Name: 매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 세포-기질 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여 내피세포의 매트릭스 수정에 의한 세포 접착 및 탈부착의 실시간 변화를 정량화하는 방법을. 이 기법은 혈관생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 NHMRC(National Health and Medical Research Council) SRT(Project Grant 568721)와 부분적으로 UNSW 의학부 교수 연구 보조금(MDR)의 지원을 받았습니다.

1. 일반 내피 세포 배양 <ol><li> 문화 소 대동맥 내피 세포 젤라틴 코팅 조직 배양 플라스크에 (통로 4-9) (코트 조직 문화 표면을 실온에서 15 분 동안 PBS에서 / V 젤라틴 w 0.1 %)와 EGM-2 총알 EGM-2 미디어 ( 5 % 소 태아 혈청, 성장 인자 및 하이드로 코르티손을 제외하고 제조업체에서 제공하는 모든 보조제)를 포함하는 키트. </li><li> / PBS에서 EDTA V 37 ° C에서 w 0.05 % w / v 인 트립신 / 0.02 %로 처리하여 수확 세포 : 세포가 거의 합류 아르 (4 분할 약 삼일 포스트 파종 한 후). 대부분의 세포가 분리 한 후, 트립신 다음 원심 분리기 (100 XG, 5 분)을 해소하기 위해 전체 EGM-2 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 이 기판에 설립 부착 (실험 2 : 3 절)와 내피 세포의 후속 탈 부착 : 피브로넥틴에 내피 세포의 드 노보 부착에 관한 연구 (제 2 실험 1)에 대한 세포를 준비합니다. <ol><li> 세척 수확일단 무 혈청 배지 199 / V 소 혈청 알부민 (BSA)과 다시 원심 분리기 (100 XG, 5 분) 1 W %를 함유하는 세포와. </li><li> w 혈청 배지 (199) 함유 1 %에서 셀을 다시 중지 / BSA V에서 2.5 × 105 세포 / ㎖ (세포 기질 임피던스 측정) 또는 5 × 105 세포 / ㎖ (생균 영상 분석) 및 37 ℃에서 유지 사용하기 전에 ° C. 주 : 세포 부착 반응 그래서 다음 프로토콜 동안 세포를 처리하고 치료하는 데 사용되는 모든 장치 및 솔루션은 37 ° C의 일정 온도로 유지되어야한다 (의한 대류 효과, 예) 온도 차이에 매우 민감하다. </li></ol></li></ol> 2. 실험 1 : 기본 및 MPO 산화 피브로넥틴 (셀 기판 임피던스)에 정량화 드 노보 내피 세포 부착 참고 실험 1 정도를 검사하는 MPO 매개하는 피브로넥틴 산화 드 노보을 지원하는 능력을 손상 </em&gt; 정지 내피 세포의 부착. <ol><li> 96 웰 금 전지 기판 임피던스 미세 전극 어레이 상에 코트 피브로넥틴. PBS에 5 ㎍ / ㎖의 80 μL / 웰의 정제 소 피브로넥틴을 추가, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양 및 솔루션을 제거합니다. </li><li> 표면 결합 피브로넥틴 MPO의 결합을 허용하는 MPO와 피브로넥틴 코팅 된 표면을 품어. 80 μL / 정제 된 인간 호중구 MPO의 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)의 20 nm에서하고 37 ℃에서 0.5 시간 동안 품어 추가합니다. </li><li> 워시는 언 바운드 MPO를 제거하는 HBSS로 두 번 표면. </li><li> 개시하기 위해 80 μL / 웰의 HBSS를 함유하는 미세 전극 배열 판의 웰에 H 2 O 2 (0-10 μM 최종 농도)를 첨가의 HOCl 의존 피브로넥틴 산화, MPO를 촉매 작용하고, 37 ℃에서 또 다른 0.5 시간 동안 배양한다. </li><li> 관련 억제제 또는 MPO - 촉매 반응 조절제 (예를 들어, 대안 MPO 효소의 효과를 검토기질, 효소 저해제 또는 항산화 제; ) 자세한 내용은 9 참조, H 2 O 2 첨가하기 직전 HBSS에 추가 할. </li><li> 0.5 시간 후, 잔류 표면 결합 된 산화 종을 해소하기 위해 메티오닌과 표면 처리, 혼란 세포 활성을 발휘 할 수 있습니다 즉, 반응성 단백 결합 된 클로라민을. 물론 당 80 μl의 HBSS에 10 mM의 메티오닌을 추가하고 37 ° C에서 10 분 동안 품어. </li><li> 블록 BSA와 표면. 추가 80 μL / 잘 BSA의에서 PBS에서 V, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 용액을 제거 / w 0.2 %. 