성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에 사카로 미세스 세 레비 시아

다음 실험의 전반적인 목표는 Croce Visier에서 불안정한 단백질의 분해에 대한 유전적 요구 사항을 신속하게 결정하는 것입니다. 이는 특정 선택적 조건에서 성장에 필요한 리포터 효소를 불안정한 관심 단백질에 융합함으로써 달성됩니다. 다음으로, 융합 단백질을 발현하는 야생형 또는 돌연변이 세포를 선택적 배지 한천 플레이트에서 배양합니다.

Plating Assay는 생화학적으로 확인된 단백질 함량의 차이를 확인하기 위해 효모 세포 성장을 기반으로 단백질 안정화에 대한 편리한 지표를 제공하는 반면, 융합 단백질을 보유한 돌연변이 세포의 유형은 Western blot 분석을 위한 빠르고 비효율적인 단백질 추출 방법을 통해 용해됩니다. 그 결과, 불안정한 단백질의 풍부함이 분해에 필요한 유전자에 돌연변이가 있는 세포에서 증가한다는 것을 보여줍니다. 반대의 경우는 분해 유능한 야생형 균주에 해당됩니다.

펄스 추적 및 순환 하이데 추적 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되지 않아 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 빠르고 높은 처리량으로 결정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 불안정한 단백질의 범위에 대한 분해 요구 사항에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 전사 및 번역과 같은 유전자 발현의 다른 측면에 대한 조절자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

절차를 시연하는 사람은 Sheldon Watts와 Justin Crowder입니다. 내 실험실의 학생들은 분석 전에 불안정한 단백질과 대사 리포터 효소로 구성된 융합 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 돌연변이 효모 균주로 변환했습니다. 대조군으로서의 단백질 분해 조절과 관련된 유전적 결함이 있는 것으로 의심되는 경우에도 동일한 플라스미드를 야생형 효모 균주로 변환합니다.

세포를 위해 선택되는 5 밀리리터의 최소 배지에 형질전환체를 접종하여 플라스미드 분자를 보유하게 합니다. 시험관을 경사진 회전기에 넣고 다음날 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양의 광학 밀도를 측정한 다음 새로운 배지와 멸균 개별 1.5ml 원심분리 튜브를 사용하여 각 배양물을 0.2의 OD 600으로 희석하여 모든 세포의 세포 농도를 균등화합니다.

주요 분석을 시작하려면 먼저 0.2의 OD 600에서 시작하여 각 사전 희석 균주 200 마이크로 리터를 멸균 96 웰 플레이트의 첫 번째 열에 있는 지정된 웰로 이동하여 6배 희석 시리즈 매트릭스를 설정하고, 후속 희석을 준비하기 위해 다중 채널 피펫을 사용하여 125마이크로리터의 멸균수를 2열의 빈 웰에 추가합니다. 셋, 넷. 다음으로, 25마이크로리터의 효모를 1열에서 2열로 옮기고, 피펫을 몇 번 위아래로 피펫하여 세포를 고르게 혼합하고, 2열에서 3열로 25마이크로리터의 세포를 이동시킵니다. 4열의 웰이 세포 발견을 위한 시각 보조 도구로 잘 혼합될 때까지 연속 희석 단계를 반복합니다.

그리드 템플릿을 인쇄하고 연속 희석 매트릭스에서 가장 농도가 낮은 컬럼부터 시작하여 페트리 접시 뚜껑 내부에 테이프로 붙입니다. 각 컬럼에서 4마이크로리터의 세포를 옮깁니다. 96웰 플레이트에서 세포 내 플라스미드 유지를 위해 선택하는 대조군 최소 배지 한천 플레이트에 올려 놓고 각 컬럼에서 다른 4마이크로리터의 세포를 세포 내 플라스미드를 모두 선택하는 별도의 최소 배지 한천 플레이트에 배치합니다.

불안정한 융합 단백질의 유지 및 발현. 두 접시를 벤치에서 5-10분 동안 건조시킵니다. 탈수를 방지하기 위해 파라브로 뚜껑을 밀봉하고 섭씨 30도에서 2일에서 6일 동안 세포를 배양합니다.

가장 빠르게 성장하는 배양의 콜로니가 지정된 플레이트에서 가장 희석된 지점에서 처음 볼 수 있게 되면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장 정도를 문서화합니다. 사진을 찍으면 다른 날에 다른 접시 또는 여러 날에 같은 접시의 사진을 찍어야 할 수도 있습니다. 광범위한 성장 속도를 나타내는 상이한 효모 균주의 경우, 생화학적으로 확인된 성장 분석에서 확인된 유전자가 단백질 풍부도를 조절한다는 것을 확인하고, 앞서 언급한 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 야생형 및 돌연변이 효모 균주를 형질전환시키는 것으로 시작하고, 세포 내 플라스미드 유지를 위해 선택하는 5ml의 최소 배지에 형질전환체를 접종하고, 섭씨 30도의 경사 회전체에서 밤새 튜브를 배양합니다.

