배려의 아교 모세포종 표준의 맥락에서 입양 치료에 대한 자동차 T 세포의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 유전자 변형 키메라 항원 수용체 쥐 T 세포를 생성하고 표준 치료의 맥락에서 그 효능을 평가하는 것입니다. 높은 등급의 신경교종의 경우, 이는 먼저 표준 치료, 전뇌 방사선 및 생쥐에 대한 테모졸로마이드 투여를 시작함으로써 달성됩니다. 다음으로, 자동차 벡터를 발현하는 레트로바이러스를 생성하고, 그 다음에는 쥐 T 세포가 자동차 레트로바이러스와 함께 형질주입됩니다.

마지막으로, CAR T 세포는 표준 치료로 처리된 마우스에 전달되며, 궁극적으로 전뇌 방사선 조사 및 테모졸로마이드와 함께 CAR T 세포를 전달합니다. 투여는 표준 치료에 의한 숙주 조건화가 채택 T 세포 플랫폼의 효능을 향상시키는지 여부를 테스트하는 데 사용됩니다. 이 방법은 고급 신경교종에 대한 표준 치료의 맥락에서 새로운 면역 요법의 항종양 효능과 같은 뇌종양 면역 요법 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 고급 신경교종에 대한 유전자 변형 mi 및 T 세포의 효과에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 흑색종, 폐 및 기타 뇌 전이 종양 모델에 대한 T 세포 요법 평가와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이 절차를 여러 단계를 병렬로 수행해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

따라서 작업을 계획하고 구성하는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 Catherine Uni와 Carter s Deva, 둘 다 내 실험실의 재능있는 대학원생입니다. DMSO에서 테모졸로마이드 또는 TMZ의 밀리리터당 3밀리그램을 준비한 후, 용액을 물 비커에 넣고 섭씨 65도의 열판 위에 10-15분 동안 놓습니다.

TMZ가 완전히 용해되면 용액의 색이 옅은 노란색이 되어야 합니다. 15개의 1밀리리터 주사기에 TMZ 용액을 완전히 로드합니다. TMZ는 준비 후 90분 이내에 투여하여 TMZ가 용액에서 침전되어 X선 조사기에 전뇌 조사 전원을 수행하고 예열되도록 하고 적절한 필터가 제자리에 있는지 확인하고 적절한 볼륨을 입력하도록 해야 합니다.tage 및 전류 설정.

마우스가 진정되면 텍스트 프로토콜에 따라 진정된 마우스를 그리드에 놓고 머리는 X선 강도가 가장 높은 영역에 놓습니다. 납 튜브를 사용하여 목에서 아래로 신체를 차폐하여 전신 X선 전달을 차단합니다. X-ray 전달이 완료되면 마우스를 X-ray 기계 내부에 넣습니다.

조사기에서 동물을 제거하십시오. 동물이 충분한 의식을 회복하고 흉골 누운 자세를 유지하면 적절한 우리에 다시 넣으십시오. D 10 배지를 준비하고 텍스트 프로토콜에 따라 HEC 2 93 T 세포를 수확한 후, 10밀리리터의 D 10 배지를 포함하는 1610cm 폴리 L 라이신 코팅 플레이트에 각각 7.5 곱하기 10의 세포 현탁액 1ml

그리고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자동차 플라스미드 및 transfection 시약을 준비한 후 6-8시간 동안 HEC 2 93 T cell incubate에 지질 DNA 복합체를 적가합니다. 그런 다음 배지를 12ml의 새로운 T 세포 배지 또는 TCM으로 교체합니다. 다음으로, 70마이크로미터 메쉬 셀 스트레이너 위에 하나의 비장을 붓고 5밀리리터 주사기 내부의 뭉툭한 끝을 사용하여 단일 세포 현탁액을 생성하여 분해합니다.

TCM과 펠릿의 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 분혈 된 비장 인 새로운 TCM 풀을 준비 한 후, 세포는 비장 당 5 밀리리터의 1 x 용해 완충액을 사용하여 적혈구를 제거하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 잘 혼합된 세포를 재현 탁탁합니다. 세포 현탁액을 섭씨 37도의 수조에 5분 동안 놓습니다. 수조에서 용해 반응을 제거하고 용해 완충액과 일대일 비율로 TCM을 첨가하여 300Gs에서 10분 동안 회전하여 반응 세척을 중화합니다.

상등액을 흡인시킨 후 TCM의 비장당 2밀리리터를 사용하여 펠릿을 재현탁시키고, 세포를 계수하려면 190마이크로리터의 트리안 블루에 10마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 총 세포 수가 계산되면 코나 A 밀리리터당 2마이크로그램과 재조합 인간 인터루킨 2 밀리리터당 50 국제 단위가 보충된 TCM을 사용하여 세포를 10의 2배의 농도로 희석하여 밀리리터당 6번째 세포로 희석합니다. 24개의 잘 처리된 조직 배양 플레이트의 각 웰에 2밀리리터 또는 10의 4배를 추가하고 비장 절제술 다음 날 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소에서 밤새 배양합니다.