주 : 잔존 코팅면 영역은 세포 접착을 지원하고 비 접착 단백질 (예, BSA) 이러한 차단한다 세포 부착 반응 엄격이 경우 피브로넥틴에 채용 정제 된 세포 - 부착 성 매트릭스에 의존하는 것을 보장한다. </li><li> 워시 HBSS로 두 번 표면. 참고 : 위의 표면 처리 중에 상당히 셀 기판 읽는데 영향을 미치지 않습니다GS. </li><li> 종자 현탁 내피 세포 (ADD 200 μL / 웰을 약 2.5 × 105 세포 / ml의 무 혈청 배지 (199) 함유 1 % BSA으로 제조 1.3 참조) 네이티브 또는 MPO 산화 피브로넥틴 코팅 표면 상. </li><li> 즉시 세포 (즉, 사전에 어떤 세포 부착 및 퍼짐) 시딩 한 후, (5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에서 수납) 인큐베이터 포트 상에 미세 전극 배열 판을 탑재. <ol><li> 계기 소프트웨어를 사용하는 것은 바로 &#39;블랭크&#39;세포 유착의 부재하에 수득 된 배경에 초기 값 ( &#39;셀 인덱스&#39;) 값을 후속 셀 기판 임피던스 정상화를 가지고 읽기. </li><li> 연속 셀 인덱스 데이터 (하나의 셀 인덱스 읽기 / 분의 최소)의 인수를 시작합니다. </li></ol></li><li> 2 시간 동안의 시간 기간을 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션 한 세포를 최대 세포 부착 및 퍼짐 동안 달성된다; 이 반사되고셀 인덱스 값 plateauing는 (도 3a 참조). 참고 : 위의 실험 (실험 1) 피브로넥틴 초기 MPO - 매개 산화가이 기판 상에 세포 접착을 설정하는 내피 세포의 기능을 제한하는 방법을 살펴 본다. 다음 실험 (실험 2) MPO 매개 피브로넥틴의 산화가이 기판에 설립 접착과 내피 세포에서 세포 - 매트릭스 접착 (즉, 탈 ​​부착)의 감소를 촉진하는 방법을 살펴 본다. 이들 두 실험의 처리는 MPO 매개 피브로넥틴 산화의 타이밍을 제외하고 본질적으로 동일하다 (세포 접착 전에 즉, - 실험 1] 세포 부착 후 - 실험 예 2). </li></ol> 3. 실험 2 : MPO 매개 피브로넥틴 산화 (셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징)에 대한 응답으로 피브로넥틴 내피 세포 드 접착을 정량화 <ol><li> 96 웰 골드 미세 전극 위에 코트 피브로넥틴라이브 세포 이미징 분석을위한 세포 기판 임피던스 측정을위한 rrays (C를 PBS에 5 ㎍ / ㎖의 80 μL / 잘 피브로넥틴의 추가, 37 ℃에서 2 시간 동안 품어) 또는 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시 (2 ml에 추가 / PBS에 5 μg의 / ㎖에서 피브로넥틴의 요리와 37 ℃에서 2 시간 동안 품어). </li><li> 블록 BSA와 표면. 3.1에 ​​표시된 볼륨에서 PBS에서 V / w 0.2 %에서 BSA를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 피브로넥틴 MPO의 결합을 허용하는 MPO와 표면을 품어. 3.1에 ​​표시된 볼륨에서 HBSS에 20 nM의 정제 인간 MPO를 추가하고 37 ℃에서 0.5 시간 동안 품어. </li><li> 워시는 언 바운드 MPO를 제거하는 HBSS로 두 번 표면. </li><li> 네이티브 또는 MPO는 베어링 피브로넥틴 코팅 된 표면에 (참조 1.3 혈청 / BSA 브이 승 1 %를 포함 199 중간에서 제조) 씨 중단 내피 세포. <ol><li> 추가 200 μL / 웰의 96 웰 세포 - 기질 임피던스 미세 전극 배열에 2.5 × 105 세포 / ml. </li> &lt;리&gt; 세포 배양 접시를 바닥 35mm 유리에 5 × 10 5 세포 / ml에서 2 ㎖ / 접시를 추가합니다. </li></ol></li><li> 즉시 (즉, 이전의 어떤 세포 부착 및 확산) 세포를 파종 한 후 : <ol><li> 마운트 96 웰 미세 전극 어레이 (5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에서 수납) 셀 기판 임피던스 인큐베이터 포트 상 플레이트와 셀 인덱스 데이터를 연속 수집 (참조, 2.10을 개시 &#39;빈&#39;판독 걸릴 ). </li><li> 전송 35mm 유리 5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에 세포를 배양 접시 바닥. </li></ol></li><li> 최대 세포 부착 및 확산 (참조 2.11) 할 수 있도록 2 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 간단히 96 웰 미세 전극 배열 판 (이 시점에서 일시 정지 셀 인덱스 수치)를 제거 또는 35mm 유리는 37 ° C 배양기에서 세포 배양 접시 바닥, 세포 상층 액을 제거하고 페이지로 예열 (37 ° C) HBSS (볼륨을 추가어 3.1 단계). 