Name: 재배 Heligmosomoides Polygyrus : 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 배우세요 Heligmosomoides polygyrus 기생충을 장기 배양하여 면역 억제 분비물을 수집하고 분석하는 방법입니다. 이 기술은 알레르기 및 자가면역 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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저자는 Edinburgh Clinical Academic Track(C.J.C.J.), Programme Grant(Y.H., and R.M.M.) 및 Fellowship(J.R.G) 기금, BBSRC(G.C.), American Asthma Foundation(E.R., H.J.McS. 및 R.M.M.), Asthma UK(H.J.McS.) 및 Rainin Foundation(D.J.S. 및 R.M.M.)을 통해 Wellcome Trust의 자금을 지원받습니다.

참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 영국 홈 오피스 에딘버러 수의학 대학에서 정한 지침에 따라 수행된다. 위관 마우스 1. 감염 <ol><li> 6 개월까지 4 ° C에서 증류수에 보관 Heligmosomoides polygyrus L3 유충. </li><li> 사용 전에 증류수에 L3 유충을 세 번 세척 : 원심 분리기 (브레이크) 10 분 300 XG에, 물을 제외한 모든 500 μl를 제거 (방해 펠렛 L3 유충을 피하기 위해) 및 펠릿 때마다 재현 탁. </li><li> 세 번째 세척의 경우, 그 구멍을 넓혀 200 μL 팁 컷 정확한 볼륨 (일반적으로 40 ml) 및 흡인 20 μl를 물을 추가합니다. (모바일 및 최적의 해부 현미경으로 50 배 확대하여 봅니다 보통) 60mm 배양 접시의 표면에 두 개의 20 μL 샘플을 놓고 L3 유충을 계산합니다. concentratio 증류수에 최종 펠렛을 재현 탁1 ㎖ 당 2,000 L3 유충의 명. </li><li> 라이프 사이클 생산을위한, 400 H. 8 주 된 F1 (C57BL / 6xCBA) 쥐를 감염 구강 투여에 의한 증류수 200 μL에 polygyrus L3 유충 (목덜미에 의해 수직 위치에 마우스를 억제하고 부드럽게 위장으로 입과 식도를 통해 무딘 위관 바늘을 통과). 선동 각각의 감염 (유충은 물에 빨리 정착) 및 흡인 1 ML의 주사기에 200 μL에 철저하게 사전; 끝이 둥근로 전용 위관 바늘을 사용합니다. 젊은 쥐의 실험 감염 (구 6~8주), 또는 다른 근친 균주 (예 : C57BL / 6 BALBc)의 경우, 200 L3 유충 쥐를 감염. </li></ol> 2. 전파 및 H. 유지 보수 polygyrus <ol><li> 대형 플라스틱 욕조의 중심에 숯을 넣고 차가운 수돗물을 최소 30 분을 위해 그것을 통해 실행 할 수 있습니다 (씻지 않은 활성탄 L3 유충에 독성). 욕조에서 물을 배출하고 t에 숯을 배치완전히 건조 될 때까지, 실내 공기에 노출 떠나는 흡수지 층, WO. </li><li> 계란이 필요한 경우 (필요한 경우 가위), 최초의 집게로 결장 중 대변을 다 쳤어요. L3 유충의 다수가 필요한 경우, 와이어 그리드에 마우스를 위치시키고 며칠 동안 분변 펠렛을 수집한다. </li><li> 다만 종이 필터에 부착 할 정도로 감쇠 일관성을 달성하기 위해, 한 적어도 하나의 비율로 과립 숯 대변 섞는다. 페트리 접시에 일부 젖은 필터 종이의 중앙에 얇게 바르고 습기 상자에이 배치 12-14일의 어둠 속에서 (일부 젖은 종이 타월과 물 접시를 추가). </li><li> 이후 7 일에서 L3 유충을 제거하고 용지가 폐기되기 전에 적어도 2 번의 그들을 수집합니다. 애벌레는 여과지의 가장자리 주위에 고리를 형성하고; 페트리 접시에서 필터 종이를 들어 올려 50 ㎖ 튜브에 (펫 및 플레이트 당 멸균 물 5ml를 사용하여) 판으로 남아있는 유충을 씻어. </li><li> 승강기및 여과지 오프 나머지 유충 50 ㎖ 튜브에 증류수를 플레이트에 남아 수확. 10 분 동안 300 XG에 유출 물 용액을 원심 분리기. 증류수로 유충을 세 번 세척하고 필요한 때까지 증류수 50 ml를 4 ° C에 저장합니다. 주 : 유생 생존을 유지하고, 적어도 6 개월 이상 감염성. </li></ol> 성인 H. 3. 컬렉션 polygyrus 웜 <ol><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 미리 변형 Baermann 준비 장치. </li><li> 십사일 감염 후 발췌 마우스. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 씻으십시오. 