매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 기질 임피던스 및 살아있는 세포 이미징을 사용하여 기질 변형제에 노출된 내피 세포에서 세포 매트릭스 부착의 급격한 변화를 실시간으로 정량화하는 것입니다. 이 실험에서는 헴 효소 myelo peroxidase가 병태생리학적으로 관련된 기질 조절제로 사용됩니다. 이는 먼저 피브로넥틴으로 표면을 코팅하여 접착 매트릭스 기판을 제공함으로써 달성됩니다.

그런 다음 Myo peroxidase 또는 MPO가 피브로넥틴에 결합할 수 있습니다. 다음으로, 부유 내피 세포를 표면에 안착시키고 배양하여 최대 세포 부착을 달성하고 피브로넥틴으로 퍼집니다. 그런 다음 세포는 NPO 매개 피브로넥틴 산화를 시작하기 위해 과산화수소에 노출됩니다.

세포 매트릭스 접착의 급격한 변화는 세포 기질 임피던스 및 라이브 셀 이미징 분석을 사용하여 실시간으로 정량화됩니다. 그 결과, NPO 매개 피브로넥틴 산화에 의해 유발된 내피 세포 매트릭스 부착의 급격한 손실이 세포 기질 임피던스 및 라이브 셀 이미징을 통해 높은 시간 해상도와 표지가 없는 방식으로 실시간으로 정량화될 수 있음을 보여줍니다. 이러한 기술의 장점은 높은 시간 분해능으로 세포 매트릭스 부착의 변화를 지속적으로 정량화할 수 있다는 것이며, 이는 매트릭스 변형이 세포 형태 및 접착 의존적 신호 전달 과정에서 다운스트림 변화를 주도하는 방법에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공할 수 있음을 의미합니다.

이 프로토콜은 매트릭스 대 게이팅, 프로테아제와 같은 다른 매트릭스 변형제를 MPO로 대체하거나 상피 세포와 같은 내피 세포 이외의 부착 세포 유형을 사용하여 쉽게 조정할 수 있다는 점에서 더 광범위한 중요성을 갖습니다. 먼저 세포 기질 임피던스 측정을 위해 웰당 80마이크로리터의 피브로넥틴을 추가하여 96웰 골드 마이크로 전극 어레이를 코팅하거나 라이브 셀 이미징 분석을 위해 유리 바닥 세포 배양 접시에 2밀리리터의 피브로넥틴을 추가합니다. 어레이 및/또는 배양 접시를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 표면을 막기 위해 0.2%BSA를 추가하고 섭씨 37도에서 추가로 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, HBSS에 정제된 human my peroxidase를 첨가하고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 HBSS를 사용하여 표면을 두 번 세척하여 결합되지 않은 MPO를 제거합니다.

다음으로, 250, 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 중단된 내피 세포의 밀리리터 당 000 세포를 참조하십시오 96 웰 셀 기질 임피던스 마이크로 전극 어레이에 네이티브 또는 MPO 베어링 피브로넥틴 코팅 표면. 35 밀리미터 유리 바닥 세포 배양 접시의 경우, 500, 밀리리터 당 000 세포의 2 밀리리터를 추가하십시오. 시딩 직후 세포는 마이크로 전극 어레이 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소의 셀 기판 임피던스 인큐베이터 포트에 장착합니다.

그리고 빈 판독값을 취하여 세포 인덱스 데이터의 지속적인 수집을 시작합니다. 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시를 섭씨 35도의 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮깁니다. 세포가 최대한 부착되고 퍼질 수 있도록 2시간 동안 배양합니다.

배양 후 세포 인덱스 판독을 일시 중지하고 미세 전극 어레이 플레이트를 잠시 제거하거나 인큐베이터에서 유리 바닥 접시를 제거하고 스내트를 흡인하고 가열된 HBSS를 추가하여 억제제, MPO 조절제, 촉매 반응 또는 세포 신호 억제제의 효과를 검사합니다. 문화에 추가하십시오. 이 시점에서 즉시 어레이 플레이트를 인큐베이터 포트에 다시 넣거나 유리 바닥 접시를 인큐베이터에 다시 놓고 세포가 30분 동안 평형을 이루도록 합니다.