주 : 후자는 산화 반응을 방해 산화 종을 포함하는 대신으로 완전한 배양 배지의 산화 반응을 촉매 작용 MPO 공부 때 HBSS가 이용된다. </li><li> 저해제의 효과를 검사 / MPO - 촉매 반응 (선택적인 효소 기질, 효소 억제제 또는 산화 방지제) 또는 세포 신호 전달 억제제의 조절제는 지금 추가 (예를 들면, 40 μM의 blebbistatin는 액토 마이 오신 수축력을 억제하기 위해). </li><li> 즉시 다시 37 ° C 배양기 포트 (이 시점에서 다시 개시된다 셀 인덱스 수치)에 미세 전극 배열 판을 올려 놓거나 35mm 유리는 다시 37 ° C 배양기에 세포 배양 접시 바닥, 그리고 세포에 평형 수 0.5 시간 동안 HBSS. 주 : HBSS에서 0.5 시간 평형화 후, 셀 인덱스 값이 약간 낮은 값으로 안정화; 효소 기질, 효소 및 세포 신호 전달 억제제 또는 항산화 세포를 미리 배양 할 때, 먼저 t을 보장HESE 크게 평형화 후에 얻어진 값에 영향을주지 않는다. </li><li> , MPO가 촉매의 HOCl 의존 피브로넥틴 산화와 탈 부착을 시작합니다. <ol><li> 96 웰 미세 전극 배열 판을 사용하여 셀 임피던스 연구의 경우 : <ol><li> 인큐베이터에서 미세 전극 배열 판을 제거하고 세포 지수 측정을 일시 중지합니다. </li><li> HBSS에 H 2 O 2 (0-10 μM의 최종 농도)를 첨가하고, 부드럽게 반복 피펫으로 혼합한다. </li><li> 즉시, 다시 37 ° C 배양기 포트 상에 미세 전극 배열을 다시 마운트하고 세포 지수 수치의 인수를 다시 시작. </li></ol></li><li> 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시를 사용하여 살아있는 세포 이미징 스터디 : <ol><li> 인큐베이터에서 배양 접시를 제거하고 살아있는 세포 동영상을 녹화하기에 적합 DIC의 광학 63X 물 대물 렌즈가 장착 된 반전 공 초점 현미경의 37 ° C 가열 무대에 탑재합니다. </li><li> 세포에 초점DIC 광학 (; 자세한 내용은, 13 참조 쾰러 조명, 바이어스 지연 및 카메라 오프셋 / 게인)을 최적화 할 수 있습니다. </li><li> DIC 영화를 시작하고 1 분 동안 처리되지 않은 세포의 기준 수치를 기록한다. </li><li> H 2 O 2 (0-10 μM의 최종 농도)를 첨가하고, 부드럽게 반복 피펫으로 혼합한다. 다시 초점 현미경 (필요한 경우) 및 필요한 시간 동안 처리 된 세포의 기록 DIC 영화를 계속한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 및 프리젠 테이션 <ol><li> 셀 기판 임피던스 데이터 <ol><li> 스프레드 시트로 내보내기 원시 데이터 (셀 인덱스 대 시간). </li><li> 셀 드 밀착성 시험 (실험 2 : 제 3)의 경우의 값 MPO 매개 피브로넥틴 산화의 개시 직전에 기록 된 값을 설정하여 데이터를 정규화 한 (즉, 즉시 3.11에서 H 2 O 2의 첨가 이전 .1.1). 참고 :이 상대적으로 보장MPO 매개 피브로넥틴 산화에 의해 유도 된 세포 인덱스 값의 변화는 우물 사이의 절대 셀 인덱스 값에 작은 초기 차이로 숨겨지지 않습니다. <ol><li> 시간에 대한 정규화 된 셀 인덱스 (y 축) (x 축)의 플롯으로서 존재 데이터. </li></ol></li></ol></li><li> (실험 2에서 셀 드 밀착성 시험 : 제 3) 생균 촬상 데이터 <ol><li> DIC 직전에와 표준 이미지 분석 프로그램 (예를 들면, ImageJ에 소프트웨어)에서 MPO 매개 피브로넥틴 산화 개시 후 기록 세포 이미징 영화를 살고 엽니 다. </li><li> 적어도 두 개의 개별 DIC 영화에서 여러 셀을 임의로 선택하여 수동으로 막 에지를 추적하고, 밀폐 된 화소 수를 정량함으로써 순차 프레임 (예를 들면, 1 분 간격)에서의 투영 면적을 측정한다. </li><li> 값을 설정하여 Excel 스프레드 시트로 내보내기 원시 데이터 (시간에 대한 예상 셀 영역) 및 정상화 셀 영역의 데이터는 직전 기록값 1에 MPO 매개 피브로넥틴 산화 개시 (즉, 즉시 3.11.2.3의 H 2 O 2를 첨가하기 이전). </li><li> 시간에 대한 정규화 된 셀 영역 (y 축) (x 축)의 플롯으로서 존재 데이터. </li></ol></li></ol>