복부를 통해 피부를 잘라 전방 복벽을 공개 철수. 복강를 입력 정중선 절개를합니다. </li><li> (원위부 직장에 근위 십이지장에서) 전체 크고 작은 창자를 제거합니다. 건조 페트리 접시에 놓습니다. </li><li> 전체 길이를 따라 장을 직선화; 대변​​ 함유 대장을 절제; 나중에 계란 준비를위한 별도의 접시에이를 배치합니다. </li><li> 때문에 내 내강 벌레 십이지장 종종 붉은 모양의 비교적 두꺼운 벽에 의해 증명되는 어른 벌레가 포함되어 소장의 근위 20cm를 절제. 행크스 &#39;액 5 mL를 (100mm 직경) 페트리 접시에 놓고, 37 ° C (접시 당 두 개의 표본)로 가열. </li><li> 가위 (라운드 종료 가위이 가장 아르)와 종 방향 웜 가득 근위 창자 부분을 열고 웜을 제거하기 위해 두 개의 유리 슬라이드 라이닝 장 내부에 아래로 긁어. 그런 다음 깨끗한 창자 벽을 폐기합니다. </li><li> 작은 모슬린 가방에 팁 웜, 주식 폐쇄 및 유리 깔때기 (그림 1)의 가장자리 주위에 클립으로 고정합니다. </li><li> 행크스 &#39;솔루션으로 깔때기를 작성하고 각 깔때기에 웜의 약 4 페트리 접시를 추가합니다. </li><li> 1 ~ 2 시간 동안 37 ° C 배양기에 넣어 장치, 부드럽게 반까지 교반하면 빠지지모슬린 필터를 막다 수있는 장 준비에서 파편. 모슬린 가방 외부 이물질의 유출을 방지하기 위해주의 -이 최종 HES 제제의 오염의 원인이됩니다. 성인 웜 천천히 모슬린 천 통해 이주 및 유리 시험관의 하단에 정착한다. 조심스럽게 (이 시점에서 웜을 잃지 않도록주의하면서) 싱크를 통해 연결 고무 호스에서 테스트 튜브를 분리합니다. </li><li> 플라스틱 피펫을 사용하여, 50 ㎖ 튜브에 웜을 전송하고 씻어 여섯 번 행크스와 함께 &#39;솔루션 (웜 stripette와 미디어, 중력 침전 제거 할 수 있도록 허용, 추가 행크스의 40 ml의&#39;솔루션을 다섯 번 반복). 참고 : 웜 문화는 이후이 시점에서 멸균 보관해야합니다. <ol><li> 층류 후드로 이동 100 U / ml의 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 체외 문화에 대한 준비와 보충 멸균 행크스 &#39;솔루션에 다른 여섯 번 씻는다. </li></ol></li><li> 카운트그 구멍을 넓혀 노란색 팁 인하와 함께 찍은 20 μL의 두 샘플을 채취하여 복구 어른 벌레; 접종 유충의 양의 약 50 %를 기대합니다. </li></ol> 중간 준비, 성인 웜을 세척 4. HES에 대한 문화를 설정 <ol><li> RPMI의 약 10 ml의 3.11에서 벌레를 적시는 벌레가 완전히 덮여 수 있도록 각도로 튜브 휴식을 떠나, 20 분 동안 10 % 겐타 마이신으로 보충. </li><li> 층류 후드에서이 작업을 수행 행크스 &#39;솔루션 다시 여섯 번 씻어 (5 U 보충 / ㎖ 페니실린 및 5 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신). </li><li> H. 준비 polygrus 미디어. </li><li> 11.1 ml의 45 % 글루코오스 (최종 농도 RPMI1640 0.2 % 글루코스를 포함 1.2 %), 100 × Peniclllin - 스트렙토 마이신 (최종 농도 5 U / ㎖ 페니실린 5 ㎖를 넣고 500 RPMI1640 ml의, 층류 후드에서 무균 유지 5 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신), L 글루타민 5 ㎖ (2 mM의 최종 농도) 및겐타 마이신 5 ㎖ (최종 농도 1 %). FCS를 추가하지 마십시오. </li><li> 배출 T25 플라스크로 나누어지는 웜, 약. 15 ML의 H. 1,000 벌레 polygyrus 플라스크 당 미디어, 37 ° C 배양기 (5 % CO 2) 삼주에 대한 정직한 곳. </li></ol> HES 5. 준비 <ol><li> 문화의 24 시간 후 첫 컬렉션을 따로 설정, 두 번 일주일 이상 더 이상 간격으로 문화 문화 매체를 HES가 함유 수집 (때문에 LPS 오염 및 호스트 단백질의 높은 수준 - 개별적으로 처리하거나, 삭제할 수 있습니다). 별도의 명확 날짜 및 배치 번호가 표시 각각의 컬렉션을 유지합니다. H. 같은 부피로 교체 각 행사에 polygyrus 미디어. </li><li> 원심 5 분 동안 400 x g에서 미디어 HES가 함유. 이어서 50 ㎖ 튜브에 0.2 ㎛의 저 단백질 - 결합 필터를 통해 살균 필터. -20 ° C 냉장고에 보관 명확하게 HES (c)의 웜 수확의 날짜와 날짜 표시ollection. </li><li> 문화 HES 컬렉션 21 일 후, 벌레를 폐기합니다. </li><li> (보통 냉동 콘텐츠로부터, 상기 제 24 시간 컬렉션을 포함하지 않음), 및 질소 가압하에 한외 여과 장치에서의 필터 3000 MWCO를 통해 농축 HES 상청 500-1000 ml의 풀. 