Name: 돼지 심장에 현지 카테터 주입 용 주사 및 약물로드 초분자 히드로 겔 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 학습하세요 심근경색 치료를 위한 약물 로드 초분자 히드로겔을 카테터를 이용해 돼지 심장에 주사하는 최소침습 방법을. 이 기술은 국소 약물 전달과 기계적 지지를 통한 새로운 심혈관 치료 전략을 제시합니다.

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이 작품은 교육, 문화, 과학 (중력 프로그램 024.001.035)의 교육부에 의해 투자되었다, 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO), 유럽 연구위원회 (FP7 / 2,007에서 2,013 사이) ERC 보조금 협정 308045와 내에서 실시 LSH TKI 프레임 워크. 생물 의학 재료 연구소의 연구 프로그램의 프로젝트 P1.03 갇힌의이 연구 형태 부분은, 경제 업무의 네덜란드 교육부가 공동으로 자금을 지원. 네덜란드 심장 연구소 (-이 프로젝트는 ICIN에 의해 지원되었다 <a href="www.icin.nl">www.icin.nl</a> )과 &quot;Wijnand 엠 응원단에는 Stichting&quot;. 저자는 mRuby2를 제공 UPy-hydrogelator 및 Remco의 예술의 합성 헹크 얀센과리스 피터에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 테에 대한 버트 Meijer에, TONNY 보스만, 록산 Kieltyka, 스테인 크레이머, 주스트 Sluijter, 이모 호 우퍼, 그리고 많은 유용한 토론 Frebus 반 Slochteren 및 Marlijn 얀센, 조이스 비서, 그레이스 크로프트와 Martijn 반 Nieuwburg 감사합니다chnical 지원.