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세포 부착 및 매트릭스 탈 접착 공정은 셀 기판 임피던스와 생균 분석 이미징을 사용하여 높은 시간 해상도와 실시간으로 정확하게 정량 할 수있다. 종점이 불량 시간 해상도를 제공 세포 부착, 이러한 분석을 통해 실시간 방식은 중요한 이점을 제공한다. 정확하게 높은 시간 해상도와 빠른 탈 부착 반응을 정량화하여, 이러한 분석은에 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 방법 형태 응답 행렬 수정에 규제 방법과 병행하여 관련 생화학 적 분석에서 측정 된 접착 의존성 세포 신호 전달에 그들이 영향 (예를 들면, 웨스턴 블로 팅). 최근 연구에서, 이러한 방식은 내피 세포의 탈 부착을 트리거하는 피하 행렬의 MPO - 매개 산화 신규 역할을 계시하는데 사용하고 있었다 : (ⅰ) 탈 부착 율은 사전에 결정적으로 의존하는 것을 기존의 액토 마이 오신수축 (참조,도 3B 및 3C) 및 (ii) 세포 - 매트릭스 접착의 손실이 Src에 의존 paxilli...

세포와 그 주변의 세포 외 기질 간의 안정적인 접착 접촉은 조직의 항상성의 유지 보수를 위해 필요합니다. 예를 들어, 혈관 내 피하 매트릭스 내피 세포 유착은 내피 층의 무결성 및 규제 반투과성 한 혈관 장벽으로서의 기능 항상성을 유지하는데 중요한 역할을한다. 액틴 세포 골격 기계적 중앙 관한 액토 마이 오신의 인장력에 저항하여 세포막의 위치를​​ 결정하는데 중요한 역할을하는 세포 - 매트릭스 계면에서 세포 - 매트릭스 부착 및 접착제 접점 부위에서 매트릭스 분자 접착에 결합된다. 반드시 세포 - 매트릭스 계면에서의 힘의 균형이 급속히 인 사건 변경 셀 매트릭스 밀착성을 변경 세포 외 자극은 &quot;외기 시그널링&quot;의 전달의 결과로, 메카 성 신호 전달 단백질에 의해 &quot;감지&quot;. 이 크로스 토크 내기싸우는 세포 및 주변 세포 외 기질은 세포의 모양, 운동성, 함수, 증식 및 생존을 조절이 중요한 역할을한다. 다양한 병태 생리적 과정 (배아 발달, 염증, 상처 복구 및 암전)은 매트릭스 - 산화제 분해 및 / 또는 효소에 의해 3,4- 접착제 매트릭스 기판의 동적 리모델링을 특징으로한다. 예를 들어, 혈관 내 피하 기질 단백질을 접착 (예를 들어, 피브로넥틴은) 때문에 반응 산화제의 국산화에 인간의 염증성 질환에서 수정 또는 변형 주요 대상으로 연루되어있다 (예를 들면, 차아 염소산,의 HOCl) 백혈구 유래 효소에 의해 염증성 혈관 질환 (그림 1) 5-9시 내피 밑층 내에 축적 폐장 내 myeloperoxidase (MPO). MPO 파생 산화제 및 기타 매트릭스 수정 자극에 의​​해 유도 된 세포 - 매트릭스 접착의 변화는 사장님이다다시 내피 기능과 장벽의 무결성을 교란 내피 세포 신호, 형태와 가능성을 변경하여, 예를 들어, 엘리는 병적 다양한 공정 중에 혈관 항상성 변화에 중요한 역할을합니다. 그러나, 세포 외 기질 수정에 부착 세포의 형태 학적 및 세포 신호 반응은 이해하기 시작했다. 매트릭스 수정 세포 접착 역학 및 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 운전하는 방법을 이해하기 위해, 기술은 정확하게 높은 시간 해상도로 실시간으로 세포 - 매트릭스 접착의 변화를 정량화하는 것이 필요합니다. 여기서는 상보 셀 기판 임피던스 이러한 기준을 충족하고, 비 침습적 방법으로 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 플랫폼을 제공 생균 이미징 기술을 설명한다. 