참고 : 필터 실행 건조 들어 가지 않도록주의해야합니다. <ol><li> 필터 장치를 설정 첫째 교반하면서 3 × 20 ​​분 동안 증류수 1 리터 비이커에 아래 3 kDa의 막 반짝이는면을 세척합니다. 필터 멤브레인 광택면을 위로하여 제조업체의 지침에 따라 한외 여과 장치를 조립합니다. 4 ° C에서 캐비닛의 장소 및 풀링 HES을 집중하기 시작하기 전에를 통해 증류수 50 ㎖를 전달합니다. </li><li> 볼륨이 2-5 ml의 농축 될 때까지 (하루에 100-140 ml)을 필요에 따라 여과 장치에 HES의 각 튜브를 추가합니다. </li></ol></li><li> 피라 50 ㎖를, HES - 함유 배지에서 오염물을 제거하기 위해서 추가PBS 및 여과 장치 및 ogen없는 한 다음 약 2 ㎖의 아래로 농축시킨다. 두 번이 단계 (총 PBS 150 ㎖)를 반복합니다. 층류 후드에서 15ml의 튜브 (0.2 μm의 필터) 필터 소독 HES로 옮기고, 분광 광도계 (10 E = 280) 또는 브래드 포드 분석법을 이용하여 단백질 농도를 측정한다. </li><li> 나누어지는, -80 ° C에서 배치 번호와 날짜, 동결 레이블. </li><li> 사용하기 전에 HES의 각 배치의 제조 업체의 프로토콜에 따라 발색 LAL 분석을 수행합니다. LPS 레벨은 1 μg의 단백질 당 1 U LPS보다 많은 경우, 생체 내 또는 시험 관내 실험 배양이 배치를 사용하는 것을 고려하지. </li><li> 별도로 동일하게 24 시간에 수집을 HES 방법; 적합하지 기능적 실험 그것이 모노클로 날 항체의 친 화성 정제에 의해 단리 될 수있다 개별 분자의 유용한 소스가있는 동안은, LPS 및 일부 숙주 단백질을 포함 할 것이다. </li></ol&gt;

저자에게는 이해 상충이 없습니다.

H.의 수명주기 안정적으로 일관된 방식으로 polygyrus 진행됩니다. 자연 섭취 또는 0 일에 L3 유충의 구강 투여 후, 낭종이 10 일에서 장 루멘으로 어른 벌레로 부상 한 후 유충의 moults로 진행하고, 5 일에 의해 십이지장 장막에서 형성되기 시작, 계란에서 대변에서 볼 수 있습니다 14 일 및 육아종 일 (21) 전술 (그림 6에 요약) 프로토콜에서 십이지장 장막 표면에 볼 수 있습니다 H.의 높은 처리량 생산 가능 미래의 실험 및 라이프 사이클 감염 가능한 L3 유충의 안정적인 복구에 추가 polygyrus의 배설-분비 제품 (HES). H.의 polygyrus 감염은 OVA 나 데르 P 1 (집 먼지 진드기 알레르기 항원) (14)에 따라 천식 모델에서 보호 될 것으로 나타났다. 또,기도 염증의 억제는 CD4 + CD25 +로 전송 될 수있다 </sup&gt; T 조절 세포는 14 또는 CD19 + CD23 하이 규제 B 세포로부터 24 H. 비 감응 polygyrus 쥐를 -infected. 자가 면역, H. 모델에서 polygyrus 감염은 다발성 경화증 (9)의 실험적인자가 면역성 뇌척수염 (EAE) 모델의 억제로 도시되었으며, 진압 감염된 마우스 (24)로부터 CD4 + T 세포 또는 CD19 + B 세포 중 하나와 함께 전송 될 수있다. 자극 (25) 수상 세포 반응성) 억제 CD4의 b) 유도 : Heligmosomoides polygyrus 배설-분비 제품 (HES)를 포함하여, 숙주 면역 반응을 조절하고 (도 7에서 설명하는) 다수의 메커니즘에 의해은 Th2 매개 염증 억제 + + Foxp3를 조절 T 세포 18. 및 c) IL-33의 생산 (20)의 봉쇄. 를 관리 할 때 HES가 보호 될 것으로 나타났다t 과민성 또는 도전 천식 (19)의 OVA-명반 모델 및 조기 IL-33 릴리스의 억제를 통해, 알터 추출물 알레르기 (20)와 비강 내 투여시. HES의 LPS 오염의 회피는 종종 미래의 면역 학적 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 여기에 설명 된 프로토콜,이 달성의 중요한 단계는 (2.10 참조)과 문화의 첫 24 시간을 제외 ES 솔루션을 설정하는 최종 HES 준비를 입력하지 않는 Baermann 장치의 모슬린 가방에 포함 된 그 파편을 보장하는 (5.1 참조). 최근 몇 년 동안, HES는 철저하게 26, 27 확인 된 370 별개의 단백질과 단백체 수준에서 특징으로하고있다. 또한, 제 4 단째는 유충 ES 프로테옴 분석 (28)에 실시되었다. 3의 계속 강하게 면역 원성 공지 HES의 주요 글리 칸 성분을 특성화 포함하고, 마이크로 RN 분비그는 50 ~ 100 nm의 소포 또는 엑소 좀 (벅 등., 게시를 위해 제출)에 캡슐화되어있다. 이 높은 면역 기생충에서, 그리고 HES의 분자 구성 요소를 식별하는 광범위한 단백체 데이터와 ES의 수집에 대한 재현성 프로토콜의 설립으로, 무대는 이제 식별 및 H.에서 개별 분자의 치료 테스트 설정 호스트 면역 체계에 중요한 영향을 중재 할 수 polygyrus.

Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간 선충 기생충 일에 관련되어 자연 쥐의 위장 기생충이다. 이러한 Nippostrongylus의 brasiliensis, H. 다른 선충 모델과는 대조적으로 polygyrus 일관는 숙주 면역 반응을 억제하는이 채용 여러 강력한 면역 조절 메커니즘의 직접적인 결과로 생쥐의 만성 감염을 확립한다. H.의 polygyrus은 직접 수명주기를 가지고 : 감염 L3 유충이 FECO 구강 전송 섭취 (또는 실험실 설정에서 구강 투여에 의해 관리), 그들은 같이 장 루멘으로 돌아 가기 전에 십이지장과 encyst의 장막 층으로 이주 그러자 약 팔일 초기 감염 후 성인 웜. 상대와 계란 생산은 10 일에 의해 발생하며 다에서 배설-분비 제품의 문화와 수집을위한 성인 벌레를 수확 할 수있다Y (14) 이후 3. H. polygyrus 또한 감염된 감염 마우스 4-6, 및 H.의 증가 수준에서 증가 유산균으로, 공생 미생물에 존재하는 상호 작용 유산균 6 마우스의 노출 다음 polygyrus 감염. H.와 활성 감염 polygyrus가 7-10 많은자가 면역 동물 모델에서 면역 병리에 대하여 보호하는 것으로 나타났다, 11, 12 및 알레르기 성 대장염 13-16. 결과적으로이 기생충의 아웃풋 - 분비 분자의 가능성에 큰 관심이있다 ( &quot;HES&quot;)는 생체 (17, 18)에서 병리학을 다운 조절합니다. 사실, 보호 효과는 이제 18, 20 확인되는 경로를 통해 HES 제품 (19)와 쥐의 치료 다음 볼 수 있습니다. 여기에서 우리는 그것의 분비 제품의 신뢰성 Heligmosomoides의 polygyrus의 생산 및 복구를 위해 프로토콜을 설명즉 추가의 생화학 적, 면역 기능의 조사 범위에 대해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Amicon 농축기</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>모델 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks의 완충염 용액</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>활성탄</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>포도당 용액</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% 용액 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Falcon 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 플라스크</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&nbsp;</td><td>25cm 통풍 플라스크 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>발색 LAL 분석</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 분석 http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; L-글루타민 없이 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

재배<em&gt; heligmosomoides polygyrus :</em&gt; 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides의 polygyrus (이전 Nematospiroides의 dubius로 알려져 있으며, 또한 H. bakeri 일부에 의해 참조) 밀접하게 쥐에 만성 감염을 설정하는 여러 면역 메커니즘을 고용하고 위장 기생충이 널리 인간의 기생충 감염과 유사하다. H. polygyrus는 기생충 유래 면역 조절 분야에서 광범위하게 연구되었고, 강력하게 (활성 감염 및 격리 분비 제품 모두) 알레르기와자가 면역의 실험 모델을 억제하는 것으로 확인되었습니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜은 H. 관리를 설명 자신의 배설-분비 제품 (HES)의 일관된 L3 유충의 생산, 성인 기생충의 복구 및 수집을위한 polygyrus 수명주기.

