마우스 리브를 절제하는 수술 : 대규모 긴 뼈 수리에 대한 모델

본 절차의 목적은 골격 재생 모델을 위해 갈비뼈의 골성 부위에 대규모 절제 부위를 만드는 것입니다. 이는 먼저 동물의 외측 피부에 절개창을 내고 여는 것으로 시작합니다. 두 번째 단계는 제거할 갈비뼈를 노출시키는 것입니다.

다음으로, 주변의 결합 조직 초 또는 골막과 함께 늑골의 일부를 제거하거나, 또는 골막을 그대로 남겨둔 채 제거합니다. 마지막 단계는 절개 부위를 봉합하고 동물이 회복하도록 하는 것입니다. 궁극적으로, 이 골 재생 모델은 대규모 골격 수복 과정 중에 발생하는 세포 및 분자적 사건을 보여주는 데 사용될 수 있습니다.

포유류의 경우, 수술 도구 조작에 정밀함이 요구되고 성공적인 수술을 위해서는 다양한 조직의 위치를 파악하는 것이 중요하므로 이 방법의 시각적 시연이 필수적입니다. 실험 절차 시연은 본 연구실의 대학원생인 Marissa Roar와 Nikita Tripper가 진행합니다. 수술 부위와 필요한 멸균 도구 및 소모품을 준비한 후, 4% isoflurane이 담긴 유도 챔버에 마우스를 넣어 마취를 유도합니다.

마우스가 마취되면 마우스의 눈에 연고를 바르고 마취 깊이를 확인합니다. 발가락 꼬집기 테스트를 수행했을 때 발가락 꼬집기에 반응이 없어야 합니다. 마우스를 해부 현미경 스테이지 위의 히팅 패드 위나 그 근처에 두고, 마취 유지 호스의 노즈 콘을 마우스의 코 위에 배치합니다.

마우스가 측면 자세를 유지하도록 합니다. 유지를 위해 이소플루란(isoflurane) 농도를 2~3%로 조정하고 호흡수를 관찰하십시오. 그런 다음 25게이지 바늘을 사용하여 부프레노르핀(buprenorphine)을 피하 주사합니다.

수술 후 통증 예방을 위해 다리가 떨릴 수 있으며, 이는 정상적인 반응입니다. 먼저, 1번으로 간주되는 가장 앞쪽 갈비뼈부터 촉진하여 원하는 갈비뼈를 선택하십시오. 본 영상에서는 10번 갈비뼈의 일부를 제거합니다.

늑골 위 부위를 면도한 후 포비돈 요오드로 세척하고, 이어서 이소프로판올로 3회 세척합니다. 적출할 늑골 위의 피부, 근육 및 지방층을 통해 2 cm 절개창을 만든 후, 절개 부위의 크기를 최소화하면서 수술 부위가 드러나도록 세 층의 조직을 리트랙터로 고정합니다. 그다음 5 mm 메스를 사용하여, 늑골의 곡률이 완만한 흉쇄관절(chocos joint)에서 근위측으로 5 mm 떨어진 지점의 늑간근을 절개합니다. 이어서 미세 팁 포셉을 사용하여 근육을 뼈에서 조심스럽게 분리합니다.

다음으로 동물의 골막을 유지하면서 절제 부위를 만들기 위해, 갈비뼈 길이를 따라 골막을 절개합니다. 그런 다음 미세 팁 포셉을 사용하여 하부 뼈로부터 섬세한 골막을 외측으로 매우 조심스럽게 분리합니다. 필요한 경우, 현미경의 눈금이나 자 형태의 게이지를 사용하여 절제 범위를 측정합니다.

그 다음, 정밀 미세 가위를 사용하여 뼈의 횡단면을 절개합니다. 한쪽 끝에서 뼈를 골막으로부터 조심스럽게 들어 올린 후, 즉시 반대쪽 끝을 절단합니다. 제거한 갈비뼈는 향후 분석을 위해 4%paraldehyde에 넣습니다.