우리는 표시 방법이 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징 APPRO통증 용이 세포 부착의 역학을 모니터링하고 네이티브 및 변성 매트릭스 기판 상에 (즉, 새로이 세포 부착) 확산 및 (ii) (즉, 디 - 부착 세포 - 매트릭스 박리 동성을 측정하기 위해 (ⅰ)에 이용 될 수있다 ) 매트릭스 수정 자극에 노출 부착 세포에 의해. xCELLigence 셀 기판 임피던스 바이오 센서 시스템은 96 웰 금 미세 전극 어레이의 표면에 임피던스를 정량함으로써 셀 매트릭스의 접촉 면적의 연속 측정을 제공하고, &#39;셀 인덱스&#39;무 차원 값으로서 이러한 임피던스 측정을 나타낸다고 또한 (절연막) 세포막과 전극면 (11) 사이의 평균 거리의 변화에 민감한 반면, 셀 기판 컨택트 (10) (도 2)의 면적에 거의 비례한다. 셀 인덱스 값에서 추가의 증가는 세포 간 긴밀한 접점 그쪽 형성시 달성t는,이 연구에서 설명하는 실험 내에서 우선하지 않습니다 (11)의 조건을 세포층의 전류 흐름을 제한합니다. 경과 미분 간섭 콘트라스트의 이미지 분석에 의한 시간이 지남에 각 셀의 투영 면적의 측정은 (DIC) 영화 셀 기판의 접촉 면적의 변화의 상보 척도를 제공하고 사람의 정확한 성격과 역학에 관한 추가 정보를 제공한다 세포 기질 임피던스 방식에 의해 정량화 형태 학적 변화. 구체적으로, 우리는 (예를 들면, 피브로넥틴) (ⅰ) 접착 피하 기질 단백질의 산화를 MPO 매개 어떻게 모니터링 정제 피브로넥틴 및 (ⅱ) 트리거 셀 매트릭스 드에 현탁 내피 세포의 드 노보 밀착성을 감소하기 위해 이러한 접근법의 적용을 설명 피브로넥틴에 설립 접착 내피 세포에 -adhesion. 병렬 세포 신호를 수행하는 관련 BIOCHEM를 사용하여 시간이 지남에 따라 분석하여분석적인 (예를 들어, 웨스턴 블랏), 접착 의존성 세포 시그널링 이벤트에 접착 / 디 접착 공정과 관련된 변화와의 시간적 인과 관계가 결정될 수있다. 이러한 접근 방식은 최근의 MPO 피하 침착에 의해 촉매 산화 외 매트릭스는 기존 액토 마이 오신의 수축력 (9)에 의해 구동되는 내피 세포의 세포 - 매트릭스 밀착성 급속한 손실을 유발 함을 입증하기 위해 사용되었다. 중요한 것은, 두 세포 접착의 변화 및 ​​결정되는 신호 접착 의존성 세포 사이의 시간적 관계를 가능하게하여, 이러한 방법은 MPO에 의한 매트릭스 수정 및 휴대 탈 부착 값이 SRC 키나아제를 포함한 중요한 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 트리거 발견 의존성 paxillin 인산화 및 미오신 경쇄 II의 인산화 (그림 1) 9. 산화 환원에 의존 신호, INV의 모드세포 - 매트릭스 접착을 방해 외 산화 반응에 의해 세포 내 신호 이벤트의 활성화를 olving, 셀의 신규 모드 &quot;아웃 사이드 레 독스 신호&quot;(도 1)이라 나타낸다 시그널링 구. 일반적으로, 이러한 상보 셀 기판 임피던스 바이오 센서 및 생균 촬상 방식은 매트릭스 - 수정 자극 또는 대리인이 세포 접착 역학, 형태의 변화를 구동 방법 상이한 드러내는 다양한 적용 상이한 부착 세포 유형 내에서 시그널링 귀중한되어야 실험 설정. 다음 프로토콜은 드 노보 내피 세포 부착 (실험 1) 및 내피 세포의 탈 부착 (실험 2) 프로세스에 MPO 매개 매트릭스 산화의 영향을 정량화하는 방법을 설명합니다. MPO는 피브로넥틴 및 기타 접착제 피하 세포 외 기질 단백질과 우리에게 탐욕스럽게 결합ES (H 2 O 2) 염화물 이온 (CL을 -) 변환 과산화수소 이들 기질 단백질로 국소 반응 및 세포 접착 특성 (도 1) 8,9 방해 반응성 염소 산화제 차아 산 (의 HOCl)에, (12).