참고 : 모든 생체 실험이 실험 동물 자원 연구소 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 실시 하였다. 실험은 위트레흐트 대학의 의학 교수의 동물 실험위원회, 네덜란드에 의해 승인되었다. 하이드로 겔 제형의 1 <ol><li> , 10 중량 %의 겔 1 ㎖를 제조 자석 교반기를 이용하여 1 시간 동안 70 ℃에서 교반하여 900 ㎕의 PBS pH를 11.7에서 바이알 UPy-hydrogelator 100mg을 용해한다. 그 후 실온까지 점성 용액을 냉각. 용액은 이제 약 9.0의 pH를 가져야한다. 이 용액을 수일 동안 저장 될 수있다. </li><li> 10 분 균일 한 분포를 달성하기 위해 점성 용액에 중성 PBS에 용해시키고 교반되는 약물 또는 생체 분자의 적당량을 피펫. 이 솔루션은 너무 점성이되면, 곧 뜨거운 물을 따뜻하게. </li><li> 소독하는 자외선 램프에서 1 시간 동안 솔루션을 놓습니다. </li></ol> 히드로 겔 2. 분석 <ol><li> 용액의 유변학 적 평가 <ol><li> 겔 로딩 전에, 레오 미터에서 25mm 플레이트 - 플레이트 형상을 마운트 20 ° C까지 온도를 측정하는 동안 겔의 증발을 방지하기 위해 물과 함께 판을로드. </li><li> 피펫 300 20 ° C로 유지 레오 미터에 25mm 판 형상 플레이트 상 용액 μL 낮출 플레이트는 0.5 mm의 간극 거리를 얻었다. </li><li> 십 년간 당 10 점 0.1에서 500 파에 전단 응력의 함수로 기록 전단 점도. </li></ol></li><li> 겔의 유변학 적 평가 <ol><li> 피펫 및 피펫 플레이트 용액에 다른 장소에 1 M HCl을 4.2 μL의 전체 상 용액 300 μL은 겔 형성을 유도한다. </li><li> 0.5 mm의 간극 거리에 판을 내리고 약 30 분 동안 젤 치료하자. 이 경화 과정 동안 낮은 주파수 및 변형에서의 저장 탄성율 및 손실을 측정하는 예를 들어 각각 1 라드 / 초 및 0.5 %. </li><li> 젤은 주파수 (0.1 내지 RAD / 초)의 기능과 그 후 변형 (0.1-1,000 %)의 함수로 (후 약 30 분), 기록 저장 및 손실 계수를 치료 한 후. </li></ol></li></ol> 3. 부식 및 릴리스 실험 <ol><li> 기공 크기 8.0 ㎛의 24- 웰 플레이트 세포 배양 인서트 매달려 폴리 (에틸렌 테레 프탈레이트)로 약물 또는 생리 활성 물질을 함유하는 점성 용액 100 μl를 옮긴다. 액상에서, 파라 필름 (도 2a)과 인서트의 하단을 커버하면서 고분자 용액의 누출을 방지 할 수있다. </li><li> 직후 피펫 점성 솔루션의 상단에 1 M 염산 1.4 μL은 약 7.0-7.2로 pH를 줄이고 약 30 분 동안 삽입 내부의 젤 치료를 할 수 있습니다. </li><li> 이리저리 파라 필름을 제거합니다삽입 미터, 24 웰 플레이트에 삽입을 배치하고 잘 800 μL PBS 산도 7.4을 입력합니다. 느린 요동 또는 진동 운동과 37 ° C에서 접시를 품어. 용매의 증발을 방지하기 위해, PBS로 빈 우물을 나머지 작성 파라 필름 (그림 2B)로 24 웰 플레이트를 밀봉. </li><li> 주기적으로 PBS를 새로 고침 발표 UPy 침식 제품 또는 약물 / 생체 분자의 제거 PBS를 분석 할 수 있습니다. <ol><li> 각각 265 나노 미터 또는 320 nm에서의 UV 흡광도를 측정함으로써 UPy 침식 제품 또는 pirfenidone 정량화. 559 nm에서 여기 후 587 nm에서 형광 단백질 mRuby2 측정 형광 방출하십시오. </li><li> 소정의 교정 곡선을 통해 농도를 측정하여 흡수 / 배출 값을 변환합니다. <ol><li> 버퍼 내의 분석 물의 공지 된 농도의 일련 용해 검량선을 준비하여 UV 흡광도 또는 이들 샘플의 형광 방출을 측정한다. DET하는 선형 함수를 사용하여 데이터를 보간미지 시료의 농도를 흰담비. 비 형광 단백질을 ELISA 검출 (6)를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 카테터를 통해 4. 지방 주입 <ol><li> 심근 경색의 유도 <ol><li> 금식의 12 시간 후, 물을 제외하고, 미다 졸람 0.4 ㎎ / ㎏, 케타민 10 ㎎ / ㎏과 아트로핀 0.014 ㎎ / ㎏ 근육을 주입하여 안정적인에서 돼지 진정제. </li><li> 티 오펜 탈 나트륨 5 mg의 관리하다 / kg을 정맥 마취 유도 및 기관 내 튜브와 돼지를 삽관합니다. 