세포 임피던스 연구를 위한 NPO 촉매 차아염소산 의존성 피브로넥틴 산화 및 접착 해제를 시작하려면 인큐베이터에서 미세 전극 어레이 플레이트를 제거하고 세포 지수 측정을 일시 중지하십시오. HBSS에 과산화수소를 첨가하고 반복적인 피펫팅을 통해 부드럽게 혼합한 다음, 즉시 미세 전극 어레이에 다시 장착하고 인큐베이터 포트에 다시 장착한 다음 35mm 유리 바닥 접시를 사용하여 살아있는 세포 이미징 연구를 위한 세포 인덱스 판독을 다시 시작합니다. 인큐베이터에서 접시를 꺼낸 후 63 x 물 대물 렌즈가 장착된 도립 컨포칼 현미경의 섭씨 37도 가열 스테이지에 장착합니다.

그리고 DIC 광학 장치 라이브 셀 영상을 기록하려면 세포에 초점을 맞추고 여기에 언급된 지침에 따라 DIC 광학 장치를 최적화합니다. DIC 동영상을 시작하고 1분 동안 처리되지 않은 세포의 기준선 판독값을 기록한 다음 과산화수소를 추가하고 반복적인 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고 현미경의 초점을 다시 맞추고 필요한 시간 동안 처리된 세포의 DIC 동영상을 계속 기록합니다. 세포 기질 임피던스 데이터를 분석하려면 먼저 셀 d 접착을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.

연구는 NPO 매개 피브로넥틴 산화가 시작되기 직전에 기록된 값을 살아있는 세포 이미징 데이터를 분석하기 위한 시간 대비 정규화된 세포 지수 그래프로 하나의 현재 데이터로 설정하여 데이터를 정규화합니다. 이미지 J와 같은 이미지 분석 프로그램에서 MPO 매개 피브로넥틴 산화가 시작되기 직전과 직후에 기록된 Open DIC 라이브 셀 이미징 동영상은 적어도 두 개의 개별 DIC 동영상에서 여러 세포를 무작위로 선택하고 멤브레인 가장자리를 수동으로 추적하고 밀폐된 픽셀의 수를 정량화하여 순차적 프레임으로 투사된 영역을 측정합니다. 마지막으로, 데이터를 정규화된 세포 면적 대 시간 대비 플롯으로 제시합니다: 피브로넥틴을 함유한 피브로넥틴 또는 MPO에 내피 세포 현탁액이 안착하면 세포 기질에서 세포 인덱스 값의 정체로 판단되는 바와 같이 2시간 이내에 최대 세포 부착 및 확산이 이루어집니다.

임피던스 측정, 일단 피브로넥틴을 함유한 천연 또는 NPO에 최대 세포 접착이 확립되면, NPO가 촉매 작용한 차아염소산에 의해 매개되고 NPO cos 기질 과산화수소의 첨가에 의해 시작되는 표적 피브로넥틴 산화는 세포 기질 임피던스 및 살아있는 세포 이미징에 의해 측정된 세포 기질 접촉의 표면적의 급격한 감소를 유발합니다. 과산화수소 처리에 대한 반응으로 피브로넥틴을 함유한 NPO에 결합된 내피 세포에서 나타나는 빠른 세포 접착은 과산화수소만으로 처리된 세포에는 없습니다. BLEs 스타틴을 사용한 미오신 2 운동 기능의 억제는 세포 기질 임피던스에 의해 측정된 내피 세포 de 접착 속도를 억제하고, MPO에 대한 반응으로 세포 접착 및 수축이 세포 내 기질 산화를 촉매한다는 것을 확인하는 라이브 셀 이미징을 통해 ACTO 미오신 인장력에 의해 주도됩니다. 이러한 방법은 세포 부착의 매우 빠른 변화를 정확하게 측정할 수 있기 때문에 SARK 인산화 또는 국소 접착 신호와 같은 접착 의존 신호 전달 프로세스의 접착 변화와 다운스트림 변화 사이의 인과 관계에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있으며, 이는 웨스턴 블로팅을 사용하여 시간이 지남에 따라 병렬 실험에서 쉽게 측정할 수 있습니다.