다음 날, 각 야간 배양의 600에서 광학 밀도를 측정합니다. 모든 균주가 0.4 이상의 OD 600에 도달하면 각 균주의 최종 부피가 10ml가 되도록 모든 배양물을 새로운 배지로 다시 0.2로 희석합니다. 모든 배양액이 0.8에서 1.2 사이의 중간 로그 위상 성장 OD 600에 도달할 때까지 섭씨 30도 플랫폼 쉐이커에서 세포를 배양합니다.

총 2.5 OD 단위의 세포를 새로운 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮겨 세포를 수확합니다. 실온에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 S 상층액을 제거합니다. 그런 다음 1ml의 증류수 와류 또는 피펫을 위아래로 추가하여 입천장을 다시 현탁시키고 세포 현탁액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

실온에서 30초 동안 두 번째 원심분리로 세포를 분리하고 snat를 제거하고 100마이크로리터의 증류수에 세포를 재현탁합니다. 100마이크로리터의 0.2몰 수산화나트륨을 세포 현탁액에 첨가하고, 위아래로 몇 번 피펫을 넣어 샘플을 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양하여 조기 세포 용해를 방지합니다. 세포를 와류로 만들지 마십시오.

30초 동안 세 번째 원심분리로 세포를 다시 분리합니다. 실온에서, 세포에서 상등액을 제거하고 펠릿을 50-100 마이크로 리터의 1 x lamby 샘플 버퍼로 현탁액을 5 분 동안 섭씨 95도에서 현탁액을 배양하여 모든 단백질을 변성시켜 세포를 용해 한 다음 5 분 동안 얼음에서 전체 세포 용해물을 냉각시킵니다. 분석을 위해 여러 개의 막관통 분절을 가진 단백질과 같이 응집되기 쉬운 단백질의 풍부함을 분석하기 위해 섭씨 95도에서 5분 동안 섭씨 70도에서 시작하는 대신 10분 동안 시작하여 최적의 변성 배양, 온도 및 시간을 경험적으로 결정합니다.

마지막으로, 실온에서 1분 동안 용해물을 원심분리하여 용해성 분획을 분리하고, 스내트를 새 튜브로 옮기고 불용성 펠릿 분획을 폐기합니다. 용해성 분획은 이제 SDS 페이지, 겔에 직접 로드하거나 효모 성장 기반 단백질 분해 분석을 설정할 때 섭씨 음의 20도에서 보관할 수 있습니다. 불안정한 삼중 융합 단백질은 동일한 대사 유전자가 결핍된 효모 균주 배경을 보완하는 추가 대사 효소와 융합됩니다.

융합 단백질이 효모에서 발현될 때, 소포체막(endoplasmic reticulum membrane)에서 불모의 전좌(translocation) 사건이 발생하기 쉽습니다. 이 비정상적인 전좌는 대사 효소를 포함한 전체 단백질의 유비퀴틴 매개 분해를 유발하여 세포 증식을 방지합니다. 그러나 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)가 결핍된 효모 균주에서는 융합 단백질이 평균 전좌(translocation)에서도 세포가 증식할 수 있도록 분해되지 않도록 보호됩니다.

그러므로, 유비퀴틴 리가제(ubiquitin ligase)가 존재할 때, 세포 내부에서 발생하는 단백질 분해와 효모 세포가 대사 산물이 고갈된 한천 플레이트에서 증식하지 못하는 것 사이에는 상관관계가 있습니다. 반면에, 유비퀴틴 리가아제 세포 증식에 결함이 있거나 없는 경우, 세포 증식은 융합 단백질이 배경 또는 가짜 성장을 감소시키고 이 분석의 엄격성을 증가시키기 위해 분해로부터 보호되었음을 나타냅니다. 효모 성장 분석에서 관찰된 결과를 확인하기 위해 대사 효소의 경쟁적 억제제를 성장 배지에 첨가할 수 있습니다.

융합 단백질 분해의 직접적인 증거는 웨스턴 블롯(western blot)으로도 확인할 수 있습니다. 유비퀴틴 리가제(ubiquitin ligase)의 존재 유무에 따라, 융합 단백질은 각각 분해되거나 파괴되지 않을 것입니다. 이러한 절차는 관심 단백질의 정상 상태 풍부도에 대해 가장 직접적으로 보고한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이러한 절차를 수행한 후 단백질 분해 역학 및 연구 상태 단백질 수준을 증가시키는 것으로 밝혀진 돌연변이의 존재를 직접 분석하기 위해 펄스 또는 시클로헥시미드 추적 분석을 수행할 수 있습니다.