수술실로 동물을 운반하는 동안 필요한 경우 12 / 분의 속도로 풍선 환기를 수행한다. </li><li> 동작 극장에 도착 즉시 FIO 2 0.50, 10 ㎖ / ㎏ 호흡량, 연속 호 기말 이산화탄소 분압에서 12 / min의 주파수 기계 양압 환기를 시작합니다. 건조 함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 연속 intraven로 균형 마취를 시작합니다미다 졸람 0.5 ㎎ / ㎏ / hr의 OU에 주입, 펜타닐 2.5 μg의 / ㎏ / 시간 및 pancuronium 브로마이드 0.1 ㎎ / ㎏ / 시간. 적절한 마취 연속적 ECG, 동맥 혈압, 온도, 호 기말 이산화탄소 분압 모니터링을 보장한다. </li><li> 정맥 4.3 ㎎ / ㎏ 아미오다론을 주입하고, 정맥 sheeth (18)를 사용하여 우심실에서 심장 내 제세동 카테터를 배치합니다. </li><li> 앞에서 설명한 프로토콜 (18)에 따라, 90 분, 관동맥 풍선 폐색에 의해 두 번째 대각선 지점에 좌전 하행 동맥 (LAD) 말단을 폐색. </li></ol></li><li> 전자지도 <ol><li> 심근 경색 후 사주에서 매핑 절차를 계획한다. 좌심실 3D 전기 맵핑 (EMM)에 대한 cathlab 시스템 (도 4)을 준비한다. 이 시스템을 통해 가능한 최대 절전 모드 및 심근 경색은 투시 유도없이 식별 할 수 있습니다. 취득 자체를 이러한 EM-지도를 구성하려면초저 자기장 에너지 원 및 센서 카테터 팁 (19, 20)를 이용하여 LV 내막 표면상의 여러 위치에서 점 RIES. </li><li> 돼지를 마취, 프로토콜을 따르는 것은 4.1.1-4.1.4 단계를 반복합니다. </li><li> 돼지의 뒷면에있는 외부 참조 패치를 놓습니다. </li><li> 프로토콜 (18)에 따라 혈관 통로 (대퇴 동맥)을 고정합니다. </li><li> 25 ° 오른쪽 전방 경사 (RAO)와 40 ° 왼쪽 전방 경사 (LA)보기에서 복 좌심실 조영술을 획득 한 후 헤파린의 75 U / kg을주고, 심실의 크기를 왼쪽으로 견적. </li><li> 좌심실 (LV)로 하행 대동맥, 대동맥 궁과 대동맥 밸브를 통해 투시지도하에 8 프랑스어 매핑 (D 또는 F 곡선) 카테터를 진행합니다. </li><li> ventri의 경계를 정의하는, 3D 실루엣을 형성하는 유출 관, 측방 및 후방 점 뒤에 제 1 데이터를 취득하는 LV의 정점에 카테터의 팁을 배향CLE. </li><li> 모든 내막 세그먼트 내막을 통해 매핑 카테터를 끌어 순차적 내막 (21, 22)과 접촉하면서 끝의 위치를 획득하여 샘플링 될 때까지 후속 포인트를 얻습니다. </li><li> 전기 활동 (근처) 정상 및 기계적 운동 장애, 소위 동면 심근 (그림 6)입니다 즉, 대상 영역을 정의합니다. </li></ol></li><li> 심근 내 주입 <ol><li> 27 게이지 바늘과 8 프랑스어 카테터 내부 핵심 루멘 (그림 5A와 B)로 구성되어 심근 내 주입 카테터에 의해 매핑 카테터를 교체합니다. 특정 량을 제공하기 위해, 하이드로 겔 용액을 약 2 ㎖의 부피 그레이딩 주사기를로드하고 시린지 펌프로 놓는다. </li><li> 0 ° 및 90 ° 플렉스에서 바늘 확장을 조정하고 바늘 죽은 공간을 채우기 위해 하이드로 겔 용액 0.1 ml에 배치합니다. 그리고, 배치대동맥판 걸쳐 및 목표 영역으로 주입 카테터 팁. </li><li> 4.2.9에서 결정된 타겟 영역 안으로 주입 위치에 대한 다음 기준에 충족 : LV 벽 카테터 (1)의 수직 위치를; (2) 우수한 루프 안정성 (&lt;4mm) EMM 시스템에 의해 계산; (3) 기본 전압&gt; 6.9 MV (21). <ol><li> 심근 내로 바늘을 전진, (4) LV의 조기 심실 수축에 의해 확인하고, 약 0.4-0.5 ㎖ / 주사기 펌프를 사용하여 분의 일정한 속도로 볼 루스에의 0.1-0.3 mL의 하이드로 겔을 주입. 가능한 확산으로 6-10 다른 위치에이 작업을 반복합니다. 조직의 자연 pH는 하이드로 겔을 형성하는시 주입 한 후, 용액을 중화한다. </li></ol></li></ol></li><li> 희생 <ol><li> 이후 과정은 인도적 방혈하여 동물을 희생. 열등한 대정맥 정맥을 잘라 흡입 장치와 혈액을 제거합니다. 심실 Fi 인터넷을 유도정점에서 9 V 배터리를 배치함으로써 brillation. </li></ol></li></ol>

