서 DAB 용액에 과산화수소(hydrogen peroxide)를 첨가하고, 즉시 절편을 이 용액에서 5분 동안 배양한 후, 얼음처럼 차가운 TBS로 3회 세척하여 반응을 종료시킨다. 이어서 실온의 TTBS에서 1회 세척한다. 일련의 에탄올 용액을 사용하여 절편을 탈수시킨다.각각 5분 동안 투명제와 자일렌으로 처리한 후, DPX를 사용하여 커버슬립을 덮습니다. 절편이 완전히 건조되면, 슬라이드 표면에 묻은 과잉 DPX를 날카로운 칼날로 닦아내고 현미경의 스캐닝 스테이지에 하나씩 올립니다. 시각화 시스템은 스캐닝 스테이지 조이스틱과 12비트 컬러 카메라가 장착된 현미경으로 구성됩니다.다음으로, neuro lucita 프로그램을 시작하고 새 데이터 파일을 엽니다. 마우스 포인터로 화면의 아무 곳이나 클릭하여 기준점을 지정함으로써 프로그램 창의 도구 패널에 있는 모든 아이콘을 활성화합니다. 그런 다음 툴바에서 joystick free 아이콘을 클릭하고 조이스틱을 사용하여 해마의 치상회(dentate gyrus) 위치를 찾습니다.프로그램 창의 도구 탭의 첫 번째 섹션에서 연속 절편 관리자를 선택하십시오. 창의 왼쪽 하단에 있는 새 절편 아이콘을 클릭하여 연속 절편 설정 창을 엽니다. 그 다음, 연속 절편 설정 창을 선택하고 해마 영역이 포함된 총 절편 수를 입력하십시오.그 다음 평가 간격을 선택하고 절편의 두께를 입력하십시오. 도구 모음에서 자유 곡선 그리기 아이콘을 클릭하여 치상회 영역의 트레이싱을 시작하십시오. 이어서 치상 과립세포층의 외곽선을 그리십시오.배율 메뉴에서 100x를 선택하십시오. 그런 다음 절편 위에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨리고 대물렌즈를 100x로 전환하십시오. 이 대물렌즈 하에서 치상회 회색질 세포체와 수지상돌기를 찾으십시오.다음으로, 선택한 뉴런에 집중한 뒤 뉴런 트레이싱 아이콘을 클릭하십시오. 툴바를 사용하여 치상회 과립세포 세포체의 둘레를 트레이싱하십시오. 트레이싱을 마치면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 'Finish cell body'를 선택하십시오.이제 X, Y, Z 방향으로 수지상 돌기를 수동으로 추적하기 시작하며, 조이스틱과 Z축 모터 노브를 사용하여 각 가지를 따라갑니다. 분기점(bifurcation) 또는 삼분기점(trifurcation) 노드에서는 해당 옵션을 선택하십시오. 드롭다운 메뉴에서 이 노드들로부터 갈라져 나오는 각 가지를 추적하십시오. 각 가지의 끝에서는 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 종료(ending)를 선택하십시오.소프트웨어 창에 있는 화살표 키 아이콘을 사용하십시오. 다른 치상회 과립 세포를 무작위로 선택하고 방금 시연한 추적 절차를 반복하십시오. 전체 추적 내용을 저장하십시오.이제 뉴런 분석을 위해 Neuro Lucita Explorer를 실행하십시오. 실험군의 첫 번째 마우스에서 얻은 첫 번째 NRX 데이터 파일을 엽니다. 실험군의 두 번째 마우스 NRX 파일을 추가하고, 이 그룹의 모든 NRX 파일이 추가될 때까지 이 과정을 반복하십시오.분석 탭에서 다이어그램의 팬(fan)을 선택하여 팬 분석 창을 엽니다. 수지상 돌기(dendrites)를 체크하고 표시(display)를 클릭하여 해당 마우스 그룹의 수지상 돌기 연결 및 분지 패턴을 확인합니다. 이 과정에서 현미경을 디지털 카메라에 연결하십시오. 현미경에 연결된 스캐닝 스테이지 위에 절편을 놓고 10x 대물렌즈로 전환합니다.다음으로, 스테이지를 관심 영역으로 이동합니다. 비디오 캡처 프로그램을 실행하고 녹화 버튼을 누릅니다. 녹화 버튼을 누르는 즉시 매크로 초점 조절 다이얼을 사용하여 절편의 상단에서 하단까지 총 4초 동안 이동합니다. 결과 비디오 파일을 저장하기 전에, Image J 프리웨어를 사용하여 AVI 비디오 파일을 비압축 형식으로 변환합니다.이미지 분석 프로그램을 시작하고 VI 파일을 엽니다. 프로세스 메뉴로 이동하여 extended depth of field를 클릭합니다. 출력 옵션에서 해당 비디오 파일을 선택하십시오.초점 분석 옵션에서 composite best focus image 생성을 선택하십시오. normalized illumination 및 max local contrast 옵션을 선택하십시오. 그런 다음 create를 클릭하여 Z축 전체의 모든 초점이 맞은 픽셀을 나타내는 결과 이미지를 생성하십시오.그 후, 결과 이미지를 저장합니다. 이 단계에서는 현미경에 연결된 스캐닝 스테이지 위에 섹션을 놓습니다. 스테이지를 관심 영역으로 이동합니다.그런 다음 10배 대object를 사용하여 이미지 획득 프로그램을 시작하고, 관심 영역에서 고해상도 이미지를 획득하여 저장하되, 이미지 간에 최소 10%의 중첩 영역이 있도록 합니다. 그 후 이미지 컴포지트 에디터(Image Composite Editor)를 실행하여 이미지를 스티칭합니다. 파일 메뉴로 이동하여 새 파노라마(New Panorama)를 클릭하십시오.이미지가 저장된 폴더를 선택하십시오. 다음으로, 동일한 영역에 속하는 이미지들을 선택하고 확인(Okay)을 누르십시오. 디스크로 내보내기(export to disc) 버튼을 눌러 이미지를 저장하십시오.이 이미지는 분석에 사용할 수 있는 관심 영역의 초고해상도 사진입니다. 이 그림은 EDFI 방법의 적용 여부에 따른 수지상 돌기 분지(dendritic arborization)의 시각화 모습을 보여줍니다. 최적의 초점 평면을 찾는 기존 방식과 EDFI 방식을 비교한 결과, EDFI에서 수지상 돌기 면적 값이 유의미하게 더 높게 나타났습니다.EDFI 방법을 사용하여 분석 결과가 도출되었습니다. 서로 다른 분지 차수별로 수지상돌기가 차지하는 길이와 부피의 정량화 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 최대 길이와 부피는 1차 분지에서 나타났습니다.치상회 과립세포의 수지상 돌기 길이를 나타낸 히스토그램입니다. DCX 염색 DDRs의 수지상 돌기 분절 대부분의 길이는 13에서 26 사이였습니다. 이 빨간색 점선은 본 절차를 통해 제시된 데이터의 정규 분포를 나타냅니다.수상돌기가 차지하는 부피와 면적에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 neuro Lucid와 같은 다른 고전적인 방법들이 사용될 수 있습니다. 본 영상에서 보여드린 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 신경 구조의 상태를 평가할 뿐만 아니라, 두꺼운 뇌 절편 내의 미세아교세포와 같은 비신경성 소형 구조를 평가하는 데에도 큰 도움이 될 것입니다. 이 영상을 시청하신 후에는 비교적 짧은 시간 내에 신경 돌기의 범위를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