H. 감염에 대한 감수성 polygyrus는 마우스 균주 (표 1)의 유전 적 배경에 의해 고도로 제어되고; C57BL / 6 CBA 마우스는 21, 22, 매우 민감하다. 기생충의 라이프 사이클의 유지 관리를 위해,이 두 균주 사이의 F1 잡종 어느 모 균주에 비해 이환율 (과도한 장내 상피 손상)없이 훨씬 높은 웜 부담을 견딜 수있는 능력에 대해 선택되었다. 400 L3 유충의 구강 투여는 일반적으로 동형 접합 근친 균주의 실험 (예를 들어, C57BL / 6에 사용되는 200 L3 유충의 복용량 동안, (그림 2 성인 웜 부담의 결과로) F1 생쥐의 수명을 유지하는 데 사용됩니다 또는 BALBc). 그러나,이 용량은 장내 식물의 변화와 같은 동물 시설 사이에 다를 수 있습니다 환경 공동 요인에 따라 감소 될 필요가있다. HES의 일괄 재현 effi을 입증기능 분석에서 단백질 조성물 cacy; 배양의 각 연속 주에서 상등액 4 주 총까지 분석 한 결과 또한, 단백질 프로파일 (도 3) HES 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정 될 때. (5.5 참조) 매우 유사한 것으로 밝혀졌다, 총 단백질은 일반적으로 약 1 밀리그램 / ㎖ (그림 4)입니다. HES를 집중하는 다른 방법은 샘플 버퍼 염, 저 분자량 성분을 제거, 스윙 아웃 로터 원심 최대 4,000g에서 회전하는 원심 농축기 (예 VIVASPIN 3 kDa의 컷 - 오프 멤브레인)로된다. 원심 농도가 가장 작은 처리 볼륨 (1 ~ 10 ㎖)에 적합하고, 약 30 배의 최대 집중 계수로 제한됩니다. HES를 수집 할 때, 오염의 방지가 중요하다. 호스트 분자와 오염을 방지하기 위해, 우리는 HES-계속을 폐기마우스 소장에서 성인 웜 수확 후 첫 24 시간에서 문화 매체를 aining. 또한 발색성 LAL 분석 (5.7 참조​​) HES의 각 배치에 오염 LPS 레벨을 정량화. LPS의 1 U는 ~ 100 페이지 LPS 총점이 아래 수준은 23 무시할 간주됩니다. 우리의 손에, HES 대부분의 배치는이 한도가 크게, 0.23 U / μg의 인 HES의 LPS의 평균 농도 (그림 5)입니다. 병리학의 생체 내 모델에서 LPS의 효과는 (예를 들어 천식 반응의 억제) LPS (23)의 적어도 10 NG가 필요합니다. 따라서 100 페이지 LPS / μg의 HES와 배치에서 5 μg의 HES의 생체 관리 500 페이지의 LPS, 잘 아래 LPS가 문제가된다 유효 농도를 포함 할 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> 그림 1 : Baermann 장치 배어성인 H.의 수집을위한 MANN기구 설치 polygyrus (2 절에서 설명). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> 그림 2 : 14 일 400 L3 유충 평균 웜에 감염 후 평균 웜 부담은 14 일 400 L3 유충 감염 후 부담. 표시된 데이터 포인트는 C57BL / 6xCBA 마우스의 감염의 19 별도 라운드에서 있습니다. ± SEM이 표시 의미. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 문화의 주 연속 수집 HES 단백질의 문화 SDS-PAGE 프로필에 주 연속에서 HES의 단백질 프로파일. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> 그림 4 : </strong&gt; 500㎖의 ES-포함하는 배양 상층 액의 약 500 ml의에서 파생 된 11 가지 배치에서 HES 단백질의 미디어 수율에서 HES의 최종 수량. ± SEM이 표시 의미. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> 그림 5 : 리 물러의 ameobocyte 분석에 의해 측정 HES의 41 일괄 LPS 오염의 HES 수준의 LPS 오염. 중간 LPS 농도 = HES의 86 U 당 MG. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> 그림 6 : H. 애니메이션 회로도 HES의 분리에 애벌레와 어른 벌레의 회복을 통해 L3 유충의 구강 투여에서 키 수명주기 단계의 polygyrus 수명주기 개요. 그림 7 : HES와 그 기능 HES에 포함 된 수용성 매개체와 엑소 좀의 주요 면역 효과를 애니메이션 회로도. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 유전자형 (및 배경 균주) </td><td> 차 감염 표현형 </td><td> 참고 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 근친 균주 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> 매우 취약 </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6와 C57BL / 10 </td><td> 감수성 </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / C, DBA / 2, 129 / J </td><td> 중간의 </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </TD&gt; <td> 낮은 감수성 </td><td> (22), (32) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 사이토 카인 또는 사이토 카인 수용체 형질 </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> 더 취약 </td><td> (33) </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> 덜 영향 (a); 더 감수성의 변화 없지만 증가 육아종 (B) </td><td> (33) </td></tr><tr><td> (b) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ 유전자 변형 (C57BL / 6) </td><td> 저항하는 </td><td> (35) </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> 높은 생산력 </td><td> (36) </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 또는 BALB / c) </td><td> 매우 취약 </td><td> (22) </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c 또는 C57BL / 6) </td><td> 고도의 내성 </td><td> (37) </td></tr><tr><td> IL-9 형질 전환(FVB) </td><td> 저항하는 </td><td> (38) </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> 결핍은 Th2, 육아종 gormation 감소 </td><td> (39, 40) </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> 더 취약 </td><td> (33) </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> 감수성 변화 없음 </td><td> (33) </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> 높은 TH1, 감수성을 증가 </td><td> 41, 42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> T 세포 형질 전환 용 마커 </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> 변두리에 더 높은 생산력 </td><td> (43) </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> 높은 생산력 </td><td> (44) </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> 높은 생산력 및# 160; </td><td> (45) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 선천성 면역 궤적을위한 형질 전환 </td><td></td></tr><tr><td> 타입 1 인터페론 수용체 (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> 높은 생산력, 더 육아종 </td><td> (34) </td></tr><tr><td> 에서 MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> 더 많은 저항, 더 육아종 </td><td> (34) </td></tr><tr><td> C-KitW / 웨스트 버지니아 (WBB6) </td><td> 더 취약 </td><td> (46, 47) </td></tr></tbody></table> 표 1 : H.와 차 감염 유 전적으로 다른과 유전자 타겟으로 마우스 균주에 polygyrus.

Heligmosomoides의 polygyrus 밀접 높은 널리 인간의 기생충 감염의 것과 유사 강력한 면역 조절 기능이있는 쥐의 선충이다. 여기에서는 H.의 장기적인 유지 관리 프로토콜을 기술 polygyrus 라이프 사이클.

재배<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus :</em&gt; 면역 선충 기생충과 은닉하는 제품