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핵심 과제는 생체 활성 화합물과 호환 솔루션을 유지하면서 긴 카테터를 통해 주사하는 용액을 수득한다. pH가 입성을 증가 증가해야하지만, 이러한 성장 인자와 같은 생리 활성 화합물은 신중하게 처리해야 깨지기 쉬운 분자이다. 우리는 밀접 어떤 생체 활성 성분을 첨가하기 전에 pH를 9.0 확인 hydrogelator 첨가 후 pH 미터를 사용하여 용액의 pH를 모니터링. 처음에는 PBS의 시작 pH를 조정 몇 차례 오른쪽의 pH로 종료 할 필요가 있었다. 우리는 비교적 점성 용액 및 가늘고 긴 카테터를 사용하기 때문에 또, 큰 압력 강하 (분사의 속도에 따라, 압력 0.5MPa의 순)으로 존재한다. 따라서, 특별한주의는 주사기와 카테터 사이의 올바른 연결을 선택에주의해야한다. 손으로 그런 힘을 적용하는 것과 주사기 펌프 지원 제어 주입은 도전이다. 용의 vitr이는 생체 내에서 조직의 자연 산도가 수행되는 동안 O 실험은, 용액, 염산 용액으로 중화하여 겔화시켰다. 따라서, pH의 오버 슈트를 방지하기 위해 HCl을 적당한 양을 추가하는 것이 중요하다. 이 산의 확산은 아마도 시험 관내 실험에서 하이드로 겔의 겔화에 제한 인자이고; 그러나, 생체 내에서 액을 중화 조직과 높은 접촉 표면적을 갖고있는 것이 거의 확실 결과적으로 더 빠르고 더 균일하게 겔화 진한 산의 첨가를 적가에 비해. 이전에 사용 된 방법 (0.5 시간 내지 2 대) (25)에 비하여 또, 겔 전환이 훨씬 빠르고 가벼운 절차이다. 재료 특성의 전환을위한 신체의 자연적인 산도를 사용하여 전환, 가역 신속하기 때문에 매우 매력적이다, 카테터 내부에서 발생하고 생체 내에서 완전히 자동으로 할 수 없습니다. 이러한 속성은 예를 들어 열 좋아 스위트를 통해 이점을 제공chable는 온도 변화로 인한 카테터에 겔화의 위험이 존재한다 (26)으로 인해 제한된 광 투과 및 래디컬 생성 (27), 또는 중합 개시제의 공동 - 주입을 필요로 겔에 도전 광 - 유도 중합, 필요 겔 겔화 또는 accellerator 28. 하이드로 겔에서 약물의 성공적인 출시는 크게 약물의 크기에 따라 달라집니다. 도시 된 바와 같이 일주 위에 모델 단백질의 서방이 성장 인자에 대한 전달 시스템 이러한 하이드로 겔의 가능성을 보여 주지만, 소분자 약물이 즉시 방출된다. 일반적으로, 하이드로 겔은 단백질, 엑소 좀 셀 29, 30와 같은 더 큰 객체의 전달 도구로 유망하다. 3-D 전기 매핑 및 주입 방법은 하이드로 겔과 같은 다양한 심근 재생 요법에 대한 임상 적 유효성 카테터 기반 배출 방법을 제공한다. adde다른 비수술 전달 기법에 비해이 기술의 D 값은 가능한 정상 동면 심근 경색과 차별화 및 관심 영역에 치료를 안내하게 치료 계획이다. 이 방법에 필요한 기술 능력과 시간이 소요 관심과 비싼 절차 (20)의 단점. 심근 경색 전기 매핑의 선물 돼지 모델에서 생리 활성 초분자 UPy - 하이드로 겔과 안내 심근 내 주입으로 이어졌습니다. 재생 치료와 다른 조합은 체외에서 테스트 할하고 생체 내에서이 새로운 분야에 더 많은 성공을 얻을 수 있습니다. 또한, 주 입성 및 살균 절차의 최적화를 성공적으로 임상에이 방법을 번역하기 위해 수행되어야한다.