<table><tbody><tr><td>96 웰 골드 세포-기질 임피던스 미세전극 어레이</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td>E-Plate 96</td><td>일회용 플레이트는 xCELLigence 시스템에서 세포 기반 분석을 수행하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>블레비스타틴</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>비근육 미오신 II</td></tr><tr><td>소 대동맥 내피 세포의 선택적 억제제, 동결 보존&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW-6001</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>내피 세포 성장 매체 키트</td></tr><tr><td>Fibronectin, 동결 건조 분말</td><td>Sigma</td><td>F-4759</td><td>소 플라즈마</td></tr><tr><td>불소 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>소 피부의 젤라틴 이미징을 위한 광학 품질의 유리 바닥이 있는 세포 피부</td></tr> 접시 <tr><td></td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>세포 배양 하층,</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Merck</td><td>107298</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td> 무<td>혈청 세포 배지</td></tr><tr><td>메티오닌</td><td>Sigma</td><td>M9500</td>은 <td>myeloperoxidase</td></tr>, <tr><td>Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td><td>Millipore</td><td></td> 475911 <td></td></tr><tr><td>RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td><td>ACEA Biosciences / Roche Relica</td><td></td><td>Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station 및 RTCA Control Unit</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td><td>Gibco</td><td>로 구성되어 있습니다.15400-054&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