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 숙주의 면역 반응을 억제하여 기생충의 생존을 가능하게 하는 장수 헬민스 기생충 분비 분자를 수집하고 분석하는 것입니다. 이는 먼저 기생충을 천연 서식지인 생쥐의 장관 내에서 배양함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 안락사 후 생쥐로부터 성숙한 기생충을 분리하는 것입니다.다음으로, 헬민스 기생충을 조직 배양 배지에서 3주 동안 배양하며, 이 기간 동안 기생충은 다량의 배설-분비(excretory, secretory) 또는 ES 분자를 방출합니다. 마지막 단계는 배양 상층액에서 방출된 분자들을 회수 및 농축하여 생물학적 및 생화학적 테스트를 위한 ES 배치로 만드는 것입니다. 최종적으로 농축된 상층액을 특정 세포 유형에 직접 처리하여 in vitro에서 면역 세포 기능의 변화를 연구하거나, 마우스에 투여하여 알레르기 및 기타 질환의 억제 능력을 테스트할 수 있습니다.우리는 면역 억제가 살아있는 기생충 감염과 연관되어 있다는 점에 주목하여, 살아있는 기생충으로부터 면역 억제 분자가 지속적으로 방출되고 있음을 확인하고 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 이 방법은 기생충 감염에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 우리가 발견한 면역 억제 분자들이 알레르기, 자가면역 질환 및 염증성 장질환과 같은 서구 사회의 주요 질병을 치료하는 데 매우 효과적일 가능성이 높다는 점을 시사합니다. 헬민스(helmuth) 기생충을 회수하고 처리하는 단계가 매우 전문적이며 특히 무균 배양 기술에 세심한 주의가 필요하므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.H. polyus의 생애 주기를 생산하기 위해 8주 된 F1 마우스에 구강 투여법으로 H. polyus 유충을 감염시킵니다. 동봉된 프로토콜에 설명된 대로 증류수 1mL당 2000마리가 되도록 H. polyus L3 유충을 준비합니다. 각 감염 전 마우스당 200µL 내에 400마리의 L3 유충이 포함되도록 투여합니다.1mL 시린지와 끝이 둥근 전용 가바지 바늘을 사용하여 유충 현탁액을 5회 반전시켜 혼합합니다. 유충 현탁액 200 µL를 흡입합니다. 구강 가바지를 수행하려면 마우스의 목덜미를 잡아 똑바로 세운 상태로 고정한 후, 뭉툭한 가바지 바늘을 입과 식도를 통해 위까지 조심스럽게 삽입합니다. 이후 마우스에서 성충 및 기생충 알을 회수합니다.감염 14일 후, 감염 14일 후. 여기에 제시된 방법으로 준비된 변형된 bayamon 장치를 사용하여 마우스로부터 성체 h polyus 충을 수집합니다. 이 절차를 시작하려면, 안락사시킨 동물의 복부를 70% ethanol로 세척하십시오.복부 피부를 절개하고 뒤로 젖혀 전복벽을 노출시킵니다. 정중선 절개를 통해 복강으로 진입합니다. 근위 십이지장부터 원위 직장까지 소장과 대장 전체를 제거합니다.이를 건조한 페트리 접시에 넣습니다. 분변이 포함된 결장 부위를 절제한 후, 장의 전체 길이를 따라 곧게 펴고, 나중에 알을 회수할 수 있도록 이를 별도의 접시에 담습니다. 다음으로, 성충이 포함된 소장의 근위부 20 centimeters를 확인합니다.십이지장은 벽이 상대적으로 두껍고, 관강 내의 기생충으로 인해 종종 붉은색을 띠는 것이 특징입니다. 소장의 이 부분을 절제하여 5 mL의 Hank's solution이 담긴 페트리 접시에 넣으십시오. 끝이 둥근 가위를 사용하여 37 °C로 가온하십시오.충체가 채워진 근위부 장 부분을 세로로 절개하고, 두 개의 유리 슬라이드로 장 내벽을 긁어내십시오. 충체를 분리하기 위해 깨끗한 장벽은 폐기하십시오. Hank's solution을 사용하여 깔때기를 구성하십시오.작은 머슬린 백의 입구를 스테이플러로 밀봉한 다음, 페트리 접시 2개에 들어 있는 벌레들을 백 안으로 옮겨 넣습니다. 유리 깔때기 하나당 두 개의 머슬린 백을 배치하고, 깔때기 가장자리를 따라 종이 클립으로 백을 고정합니다. 이 장치를 37 °C 인큐베이터에 1~2시간 동안 둡니다.배양 시간이 절반 정도 지났을 때, 머슬린 필터를 막을 수 있는 장내 표본의 찌꺼기를 제거하기 위해 장치를 부드럽게 흔들어 줍니다. 찌꺼기가 머슬린 백 외부로 쏟아지지 않도록 주의하십시오. 이는 최종 HES 표본 제작 시 오염의 원인이 됩니다. 배양이 끝나면, 플라스틱 피펫을 사용하여 싱크대 위에서 연결 고무 호스로부터 수집 시험관을 조심스럽게 분리하고, 벌레들을 50 milliliter 튜브로 옮긴 후 중력에 의해 벌레들이 가라앉도록 둡니다.스트리펫(stripette)을 사용하여 배지를 제거합니다. Hank's 용액 40 milliliters를 첨가하고 벌레들이 가라앉을 때까지 기다립니다. 이 과정을 5회 반복하여 총 6회 세척합니다. haze 배양액이 오염되지 않도록 주의하는 것이 이 프로토콜의 성공을 위해 매우 중요합니다.이 시점부터 충 배양액은 멸균 상태로 유지해야 합니다. 라미나 플로우 후드로 옮겨 피펫을 사용하여 항생제가 첨가된 멸균 Hank's solution으로 충 배양액을 6회 더 세척하고, 회수된 성충 수를 세기 위해 20 µL의 샘플 2개를 수집합니다. 감염 14일째에 핀셋으로 이전에 절제한 결장에서 분변을 긁어내면, 접종된 유충 수의 약 50%에 해당하는 알이 수집될 것으로 예상됩니다.다음으로, 분변과 과립형 활성탄을 최소 1:1 비율로 혼합합니다. 거름종이를 채울 수 있을 정도로만 점성이 생기게 조절합니다. 