급성 심근 경색의 치료에 크게 생존율을 개선 하였지만, 만성 허혈성 심부전 고령화로 진행 주요 공중 건강 문제이다. 2030 1, 2의 유병률 추정 25 % 증가 미국에서 약 600 만 심부전 환자가있다. 심근 조직의 초기 손실은 심장 리모델링에 이르게 결국 만성 심장 마비가 발생합니다. 심장 이식을 제외하고, 환자의이 그룹에 대한 실제 치료가 없습니다. 도너 하트 증가 단점 리모델링이 프로세스를 반대로 새로운 가능한 치료법을 개발해야 할 필요성을 강조한다. 따라서, 미래의 치료를위한 목표는 손실 심근의 재생이다. 하이드로 겔이 때문에 생체 적합성의 재생 의료 분야에서 흥미로운 물질이며, 외부 트리거 3 민감도. 주 사용 하이드로 겔은 광고를 제공최소 침습 수술 (4)에서의 사용이 아닌 주 사용 하이드로 젤을 통해 vantages. 이들 주사 가능한 하이드로 겔 인해 생리적 조건 5 내에서 전환 가능으로 주사기를 통해인가하고, 원칙적으로 6 접근 카테터 기반 주입을 허용 할 수있다. 다른 전략은 어느 온도, pH 및 전단 박화 거동 4,7,8 의한 물리적 가교에 주사 후 화학 가교에 이르기까지, 주사 가능한 물질에 사용되어왔다. 여러 시스템이 주사기 9,10를 통해 쉽게 입성을 표시했지만, 전체 카테터 호환성은 종종 6 표시되지 않았습니다. 초분자 폴리머로부터 제조 된 하이드로 겔 환경 트리거 (11)를 사용하여 비 - 공유 용액 상태로 겔로부터 편리하게 전환 할 수 상호 작용, 또는 그 반대로함으로써 형성된다. 또한, 저 분자량 전구체는 용이 가공성 12,13 허용 </sup&gt;. 이러한 어렵 같은 다양한 생물학적 활성 성분의 첨가는 성장 인자를 처리 할 수​​ 있도록 전환에 필요한 온화한 조건. 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)에 기초하여 물 초분자 일시적인 네트워크, 우레이도 - 피리 미디 논 (UPy)과 일단은 변성 14 잔기 생물 의학 응용과 함께 비공유 상호 작용의 이점을 도시하고 약물 전달 시스템으로 사용 된 마음 (6)과 신장 캡슐 (15) 아래에. 이러한 네트워크는 소수성 포켓을 형성하는 알킬 스페이서에 의해 수성 환경으로부터 차폐 UPy 집단의 이량 체화에 의해 형성된다. 우레아 수소 결합은 나노 섬유로 이들의 이량 후속 적층을 용이하게한다. pH 및 온도로 용액으로부터 겔을 전환 할 수 있으므로 인해 UPy-UPy 이합체 가역적 상호 작용, 예컨대 트리거한다. 합성 모티브의 사용은 시험에 의해 분자 겔 특성의 설계가 가능PEG-체인 및 알킬 스페이서 (14, 16)의 PLE 튜닝 길이. 또한, 여러 가지 생리 활성 성분은 단순히 각각 성장 인자 또는 엑소 좀과 같은 약물이나 생체 활성 종으로 주입 전에 hydrogelator 초분자 용액을 혼합하여 도입 될 수있다. 엑소 좀은 세포질 유도체를 포함하는 작은 소포 막이다. 그들은 많은 세포에 의해 분비되어 세포 간 통신에 참여하고 있습니다. 심근 세포 전구 세포로부터 유도 된 엑소 좀은 심장 (17)에 보호 역할을하는 것으로 제안된다. 여기서는 제형의 프로토콜을 기술하고, 이러한 생체 활성 초분자 수화 젤의 생체 심근 주입한다. 시험 관내 실험은 겔의 튜닝을 허용 겔 안정성 및 약물 방출 포핸드 지시에주고 전에 제거 특성을 설명한다 생체 내에서 응용 프로그램입니다.

<table><tbody><tr><td>1 M HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 24웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Amiodarone</td><td>Cordaron I.V. (Sanofini)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anton Paar Physica MCR501</td><td>Anton Paar GmbH</td><td></td><td>병렬 플레이트 형상 장착 (25 mm)</td></tr><tr><td>아트로핀</td><td>PCH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>풍선 인공 호흡기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary 50 스캔 UV 가시 분광 광도계</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse 형광 분광 광도계</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>제세동 패치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biosolve</td><td>44705</td><td></td></tr><tr><td>기관내 튜브</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>케타민</td><td>나르케탄 10 V&eacute; 토퀴놀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>매핑 카테터 115&nbsp; cm</td><td>Biosense 웹스터</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Actavis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MilliQ</td><td>MD Milipore MilliQ 통합 정수 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mRuby2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0.9% 500&nbsp; cc</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOGA 가이드 Myostar 주사 카테터</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOGA-RefStar EFO-patch</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pancuronium bromide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>IKAA3801100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PET millicel</td><td>Millipore</td><td>PIEP12R48</td><td></td></tr><tr><td>Pirfenidone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2116</td><td>100&nbsp에서 사용됨; DMSO</td></tr><tr><td>Sodiumthiopental</td><td>Inresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sufentanil</td><td>Sufentanil-Hameln</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPy-PEG10k</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vet 연고</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visipaque contrastfluid 100&nbsp; 참조</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