셀 매트릭스 접착 세포 형태를 제어 및 시그널링에 중요한 역할을한다. 세포 접착 매트릭스 (예, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 및 다른 매트릭스 - 수정 산화제 / 염증 동안 방출 효소)를 방해 자극 질환의 수가 세포 기능, 표현형과 생존의 병리학 적 변화를 유발에 관여된다. 여기서는 (병리 생리 매트릭스 수정 자극으로 내피 세포 및 마이 엘 로퍼 옥시 다제를 사용하여) 셀 기판 임피던스와 생균 촬상 접근 용이 정확하게 세포 부착 및 매트릭스 변형에 의해 유도 된 디 밀착성 실시간 변화를 정량화하기 위해 이용 될 수있는 방법을 설명하는 높은 시간 해상도와 비 침습적 방법. xCELLigence 셀 기판 임피던스 시스템은 연속적으로 금 미세 전극 배열상에서 성장한 세포에서 세포 - 기판 계면에서 임피던스를 측정함으로써 세포 매트릭스의 접착 면적을 정량화한다. 의 이미지 분석 시간 경과 differen간섭은 최초 콘트라스트 영화 셀 매트릭스의 접촉 면적의 변화를 나타내는, 시간이 지남에 따라 각 셀의 투영 면적의 변화를 정량화한다. 두 기술은 정확하게 세포 접착 및 탈 부착 프로세스에 급격한 변화를 정량화. 미세 바이오 센서 어레이에 관한 셀 기판 임피던스는 견고한 높은 처리량 측정 용 플랫폼을 제공한다. 라이브 세포 이미징은 세포 기질 임피던스 측정에 의해 정량 형태 학적 변화의 특성과 역학에 대한 추가 세부 사항을 제공 분석한다. 이러한 접근법은 상보 세포 내 세포 외 기질 성분의 myeloperoxidase가 촉매 작용 산화가 빠르게 변형 세포 부착, 형태 변화 및 ​​내피 세포에서 트리거 시그널링 방법에 유용한 새로운 통찰력을 제공한다. 이러한 접근은 다른 매트릭스 수정 자극 및 관련 자기편 세포 (예를 들면, 상피 세포)에 대한 응답으로 세포 접착 역학 연구를위한 적용 할 수 있습니다.