뼈를 절단한 결과로 출혈이 발생하면, 면봉으로 절단된 끝부분을 4~5초 동안 압박하여 지혈합니다. 절개 부위를 닫으려면, 남은 골막 슬리브 윗부분의 늑간근을 3-0 또는 4-0 불연속 봉합사로 봉합합니다. 수술 위치의 표시가 되도록 봉합사를 갈비뼈 절단단 바로 위에 배치합니다.

리트랙터를 제거한 후, 그 위의 근육과 지방층을 9-0 비연속 봉합사로 봉합합니다. 근육이나 지방층이 특히 두꺼운 마우스의 경우에는 각 층을 개별적으로 봉합하십시오. 4~5개의 7-0 봉합사로 피부를 닫고, 조직 접착제로 절개 부위를 고정합니다.

큰 포셉으로 가장자리를 함께 집어줍니다. 이소플루레인 농도를 1%로 조절하여 몇 분간 서서히 낮춘 다음, 이소플루레인을 끕니다. 마우스를 가열 램프 아래에 두고 의식을 회복할 때까지 둡니다.

마우스가 의식을 회복한 후 회복기 내내 정상적으로 움직이고 보행하며, 고통의 징후를 보이지 않는지 확인해야 합니다. 절개 부위가 건조해지면, 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 깨끗한 케이지에 마우스를 수용하십시오. 암컷은 합사할 수 있으나, 수컷은 싸움을 방지하기 위해 단독 수용해야 합니다. 또한 48시간 동안 12시간마다 kg당 0.5 mg의 buprenorphine을 구강 제제로 투여하는 것을 포함하여 수술 후 통증 관리를 실시하십시오.

경구 투여는 흉부 부위에 통증을 유발할 수 있는 동물 보정이 필요하지 않습니다. 이 이미지는 수술 직후 수집된 4.5 millimeter 늑골 절제물을 보여줍니다. 뼈 파편이 남아 있지 않습니다.

시료를 zarin red로 염색한 후 80% glycerol로 투명화하였습니다. 화살표는 절단된 끝부분의 위치를 나타냅니다. 이것은 이전 이미지의 흉곽에서 골막이 제거된 상태로 분리해낸 갈비뼈 부분입니다.

여기 제시된 hematin 및 eoin 염색 조직 절편은 왼쪽의 노란색 화살표가 가리키는 바와 같이 뼈에 부착된 골막이 최소량이며, 오른쪽에는 골막이 없음을 보여줍니다. 노란색 별표는 골수강을 나타냅니다. 이 이미지는 골막이 여전히 부착된 상태로 제거된 갈비뼈 부분을 보여주며, 이 조직 절편은 노란색 대괄호로 표시된 것처럼 뼈를 덮고 있는 손상되지 않은 골막을 보여줍니다.

노란색 별표는 다시 한번 골수강을 나타냅니다. 이 이미지는 마우스 내에서 골막을 온전하게 유지한 채 절제 후 2개월 동안 치유시킨 골격 표본을 보여주며, 해당 부위가 완전히 회복된 것을 관찰할 수 있습니다. 방금 보여드린 골격 표본의 조직 절편에서는 층판골 벽과 골수강이 복원되었음을 확인할 수 있습니다.

이 이미지는 3개월의 치유 기간 후 골격 표본을 보여줍니다. 늑골 일부와 주변 골막을 제거한 후, 패널 왼쪽에 표시된 절단단에서는 최소한의 회복만 관찰되었습니다. 노란색 화살표는 흉쇄관절(chocos joint)을 가리킵니다.

이전에 보여준 골격 표본의 이 조직 절편은 절제 부위를 채우고 있는 육아 조직, 지방 조직 및 근육 세포를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 본 절차에 따라 적절히 수행했을 때 1시간 이내에 완료할 수 있습니다. 연골 부위의 갈비뼈에 절제 부위를 만드는 것과 같은 다른 방법들을 통해, 연골의 대규모 수복이 어떻게 일어나는가와 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 골격 재생을 연구하기 위해 갈비뼈의 뼈 부분에 절제 부위를 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.I.