돼지 심장에 현지 카테터 주입 용 주사 및 약물로드 초분자 히드로 겔

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

손실 심근의 재생으로 인해 만성 허혈성 심부전의 증가 발생 및 기증자 마음에 제한된 액세스의 미래 치료의 중요한 목표이다. 심장의 기능을 복구하는 처리의 예는 하이드로 겔로부터 약물 및 생체 활성제의 전달 로컬로 구성된다. 본 논문에서는 방법이 공식화 및 비 침습적 및 측면 별 길고 유연한 카테터를 사용하여 돼지 심장에 약물이 장착 된 하이드로 젤을 주​​입하기 위해 도입된다. 카테터를 통한 3-D 전기 매핑 및 분사의 사용은 심근의 측면 특정 처리를 허용한다. 이 카테터와 호환 하이드로 겔을 제공하기 위해 초분자 수화 젤 때문에 환경 트리거를 사용하여 용액 상태에서 겔 편리한 스위칭 사용된다. 염기성 pH에서이 우레이도 - 피리 미디 논이 변성 폴리 (에틸렌 글리콜)이 쉽게 주입 될 수 뉴턴 유체로서 작용하지만, 생리 학적 pH에서 용액을 급속으로 전환젤. 우리는 시험 관내 및 생체 내 실험에서 모두 여기에 제시 이러한 온화한 전환 조건은 성장 인자 및 엑소 좀과 같은 생리 활성 약물과 생체 활성 종의 혼입 허용한다. 시험 관내 실험은 겔의 조정이 가능하고 생체 내에서 후속 프로그램 전에 제거 특성을 겔 안정성 및 약물 방출 포핸드 표시 상을 제공한다. 이러한 조합이 사용되는 생리 활성 화합물을 겔의 최적 튜닝 가능하며 종 및 주입 시스템.

용액과 겔 모두 진동형 유동 학적 측정으로부터 얻어진 전형적인 결과는도 1에 도시된다. 긴 카테터를 통한 주사를 들어, 저점도 뉴턴 유체가 바람직하다. 점도는 pH가 8.5에서 솔루션이 전단 숱이 있음을 보여주는하지만 0.54과 0.36 아빠의 지속적인 점도 · 초 의해 입증 pH가 9.0과 9.5의 솔루션으로 뉴턴 유체를 동작, 전단 속도의 함수로 측정하고, 각각 (그림 1A) . 샘플을 중화 한 후, 샘플은 &lt;1 (도 1b) &#39;손실 탄성률 G &quot;따라서 tanδ = G&quot;/ G보다 크고&#39;저장 탄성률 G 관찰 고체 형상의 응답을 나타낸다. 겔 30 분 이내에 최종 강도를 얻습니다. 진동 유동 학적 측정은 각 주파수의 거의 독립적 인 &#39;G와 일반적인 고체와 같은 반응을 보여측정 된 모든 주파수에 대한 uency 및 G &#39;&gt; G &quot;(그림 1C). 약물 전달 시스템으로 사용하기위한 필수는 시간에 하이드로 겔의 침식이다. 초분자 상호 작용은 본질적으로 동적이며 체외 겔 느린 부식을 허용. 침식 방출 실험은 다공질 웰 인서트 (도 2A와 B)를 사용하여 37 ℃에서 수행된다. 소수성 및 친수성 블록 (14)의 길이를 얻을 수있는 여러 주 동안 (도 3a)에 걸쳐 침식 겔을 튜닝함으로써. 겔 아마도 때문에 하이드로 겔의 초기 팽윤, 첫날 10 %의 초기 침식 2 주 25 % 침식. 예를 들어, 소분자 약물 (pirfenidone), 및 모델 형광 단백질 (mRuby2)의 릴리스의 방출 양을 연구 하였다. 형광 모델 단백질은 쉽게 판독을 허용; 그러나, 시험 관내 </em&gt; 박리 실험도 6 정량 ELISA를 사용하여 다른 단백질에 대해 수행 될 수있다. 단백질과 같은 큰 분자가 점차 일주 (그림 3B)를 통해 발표하는 동안 작은 분자 약물은, 하루 만에 해제됩니다. 반 경험적 Korsmeyer-Peppas 모델 60 % 릴리스까지 mRuby2의 릴리스 프로필을 피팅 인해 확산 (N = 0.44) 23 버전을 나타냅니다. (개정판) Korsmeyer-Peppas 모델의 오프셋 (offset)의 부재는 mRuby2 (24)에 대한 버스트 출시 존재가 없음을 보여줍니다. 때문에 pirfenidone위한 하부 방출의 60 %의 데이터 포인트의 제한된 양의 어떠한 피팅이 방출 프로파일에 대해 수행되지 않았다. 카테터 네비게이션 시스템은 통신 유닛 콘솔, 워크 스테이션 (도 4), 외부 기준 패치 삼각형 위치 패드 (낮은 자장을 발생), 2 개의 카테터, 센서 팁 매핑 injectio 이루어져N 카테터 (그림 5). 후 처리 분석이 불안정 포인트를 필터링 한 후 좌심실의 3D 심 내막 재건은 각각의 새로운 데이터 포인트의 획득 실시간으로 업데이트되며, 지속적으로 등급을 매긴 색 눈금 (그림 6A)에 유니 폴라와 바이폴라 전압 전위로 표시됩니다. 지역 선형 단축 (LLS) 함수는 최종 수축기 및 최종 이완기에서 샘플 사이트와 인접한 점 사이의 거리의 평균 변화를 취득하여 국소 벽 운동을 정량화. 평균 전압과 LLS 값은 각 세그먼트에 대해 계산 극성지도. (그림 6B)에 표시됩니다. 이상 또는 낮은 단극 전위 (≤6 MV) 및 장애인 기계적 활동 (LLS ≤4 %)의 존재는 경색 영역 (22)의 특징. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig1highres.jpg"폭 = &quot;700&quot;/&gt; 그림 1 :. 솔루션과 젤의 유변학 적 평가. 다른 pH에서 솔루션에 대한 전단 속도의 함수로 () 점도. pH가 8.5 전단 담화에서 샘플 관찰되지만 pH가 9.0에서 샘플 및 9.5 상수 점도 이러한 솔루션의 뉴턴의 동작을 보여 얻을 수있다. 시간의 함수로서 황갈색 δ 플로팅 하였다 (B) 겔 경화. 2 시간 경화 후 중화 샘플 (C) 주파수 스위프. 오차 막대는 전형적인 실험 오차를 나타내는, 3 독립적 인 측정의 표준 편차를 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig2highres.jpg" width="600" /> 그림 2 :. 분해 설정 및 해제 실험 (A) 폴리 (에틸렌 테레 프탈레이트) 잘 파라 필름으로 덮여 삽입 누출 지속 시간을 방지하기 위해준비를 보내고. 용매의 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로 포장 (B) 삽입과 24 웰 플레이트. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig3highres.jpg" width="700" /> 그림 3 :. 시간이 지남에 따라 하이드로 젤의 침식 및 릴리스 () 침식. 적어도 2 주 겔적인 부식이 관찰된다. 작은 분자 약물 및 모델 단백질의 (B) 릴리스. 작은 분자 일 이내에 방출되지만, 모델 단백질 점차 중요한 버스트 방출없이 주 동안 방출된다. 라인은 출시 초기 단계에 Korsmeyer-Peppas 모델의 적합성을 보여줍니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig4highres.jpg" width="600" /> 그림 4 : 카테터 네비게이션 시스템. </노가 XP 심장 네비게이션 시스템과 강한&gt; 통신 장치 콘솔. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig5highres.jpg" width="700" /> 그림 5 (A) 부착 주사기와 심근 내 주입 카테터. (B) 주사 바늘의 세부 사항입니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig6highres.jpg" width="700" /> 그림 6 : 유니 폴라 전압과 LLS지도. () 유니 폴라지도, LAO보기 (위)과 황소 눈 (아래). 붉은 색은 전기 활동의 외측의 손실 심근베이스 (정상)에서 낮은 극성 전압 값을 나타냅니다. 녹색과 노란색 색상 가능성을 감소 나타냅니다 동안 블루, 정상 심근을 나타냅니다. (B) LLS지도, LAO보기 (위)과 황소 눈 (아래). 붉은 색 바랭이외측 벽에 TES 무 운동은 녹색과 노란색 벽의 움직임을 감소 나타냅니다. 매핑 포인트는 하얀 점으로 표시됩니다. 흰색으로 그려진 선은 전압 감소 단 극성 장애와 벽 움직임을 특징으로 관심 영역을 나타내고있다. 갈색 점은 주사 부위를 나타낸다.