밀리리터당 25마이크로그램을 함유한 PBS를 준비합니다. 재조합 인간 피브로넥틴 단편 또는 RHFF 및 코팅 비조직 배양은 다음 날 각 웰에 0.5ml의 용액을 첨가하여 24개의 웰 플레이트를 처리했습니다. 웰에서 용액을 제거하고 PBS 인큐베이트에 2%BSA를 웰당 1밀리리터씩 첨가하여 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 2ml의 PBS를 세척하기 전에 플레이트를 단단히 뒤집어 BSA를 제거합니다. HEC 2 93 T 세포에서 바이러스 상등액을 채취한 후, RHFF 코팅된 웰 수와 동일한 밀리리터 단위의 최종 부피에 새로운 TCM을 추가하고 추가로 3밀리리터를 추가합니다. 배양기에서 배양된 비장 세포를 제거하고 각각 2-3회씩 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 서스펜션을 재생합니다.

세포 현탁액을 50 밀리리터 원추형 튜브로 잘 옮깁니다. 다음으로, 바이러스 상등액의 세포를 밀리리터당 6개의 세포에 1배의 10으로 재현탁합니다. 그런 다음 PLITE 현탁액의 웰당 1ml를 RHFF 코팅된 플레이트의 웰에 추가합니다.

이제 섭씨 32도, 770GS에서 90분 동안 가속 4와 브레이크 설정 0으로 회전하는 동안 플레이트를 회전시킵니다. TCM에서 재조합 인간 IL 2의 밀리리터당 50 국제 단위를 준비합니다. 탈수 후 플레이트의 각 웰에 배지 1ml를 추가하고 밤새 배양합니다.

T 세포가 80% 이상의 confluence에 도달하면 각 웰에서 2-3회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분할합니다. 그런 다음 각 웰에서 1밀리리터를 새로운 24웰 조직 배양 처리된 플레이트의 새 웰로 옮깁니다. 세포가 80% 이상의 합류점에 도달하지 않는 경우 각 웰 상단에서 1밀리리터의 배지를 천천히 피펫팅하여 배지의 절반을 변경하여 각 웰에 2개의 IL 밀리리터당 50 국제 단위를 포함하는 1밀리리터의 신선한 TCM으로 교체하고 부드럽게 피펫팅하여 2개의 재현탁 CAR T 세포를 재현탁시키고 각 웰에서 세 번 아래로 내리고 250ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

300GS에서 10분 동안 셀을 회전시킵니다. 다음으로, 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 완전히 흡입합니다. PBS를 사용하여 세포를 씻은 다음 두 번째 세척하기 전에 세십시오.

일반적인 CAR T-세포 수율은 PBS Resus를 사용하여 웰당 6번째 세포의 약 10배입니다. 종양이 있는 마우스에 주입하기 위해 200 마이크로리터 부피에서 1 곱하기 10 - 7 곱하기 주사를 위해 5 곱하기 10 밀리리터당 7번째 농도로 세포를 현탁시키고, 27 - 31 게이지 바늘을 사용하여 500 - 1000 마이크로리터를 인슐린 주사기에 장전하여 모든 거품이 배출되도록 합니다. CAR T 세포는 라인 줄기 세포 바이러스 또는 MSCV 긴 말단 반복을 포함하는 E GFR V 3 CAR 레트로바이러스 벡터를 통한 형질도입에 의해 생성되었습니다.

확장된 개그 영역과 엔벨로프 접합 부위 및 바이러스성 패키징 신호. 인간 안티 EEG FRV 3 단일 체인 가변 단편을 포함하는 EG FFR V 3 자동차. 1 39를 murine CD eight, tm CD 28 4 1 BBB 및 CD 3 zeta intracellular region과 함께 레트로바이러스 벡터로 클로닝하였다.형질도입 후, EG FFR V 3 CAR T cell은 STRT bico rine conjugated biotinylated로 구성된 2 색 패널을 사용하여 유세포 분석으로 정량화 및 표현형 분석을 통해 정량화하고 표현형을 분석 할 수 있습니다. 예를 들어 FFR V 3, 파생 된 multier 및 anti CD 3 fit C.이 비디오에 설명 된 프로토콜을 사용하여 자동차 발현은 CD 3 개의 양성 murine T cell의 55-70 %에서 일상적으로 관찰됩니다.

CAR T 세포는 본 예에서 볼 수 있는 바와 같이 2색 자동차 패널에 다른 형광 표지 항체를 첨가하여 추가로 표현형을 분석할 수 있으며, CD 8 및 CD 4에 대한 염색은 형질도입된 자동차의 70%가 CD 8 양성 T 세포이고 20%가 CD 4 양성 T 세포임을 보여줍니다. 이 기술은 이 절차에 따라 적절하게 수행되면 일주일 동안 12시간 내에 완료할 수 있습니다. 추가 질문에 답하기 위해 Elisa, Ellie spot 또는 세포 내 사이토카인 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

예를 들어, 키메라 항원 수용체가 형질도입된 T 세포가 항원 인식에 기능적으로 반응하고 그 기능은 항원 특이적입니까? 레트로바이러스, 테모졸로마이드 및 X선 방사선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 BSL에서 작동하는 것과 같은 충격이 있을 수 있음을 잊지 마십시오. 두 가지 조건, 개인 보호 장비를 착용하고, 지정된 지역에서 실험을 수행하고, 동물 취급에 대한 적절한 교육을 받아야 합니다.

그리고 이러한 절차를 수행하는 동안 항상 X-ray 장비를 사용해야 합니다.