기본 상 MPO 매개 피브로넥틴 산화 (실험 2) 내피 세포 현탁액. 시딩에 대한 응답으로 최대한의 세포 부착 및 확산에 MPO (무료) 피브로넥틴 또는 MPO-베어링 피브로넥틴 결과에 피브로넥틴에서 내피 세포의 탈 부착의 실시간 정량 2 시간 내에, 세포 기질 임피던스 측정 (도 3a) 세포에서 지수 값 plateauing 것으로 판단. MPO 매개 피브로넥틴의 산화 실험 1에 설명 된 프로토콜에 따라 수행 실험에서 세포 파종 이전에 개시 될 때 세포 부착 및 확산이 초기 단계는 현저하게 감소 (데이터가 표시되지; 세부 사항 (9)를 참조하십시오). 최대 세포 부착 네이티브 또는 MPO 함유 피브로넥틴에 확립되면, MPO - 촉매의 HOCl 의해 매개 피브로넥틴 산화 타겟팅 (MPO의 공동 기판 H의 첨가에 의해 개시를 2 O 2) Sur에서 급격...

여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다.

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 기질 임피던스와 살아있는 세포 이미징을 이용하여, 기질 수정제에 노출된 혈관 내피 세포의 세포 기질 접착의 급격한 변화를 실시간으로 정량화하는 것입니다. 본 실험에서는 병태 생리학적으로 유의미한 기질 수정제로 헴 효소인 myelo peroxidase를 사용합니다. 이는 먼저 표면을 fibronectin으로 코팅하여 접착성 기질 기판을 제공함으로써 이루어집니다.그 후 Myo peroxidase 또는 MPO가 피브로넥틴(fibronectin)에 결합하도록 합니다. 다음으로 부유 상태의 내피세포를 표면에 안착시키고, 피브로넥틴 상에서 세포 부착 및 확산이 최대한 이루어지도록 배양합니다. 그 후, MPO 매개 피브로넥틴 산화를 유도하기 위해 세포를 과산화수소에 노출시킵니다.이후 세포-매트릭스 접착의 급격한 변화를 세포-기판 임피던스 및 살아있는 세포 이미징 분석을 통해 실시간으로 정량화합니다. 결과에 따르면 NPO 매개 피브로넥틴 산화로 인해 유발된 혈관 내피 세포-매트릭스 접착의 급격한 손실을 세포-기판 임피던스와 살아있는 세포 이미징을 통해 높은 시간 분해능으로 라벨 프리 방식으로 실시간 정량화할 수 있음을 보여줍니다. 이러한 기술의 장점은 세포-매트릭스 접착의 변화를 높은 시간 분해능으로 지속적으로 정량화할 수 있다는 것이며, 이는 매트릭스 변형이 세포 형태 및 접착 의존적 신호 전달 과정의 하류 변화를 어떻게 유도하는지에 대한 중요한 새로운 통찰을 제공할 수 있음을 의미합니다.본 프로토콜은 MPO를 매트릭스 분해 효소(matrix degrading proteases)와 같은 다른 기질 수정 제제로 대체하거나, 내피세포 외에 상피세포와 같은 부착성 세포 유형을 사용함으로써 쉽게 응용될 수 있다는 점에서 더 넓은 의미를 갖습니다. 우선, 세포 기질 임피던스 측정을 위해 96웰 금 미세 전극 어레이의 웰당 80 µL의 피브로넥틴을 첨가하여 코팅하거나, 살아있는 세포 이미징 분석을 위해 유리 바닥 세포 배양 접시에 2 mL의 피브로넥틴을 첨가합니다. 어레이 또는 배양 접시를 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.그 후 표면을 블로킹하기 위해 0.2%BSA를 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 추가로 배양합니다. 다음으로 HBSS에 정제된 인간 my peroxidase를 첨가하고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 HBSS를 사용하여 표면을 2회 세척하여 결합되지 않은 MPO를 제거합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

암은 다른 장기로 전이하는 능력으로 인한 치명적인 질병입니다. 다양한 치료 조건하에서 암세포가 이동하고 침입하는 능력을 결정하는 것은 치료 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 교모세포종 암 세포주들의 실시간 전이성 능력을 평가하는 방법을 제시한다.

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

이 기사는 1) 초점 접착의 크기와 수 및 2) 세포 형상 지수및 MCF7 세포의 컨런트 단층의 공초점 이미지로부터의 분포를 정량화하는 것을 설명합니다.

MCF7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화

우리는 침습적 세포 하위집단을 실시간으로 검출하고 포획하는 접근법을 기술한다. 실험 설계는 세포의 전기 임피던스의 변화를 모니터링하여 실시간 세포 분석을 사용합니다. 복잡한 조직에서 침습성 암, 면역, 내피 또는 기질 세포를 포획 할 수 있으며 공동 배양의 영향을 평가할 수 있습니다.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

배우세요 세포-기질 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여 내피세포의 매트릭스 수정에 의한 세포 접착 및 탈부착의 실시간 변화를 정량화하는 방법을. 이 기법은 혈관생물학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

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