우레이 - 피리 미디를 기반으로 초분자 수화 젤은 거시적 인 겔 특성과 산도를 사용하여 졸 - 겔 (sol-gel) 스위칭 동작을 완벽하게 제어 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 돼지 심장 관련 분야에서 직접 로컬 전송을위한 카테터 전달 시스템을 통해 이러한 초분자 hydrogelator 제형 및 주입 프로토콜을 제시한다.

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

본 절차의 전반적인 목표는 길고 유연한 카테터를 사용하여 약물이 탑재된 초분자 하이드로젤을 경색된 돼지 심장에 최소 침습적으로 주입하는 것입니다. 이를 위해 먼저 하이드로젤 제형과 원하는 약물을 준비합니다. 두 번째 단계는 인비트로(in vitro) 환경에서 하이드로젤의 특성과 약물 방출 속도를 조사하는 것입니다.그 후 심근경색 4주 뒤에 심내막 표면에서 채취한 데이터 포인트를 사용하여 돼지 좌심실의 전기기계적 지도를 작성합니다. 그런 다음 소위 휴면 심근(hibernating myocardium)을 대상으로 약물이 탑재된 하이드로젤을 국소 주입합니다. 이러한 편리한 제형과 적용 절차는 심근경색 등에 대한 새로운 치료법을 발견하는 계기가 될 수 있습니다.기존의 관상동맥 내 주입과 같은 경피적 접근 방식과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 첫째, 카테터를 이용한 하이드로젤 도포가 가능하다는 점이며, 둘째, 치료 계획을 수립하여 관심 영역으로 카테터를 안내할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 기계적 지지 물질 주입의 잠재적 이점과 지속적인 국소 약물 전달의 효과와 같이 심근경색의 연구 및 치료에 있어 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 함의는 심근경색 치료로 확장되는데, 이는 전기-기계적 매핑을 통해 경색 부위를 식별할 수 있고, 이후 유도된 부위 특이적 하이드로젤 주입을 통해 국소 약물 전달이 가능하기 때문입니다.일반적으로, 이 방법은 카테터의 미세한 움직임에 대한 숙련된 기술과 안정성 파라미터 모니터링이 동시에 필요하기 때문에 수행하기 어렵다는 점이 알려져 있습니다. 약물을 함유한 IDE 겔의 제형화와 카테터를 통한 주입 모두 까다로운 과정이며 경험 없이는 수행하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 준비 단계에서는 10% w/v 농도의 하이드로겔 1 mL를 제형화합니다.먼저 pH 11.7의 PBS 900 µL에 하이드로젤 100 mg을 녹여 준비합니다. 하이드로젤이 동물 주입용으로 제조된 경우, 모든 단계는 장갑을 착용한 상태에서 수행해야 합니다. 그다음 하이드로젤을 70 °C에서 한 시간 동안 PBS에 넣고 교반합니다.용액이 식으면 pH를 확인하십시오. pH는 9 내외여야 합니다. 이 용액은 수일 동안 보관하여 사용할 수 있습니다.이제 관심 있는 약물이나 분자를 용액에 피펫으로 넣고, 하이드로겔을 동물에 주입할 경우 10분 동안 교반합니다. 용액을 1시간 동안 UV 멸균하여 준비 과정을 마무리합니다. 텍스트 프로토콜에서 하이드로겔의 분석 방법을 검토합니다.먼저, 24웰 플레이트용 플라스틱 행잉 세포 배양 인서트의 바닥을 파라필름으로 덮어 누출을 방지하여 준비합니다. 그런 다음 준비된 점성 용액 100 µL를 인서트로 옮기고, 즉시 1 M 염산 1.4 µL를 첨가합니다. pH가 중성 값으로 떨어지며 30분 후에 하이드로겔이 경화됩니다.이제 파라필름을 제거하고 인서트를 웰 플레이트에 넣은 후, pH 7.4의 PBS 800 microliters를 가합니다. 비어 있는 웰에도 PBS를 채우고 증발을 줄이기 위해 파라필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 그 후 37 degrees Celsius에서 완만한 교반과 함께 플레이트를 배양합니다. 주기적으로 PBS를 교체하고, 제거된 PBS를 분석하여 하이드로젤 침식 및 약물 방출에 따른 방출 화합물을 분석합니다.중재 심장 전문의인 urich의 Ton 박사가 해당 절차를 시연하겠습니다. 심근경색 유도 4주 후, 전기기계적 매핑 절차를 계획하고 카테터실(cath lab)에 시스템을 설정합니다. 먼저 마취된 돼지의 등 쪽에 외부 참조 패치를 부착한 다음, 표준 프로토콜에 따라 대퇴동맥을 통해 혈관 접근로를 확보합니다.LV 심내막 표면의 전기기계적 맵을 구축하려면 초저자기장 에너지원과 센서 팁 카테터를 사용하십시오. 다음으로, 파워 인젝터를 사용하여 25도 우전방사투영 및 40도 좌전방사투영 뷰에서 좌심실 혈관 조영술 biplane 영상을 얻으십시오. 이 뷰들을 사용하여 LV의 크기를 추정하십시오.이제 동물에게 kg당 75 unit의 heparin을 투여하십시오. 그런 다음 투시 가이드 하에 8 French 매핑 카테터를 하행 대동맥, 대동맥궁 및 대동맥판막을 거쳐 좌심실로 진입시킵니다. 카테터는 D형 또는 F형 커브 형태일 수 있습니다.그런 다음 카테터 팁을 좌심실의 심첨부로 향하게 합니다. 첫 번째 데이터를 획득하기 위해 유출로, 외측 및 후측 지점에서 데이터 수집을 계속하여 심실의 경계를 정의하는 3D 실루엣을 형성합니다. 다음으로, 매핑 카테터를 심내막 위로 순차적으로 끕니다.팁이 심내막에 접촉해 있는 동안 위치를 획득합니다. 최종적으로 모든 심내막 분절에서 데이터를 수집합니다. 그런 다음 해당 데이터를 사용하여 매핑 카테터를 제거합니다.표적 영역을 정의합니다. 이곳은 전기적 활동은 정상에 가깝지만 기계적 움직임은 손상된 부위입니다. 이는 심근 내 주입을 위한 소위 휴면 심근(hibernating myocardium) 영역입니다.특정 양을 전달하기 위해 27게이지 바늘과 8 French 카테터의 코어 루멘으로 구성된 주입 카테터를 사용하십시오. 약 1 mL의 하이드로겔 용액이 담긴 Lotus 시린지를 시린지 펌프에 장착하여 바늘에 의해 심근벽이 천공되지 않도록 합니다. 최근 실시한 심초음파 검사에서 측정된 심실의 최소 벽 두께에 따라 조절을 수행합니다.바늘 신장 길이를 0도와 90도로 조정합니다. 그런 다음 시스템의 데드 스페이스를 하이드로겔 용액으로 채웁니다. 다음으로, 첫 번째 주입 기준을 충족하기 위해 주입 카테터 팁을 대동맥판막 너머 표적 영역에 배치합니다.그것은 카테터와 LV 벽의 수직도입니다. 둘째, EMM 시스템으로 계산된 루프 안정성이 우수해야 합니다. 셋째, 대상 영역의 기저 전압이 최소 6.9 millivolts여야 합니다.이러한 기준들이 충족되면 바늘을 심근 안으로 진입시킵니다. 이제 네 번째 기준을 확인하십시오. 좌심실의 조기 심실 수축이 나타나야 합니다.모든 기준이 충족되면 0.1에서 0.3 milliliters의 하이드로겔을 일정한 속도로 주입하십시오. 하이드로겔이 약물 전달 시스템으로 기능할 수 있도록 가능한 한 분산된 6~10개의 서로 다른 위치에 주입을 반복하십시오. 침식은 점진적으로 일어나야 하며, 소량의 약물인 pirfenidone과 형광 단백질인 ruby two의 방출을 연구하였습니다.In vitro 환경에서 저분자 약물은 하루 이내에 방출된 반면, M ruby two와 같은 고분자 분자들은 일주일에 걸쳐 방출되었습니다. 약물 주입을 위한 표적 부위를 결정함에 있어 고분자 분자의 뚜렷한 초기 급격 방출(burst release)은 나타나지 않았습니다. 좌심실의 재구성을 생성하기 위해 실시간 3D 심근 매핑이 사용되었습니다.이는 단계별 색상 척도로 전압 전위로 계속 표시되며, 이후 선택한 임계값으로 조정됩니다. 국소 선형 단축(local linear shortening, LLS) 기능은 수축기와 이완기 말에 샘플 지점과 인접 지점 사이의 평균 거리 변화를 구함으로써 국소 벽 운동을 정량화합니다. 이렇게 구해진 값들은 각 세그먼트별로 계산되어 폴라 맵(polar map)에 표시됩니다.경색 부위는 기계적 민감도가 손상되었거나 LLS 값이 4% 미만인 것이 특징이며, 6 mV 미만의 비정상적이거나 낮은 단극 전위를 나타내는 특징이 있습니다. 이 기술을 숙달하면 1시간 반에서 2시간 정도에 걸쳐 수행할 수 있습니다. 이 시술을 진행할 때는 적절하게 계획하고 경험 많은 팀원들을 구성하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 최적의 하이드로겔 제형, 원하는 약물 방출 속도, 그리고 다양한 종류의 약물 효능과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 치료법의 변형을 구현할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 약물이 탑재된 초분자 하이드로젤을 제조하는 방법과 전기기계적 매핑 및 심근 내 주사 절차를 세심하게 계획하고 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 돼지와 같은 실험 동물을 다룰 때는 반드시 실험 위원회의 승인을 받아야 하며, 지역 동물 복지 규정에 따라 수행해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

