액체 및 고체 종양 유래의 암세포 프로테옴 정량적 질량 분석 프로파일

이 절차의 전반적인 목표는 액체 및 고체 종양의 단백질 발현 프로파일을 규명하는 것입니다. 이는 먼저 환자 유래 혈액 또는 조직 샘플에서 암세포를 농축하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 암세포에서 단백질을 분리한 다음 종양 특이적 수삭 정량화 표준물질과 혼합합니다.

마지막 단계에서는 단백질 혼합물을 분해합니다. 궁극적으로 질량 분석법은 액체 및 고체 종양의 단백질 발현 프로파일을 보여주는 데 사용됩니다. 이 방법은 약물 표적 및 치료 내성 메커니즘을 어떻게 식별할 수 있는지와 같은 종양학 및 병리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 바이오마커 발견에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다양한 고형 및 액체 암 조사와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시연할 사람은 제 연구실의 한니발 버거 병리학 연구소(Hannibal Berger Institute for Pathology) 박사와 크리스토프 란츠(Christophe Lanz) 박사입니다.유세포 분석에 의한 형광 분류를 위한 액체 종양 세포를 준비하기 위해, Ali는 PBS에 현탁된 인간 단핵 세포 샘플 1ml와 음성 대조군에 대해 2%FBS, 그리고 최종 염색에 사용된 각 형광 염료에 대해 1mL를 인용하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 백혈병 세포 집단을 분리하고 얼음의 보상 제어를 위해 적절한 항체로 세포를 배양합니다.

30분 후 PBS와 2%FCS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 적절한 튜브에 세포 생존도 염색제를 추가하고 회로도에 따라 세포를 분류합니다. IMDM과 10%FCS에서 샘플을 수집하여 레이저 캡처 현미해부로 고형 종양을 수집합니다.

먼저, 마이크로톰을 사용하여 포르민 고정 파라핀 함유 샘플에서 5-10마이크로미터 두께의 절편을 절단합니다. 다음으로, 필름으로 덮인 멤브레인 슬라이드에 섹션을 장착하고 1시간 후 섭씨 37도에서 샘플을 건조시킵니다. De 크실렌 앱솔루트 에탄올, 70% 에탄올 및 물에서 연속적인 1분 배양으로 섹션을 분리하고 재수화합니다.

그런 다음 20초 동안 헤마틴으로 섹션을 염색합니다. 수돗물로 헹구고 레이저 캡처 현미해부 시스템으로 관심 세포를 수집하여 분류된 액체 종양 세포에서 단백질을 추출합니다. 샘플을 세 번 스핀다운하고 두 번째 두 번의 원심분리 동안 500마이크로리터의 차가운 PBS로 세포를 세척합니다.

다음으로, 6개의 세포에 10을 곱한 40마이크로리터의 용해 완충액에서 세포를 배양합니다. 15분 후, 용해물을 원심분리하고 상등액을 함유한 투명 용해물을 새로운 반응 튜브로 옮겨 미세 절개된 고형 종양 세포에서 단백질을 추출합니다. 조직 샘플을 섭씨 72도에서 60마이크로리터의 조직 용해 완충액으로 배양합니다.

15분 후, 짧은 원심분리로 유체를 모으고 상등액을 새 반응 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 얼음에서 용해물을 3분 동안 초음파 처리한 다음 600RPM의 교반으로 가열 블록에서 섭씨 99도에서 20%나트륨 ESAL 황산염을 가진 15마이크로리터로 배양합니다. 1시간 후 용해물을 스핀다운하고 S natin을 새 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 투명화된 세포 및 슈퍼 SLAC 표준물질의 단백질 농도를 측정한 다음 동일한 양의 종양 세포 조각을 슈퍼 SLAC 표준물질과 혼합한 다음 리튬을 혼합합니다. 샘플 부피의 25%에서 황산염 버퍼를 담수화하고 샘플 부피의 10%에서 환원제를 수행합니다. 그런 다음 생성 된 용액을 섭씨 72도에서 10 분 동안 가열 블록에서 가열합니다.

플레이트 리더에서 고체 종양 용해물의 단백질 농도를 측정하려면 표준 소 혈청 알부민 희석 용액 시리즈, 용해물 및 적절한 슈퍼 SLAC 표준물질을 시판되는 단백질 분석 및 96 웰 플레이트와 혼합합니다. 1분 동안 흔든 후 적절한 시간 동안 샘플을 배양하고 제조업체가 표시한 대로 흡광도를 측정합니다. 그런 다음 필터 장치에 동일한 양의 정화 용해물과 슈퍼 SLAC 표준물질을 200마이크로리터의 요소와 혼합하고 샘플을 30분 동안 원심분리합니다.

액체 크로마토그래피 및 질량 분석 분석으로 종양 세포 용해물을 분석합니다. 초음파 처리 수조에서 5분 동안 30마이크로리터의 로딩 버퍼에서 관심 펩타이드를 분리하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 단백질을 스핀다운하고 투명한 상등액을 질량 분광 자동 샘플러 바이알로 옮깁니다.

다음으로, 분석당 5마이크로리터의 시료를 nano lc, ms MS 시스템 자동, 시료 채취기에 주입하고 역상 C 18 preco 장착 및 vented 컬럼 설정에서 펩타이드를 온라인으로 농축 및 탈염합니다. 마지막으로, 자기 주도형 나노 스프레이 컬럼에서 역위상 C 18 마이크로 컬럼에서 펩타이드를 분리합니다. 분당 300나노리터에서 0.1% 수성 포름산 대 5-35%아세틸 니트릴의 90분 구배를 사용한 다음 나노 스프레이 이온 소스를 사용하여 펩타이드를 전달하고 분석합니다.

상위 15개 데이터 종속 수집 방법을 사용하여 다양한 유형의 질량 분석기를 펩타이드 분석에 사용할 수 있습니다. 환자의 액체 및 고체 종양에 대한 단백질체 프로파일링은 새로운 진단 및 예측 바이오마커를 발견하기 위한 유망한 접근 방식입니다. 예를 들어, 이 첫 번째 그림은 액체 종양 샘플에서 CD one 17 염색, 백혈병 세포를 분리하기 위한 예시적인 게이팅 전략을 보여줍니다.

반면, 여기에서는 방금 시연된 바와 같이 필름으로 덮인 멤브레인 슬라이드에 장착된 5-10마이크로미터 두께의 섹션입니다. 그림과 같이 관심 영역을 수동으로 선택하고 레이저 캡처 마이크로 해부로 절제한 다음, 액체 및 고체 종양 샘플의 단백질 발현 프로파일에 대한 감독되지 않은 클러스터 분석을 질량 분석법으로 수행할 수 있으므로 고유한 단백질 발현 프로파일에 따라 서로 다른 종양 개체를 명확하게 분리할 수 있습니다. 이러한 데이터는 궁극적으로 임상적으로 관련된 바이오마커의 확립에 기여할 수 있습니다.

인산화 또는 UIC 환기와 같은 번역 후 변형을 위한 농축 전략의 구현은 또한 개발 후 조절되지 않는 키나아제 패턴을 어떻게 식별할 수 있는지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 기술은 병리학 및 종양학 분야의 연구자들이 다양한 암 개체에서 특정 바이오마커 및 신호 경로를 탐색할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 질량 분석법으로 단백질 발현 패턴 및 신호 상태를 분석하기 위해 암에서 단백질을 하위 집단으로 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.