페트리 접시에 담긴 젖은 거름종이 중심부에 얇게 펴 바른 후, 이를 습기가 유지되는 차광 상자에 넣어 12~14일 동안 암소 상태로 유지합니다.7일째부터 L3 단계의 유충을 수집하기 시작합니다. 거름종이 가장자리를 따라 링 모양을 만듭니다. 페트리 접시에서 거름종이를 들어 올린 다음, 파이펫을 사용하여 접시에 남아 있는 유충을 헹궈내기 위해 플레이트당 5 mL의 멸균수를 사용합니다.유충을 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 거름종이를 접시에 다시 넣고 어두운 곳에 배치한 후, 최대 한 달 동안 매주 유충 수집을 반복합니다. 수집된 유충은 프로토콜 본문에 설명된 대로 세척하여 증류수가 담긴 4 °C 상태로 보관합니다.이 절차를 시작하려면, 10% gentamicin이 첨가된 Hank's solution 약 10 mL에 벌레를 20분 동안 담급니다. 이때 튜브를 기울여 놓아 20분 후에 벌레가 완전히 잠기도록 합니다. 항생제가 첨가된 Hank's solution으로 벌레를 6회 세척한 후, 벌레를 통기 구멍이 있는 T 25 플라스크에 옮깁니다. 플라스크를 37 °C 인큐베이터에 똑바로 세워 3주 동안 배양하여 벌레로부터 배설 및 분비물(HES)을 준비합니다.HES 포함 배양액. 배양액은 일주일에 최대 2회 간격으로 수집하며, 수집할 때마다 동일한 부피의 h polyus Media로 교체합니다. LPS 및 숙주 단백질 오염 가능성이 높으므로, 각 수집물은 분리하여 보관하고 날짜와 배치 번호를 명확하게 표시하십시오.배양 24시간 후의 첫 번째 수집물은 따로 보관하여 별도로 처리하거나 폐기해야 하며, HES 함유 배지를 400 ×g에서 5분간 원심 분리합니다. 그 후 50 mL 시린지로 배지를 흡입하여 0.2 µm 저단백 결합 필터를 통해 50 mL 튜브에 통과시킵니다. 이어서, 모아진 HES 상청액을 질소 압력 하의 초여과 장치 내 3000 molecular weight cutoff 필터로 농축합니다. 먼저 필터 장치를 설정하기 위해, 3 kDa 멤브레인의 광택면이 아래로 향하게 하여 1 L 비커에서 증류수로 교반하며 세척합니다.제조사의 지침에 따라 초여과 장치를 조립하되, 필터 막의 광택 면이 위를 향하게 하고 4 °C 보관함에 넣습니다. HES 농축을 시작하기 전, 50 mL의 증류수를 통과시킵니다. 필터가 마르지 않도록 각별히 주의하십시오. 아미노산 및 조직 배양 배지의 기타 성분을 제거하기 위해, 부피가 2~5 mL가 될 때까지 필요한 양의 HES 튜브를 여과 장치에 추가합니다.HES 조제물로부터 50 milliliters의 pyro free PBS를 여과 장치에 넣고 약 2 milliliters가 될 때까지 농축합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 총 150 milliliters의 PBS를 사용하여 ES를 주사기로 옮긴 후 0.2 micron 필터로 멸균 여과합니다.단백질 농도를 측정한 후, 분주액에 배치 번호와 날짜를 기입하여 -80 °C에서 냉동 보관하십시오. F1 마우스에서 H. polygyrus의 생애 주기를 유지하기 위해 400 L의 L3 유충을 경구 투여합니다. 그 결과 생성된 성충의 부하량이 여기에 표시되어 있습니다.HES 배치는 기능적 분석 및 단백질 조성에서 재현 가능한 효능이 입증되었습니다. 또한, 매주 배양 상층액을 분석했을 때, 총 4주까지 단백질 프로필이 매우 유사한 것으로 나타났습니다. Bradford 분석법으로 TS 농도를 측정하면, 총 단백질 양은 보통 약 1 mg/mL입니다.약 500 milliliter의 배양 상청액으로부터 유도된 11가지 서로 다른 배치(batch)에서의 HES 단백질 수율을 보여줍니다. 41가지 HES 배치의 LPS 오염 수준을 limbus AAMI CYTE 분석법으로 측정한 결과, HES 수집 시 오염 방지가 매우 중요하다는 점이 확인되었습니다. 대부분의 HES 배치는 권장 오염 임계값보다 현저히 낮은 것으로 나타났습니다.이 절차를 수행하는 동안, 배양액을 준비할 때 세심한 무균 조작법을 유지하는 것이 중요합니다. 이 기술을 숙달하고 본 절차를 적절히 따르면 3~4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이러한 기생충에서 방출되는 분자 생성물의 전체 범위를 완전히 이해하기 위해 단백질체학, 단백질 분획 분석, 글리칸, 지질 및 microRNA 분석과 같은 다른 방법들을 추가로 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 poly limus를 증식시키는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. Moid는 polyus이며, 배양된 성체 벌레로부터 DS 제품을 수집하여 면역 체계에 미치는 영향을 테스트합니다. 이 기생충은 인간에게 유해하지 않지만, 안전 예방 조치를 준수하고 지정된 프로토콜을 지키는 것이 배치 간의 재현성을 확보하는 데 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

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