decellularized 조직에서 주사용 매트릭스 젤을 준비하고 밀고 myocardium에 주입을위한...

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

이 비디오에서는 약물 및 추적 염료와 같은 실험제를 생체 내에서 정맥 주사할 수 있는 마우스 모델의 경정맥에 카테터를 이식하는 방법을 설명합니다. 이러한 배열은 다른 시스템에 연결될 때 혈역학 및 혈액 샘플링을 모니터링하는 데에도 사용할 수 있습니다.

카테터 기반 실험제의 정맥 주사: 마우스 모델에서 경정맥을 통해 실험제를 정맥 주사하는 기술

이 프로토콜은 하이드로겔 시스템과 피브린 기반 접착제를 사용하여 심근 경색의 줄기 세포 치료를 위한 불량한 세포 생착의 한계를 완화하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법을 사용하면 경색 후 세포와 조직의 접촉을 유지할 수 있어 손상 부위에서 유익한 제제의 치료 잠재력을 높일 수 있습니다.

하이드로 겔은 구축 및 쥐 심근 경색 모델에서 치료를 제공하기 위해 접착제 접근을 섬유소 기반.

폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드) - -graft 콘드로이틴 설페이트 이루어지는 주사 조직 공학적 지지체는 (PNIPAAm-g-CS) 함유 알긴산 미립자를 제조 하였다. 속성 및 생체 적합성 시험 관내에서 팽윤 접착력은 본 연구에서 분석된다. 여기서 개발 된 특성화 기술 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.

조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성

이 프로토콜은 MRI와 전체 심장 심근 조직의 3 차원 비교를위한 새로운 방법을 설명합니다. 이는 심근 경색의 만성 돼지 모델의 경색 경계 영역에서 심근 내 주입의 정확한 평가를 위해 설계되었습니다.

3D 전체 심장 심근 조직 분석

심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

우리는 허혈성 심장 질환의 폐쇄 가슴 돼지 모델을 만들기 위해 3 차원 인쇄 관상 동맥 임플란트의 경피 적 전달을위한 새로운 비용 효율적이고 효율적인 기술을 설명합니다. 임플란트는 높은 성공률을 가진 어머니와 자식 확장 카테터를 사용하여 제자리에 고정되었습니다.

허혈성 심장 질환의 돼지 모델에 3D 인쇄 관상 동맥 협착 임플란트의 배포를위한 새로운 경피적 인 접근 방식

줄기 세포 기지를 둔 치료는 심근 경색 후에 부상당한 심장 조직을 복구하는 능률적인 전략으로 부상했습니다. 우리는 효소적으로 교차 연결 될 수있는 젤라틴 하이드로 겔을 사용하여 줄기 세포 이식에 대한 최적의 생체 내 응용 프로그램을 제공합니다.

Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

이 프로토콜은 주사용, 초분자 폴리머 나노입자(PNP) 하이드로겔 생체 재료의 합성 및 제형을 설명합니다. 약물 전달, 바이오 의약품 안정화 및 세포 캡슐화 및 납품을 위한 이러한 물질의 적용이 입증된다.

세포 및 약물 전달 응용 을 위한 주사용 수급 분자 고분자 고분자 나노 입자 하이드로겔

본 프로토콜은 돼지 모델에서 심장 활성 치료제를 투여하는 세 가지 방법을 설명합니다. 암컷 재래종 돼지는 (1) 개흉술 및 경심막 주사, (2) 카테터 기반 경심 주사 또는 (3) 경정맥 삼투압 미니 펌프 를 통한 정맥 주입을 통해 치료를 받았습니다.

돼지 심근 경색 모델에서 심장 활성 치료제 전달

이 기사에서는 29G x 88mm 바늘을 사용하여 심근경색의 쥐 모델에서 심초음파 유도 심근내 주사를 위한 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 기술은 경색 주위 부위에 직접 치료제를 강력하고 정확하며 재현 가능한 전달을 보장합니다.

심근경색의 쥐 모델에서 표적적이고 신뢰할 수 있는 심근내 줄기세포 전달을 위한 심초음파 유도 주사

학습하세요 심근경색 치료를 위한 약물 로드 초분자 히드로겔을 카테터를 이용해 돼지 심장에 주사하는 최소침습 방법을. 이 기술은 국소 약물 전달과 기계적 지지를 통한 새로운 심혈관 치료 전략을 제시합니다.

돼지 심장에 현지 카테터 주입 용 주사 및 약물로드 초분자 히드로 겔

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