stereomicroscope 이하 성인 마우스에서 이가있는 이랑의 제거를위한 해부 기술이 비디오 녹화 프로토콜에서 시연되었다.

성인 마우스 Hippocampal 이가있는 이랑의 해부

우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하기 위해 면역 조직 화학 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은인지​​ 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에 적용될 수있다.

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

여기서 우리는 Golgi-Cox 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 신뢰할 수있는 조직 얼룩 방법은 최소한의 문제 해결과 함께 해마 및 전체 뇌에 걸쳐 cytoarchitecture의 높은 품질 평가를 허용합니다.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

이 프로토콜에는 생쥐에서 신뢰할 수 있는 HFS 메서드를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. Hippocampal가 뇌 전체 신경 전기 HFS 직접 및 간접적으로 비보에 의해 자극 된다. 신경 활동 및 분자 신호 검사 c-fos 와 Notch1 immunofluorescent 얼룩, 각각; 성체는 bromodeoxyuridine 분석 결과 라벨에 의해 정량 이다.

고주파 자극에 의해 마우스가 뇌의 활성화에 대 한 침략 적 방법

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

이것은 조직에 저산소 손상을 줄이기 위해 얼음 차가운 NMDG-aCSF와 함께 경내 관류 및 슬라이스 절단을 활용하는 성인 및 노화 마우스 해마의 급성 슬라이스 준비를위한 프로토콜입니다. 결과 슬라이스는 여러 시간 동안 건강하게 유지되며 장기 패치 클램프 및 필드 레코딩에 적합합니다.

성인과 노화 마우스에서 해마 조각에서 저산소증 최소화

우리는 마우스의 등간 중간 해마에서 급성 슬라이스를 준비하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 기록의 품질과 기록 된 뉴런의 형태학적 특징의 보존 측면에서 관상 슬라이스와이 트랜스 버사제 준비를 비교합니다.

성인 마우스의 덴테이트 자이루스에서 전신 기록 및 신경 재건을위한 등산 해마에서 급성 슬라이스의 준비

이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

해마의 치상이랑(dentate gyrus)은 학습과 기억에서 필수적이고 뚜렷한 기능을 수행합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스의 치상이랑에 있는 과립 세포의 생체 내 칼슘 이미징을 위한 일련의 강력하고 효율적인 절차를 설명합니다.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) 

학습하세요 쥐 해마 치아이랑에서 수지상 가지화를 평가하는 실시간 추적 및 확장 심도 영상법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 신경생물학 연구에서 신경 구조의 정량적 분석을 가능하게 합니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

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