Name: Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 학습하세요 제브라피시 태아에서 기계적 혈관 손상을 유도하는 방법을. 미세 핀으로 미궁정맥을 천자하여 지혈과 상처 치유를 실시간 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 혈관 생물학 연구에 유용합니다.

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저자는 도움이 되는 토론을 해준 스티븐 윌슨(Stephen Wilson) 박사와 리사 윌스바허(Lisa Wilsbacher) 박사에게 감사를 표한다. 이 작업은 NIH HL054737의 일부 지원을 받았습니다.

참고 : 제브라 피쉬를 사용하는 절차는 UCSF의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 도구 1. 준비 <ol><li> 핀 홀더에 특징점 핀을 삽입하고 핀을 고정. </li><li> 좋은 팁 집게를 사용하여 조심스럽게 약간의 훅을 만들기 위해 핀의 끝을 구부리십시오. </li><li> 조작 부상 중에 배아 안정화, 펜치를 이용한 인슐린 주사기에 장착 ½ 인치 28 게이지 바늘 끝을 구부리. </li></ol> 부상에 대한 제브라 피쉬 배아 2. 준비 <ol><li> 제브라 피쉬의 번식 쌍을 설정하고 이전에 (22)과 같이 계란 물 (60ug / mL의 수족관 염)에서 계란을 수집합니다. </li><li> 배아는 약 melanization을 방지하기 위해 8 시간 포스트 수정 (HPF) 때 달걀 물에 0.003 % N-페닐 티오 (PTU)를 추가합니다. </li><li> 좋은 팁 집게를 사용하기 전에 실험에 Dechorionate 이일 포스트 수정 (DPF) 배아. <br/&gt; 참고 : 순환이 시작된 후 태아가 언제 부상을 입을 수 있습니다. 여기에 제시된 데이터는 배아 DPF 2이지만, 기술이 성공적 5 DPF까지 배아 적용되었다. </li><li> 0.02 % 버퍼링 -3- 아미노 벤조산 (Tricaine) 조작 이전에 약 10 분으로 배아를 마취. </li></ol> 3. 기계 선박 태아의 부상 <ol><li> 전송 피펫을 사용하여 해부 실체 현미경에 우울증 슬라이드에 마취 된 배아를 전송합니다. </li><li> 지배적 인 손으로 배아를 조작 주사기 바늘의 짧은 평평한면을 사용하여, 바늘에서 떨어져 대향 복부 표면과 측면에 위치 배아. </li><li> 팁과 특징점 핀이 비뇨 생식기 개방에 물고기 후방의 복부 표면에 직접 지적 놓습니다. 약간의 각도에서 특징점 핀의 위치를 같은 곡선 팁은 꼬리 정맥 (그림 1 &lt;에 직접 주피 관통 할 수 있는지/ strong&gt;을). </li><li> 배아를 조작 주사기 바늘을 이용하여 정맥 내로 약간 핀 후크 핀에 배아를 두드려 특징점 핀 꼬리 정맥을 관통. </li><li> 주사기 바늘을 이용하여 용기 내의 작은 눈물을 만들 떨어진 특징점 핀으로부터 배아를 당긴다. 주 : 성공적인 부상 정맥에서 즉시 출혈이 발생합니다. </li></ol> 지혈 4. 분석 <ol><li> 눈에 띄게이 절차 혈액 세포를 순환 만 배아를 선택합니다. </li><li> 즉시 특징점 핀이 용기로부터 인출 될 때 타이머를 시작하도록 준비한다. </li><li> 즉시 출혈량 상처 시각화 될 수 타이머를 시작. 상처에서 출혈이 중단되면, 타이머를 중지하고 출혈 시간으로 총 시간을 기록한다. 응고 억제하면 더 이상 가시적 순환 혈액 세포가 없을 때까지의 시간을 기록한다. </li></ol> 상처 치유 5. 분석 <ol><li> 전송 POS현미경 유리 바닥 이미징 요리 상 t-부상 동물. </li><li> 계란 물의 대부분을 제거합니다. </li><li> ºC (42) 사이에 45로 가열하고 0.02 % Tricaine 보충 아가로 오스 계란 물에 용해 0.3-1.2 % 저 융점의 배아를 커버. </li><li> 집게를 사용하여 자신의 양쪽에 위치 배아. </li><li> 아가로 오스의 온도가 내려 가면, 달걀 물에 0.02 %의 Tricaine와 접시를 채운다. </li><li> 시야, 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득. </li><li> 집게를 사용하여 아가로 오스에서 배아를 제거하고 달걀 물로 다시 전송합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

지브라 피쉬 10 부상 레이저 부상 13-15, 레이저 유발 혈전증 (16), 및 상피의 상처를 포함한 다양한 유형의 모델로서 성공적으로 사용되어왔다. 우리는 실행할 간단하며 실시간 현미경에 매우 의무가 생체 내 모델에서 부상 제어 기계적 상처를 생성하는 방법을보고한다. 신속한 지혈하고 측정 응답 및 비디오와 t​​imelapse에 현미경을 사용하여 모니터링 할 수 재현성 상처 복구 프로그램 부상 결과. 그들의 단순하고 틀에 박힌 혈관 정의 현미경으로 접근 사이트에서 재현 부상을 허용 해부학, 대부분의 혈관과 조혈 세포 유형의 존재는 부상에 대한 응답을 연구하는 제브라 피쉬 배아에 특히 유용합니다. 그러나, 제브라 피쉬 배아는이 시스템 대부분의 AP를 제작, 개발 5,6의 첫 번째 주 동안 기능 림프구가 없습니다염증과 수리 타고난 면역의 기여를 공부 방법은 적절한. 현재, 형질 전환...

제브라피쉬는 혈관 발달, 혈관 신생, 조혈 발달 및 병리학1-3을 포함한 혈관 생물학의 다양한 주제를 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 배아는 수정 후 1일(dpf)까지 백혈구 및 선천면역계의 다른 구성 요소뿐만 아니라 기능적 순환을 발달시킵니다 1,4,5. 손상에 대한 염증성 및 백혈구 반응의 보존은 제브라피시 배아를 결핵 감염, 장염 및 조직 재생과 같은 다양한 염증 과정에 대한 정보 모델로 만들었습니다6-9. 제브라피시 배아는 특히 상피 손상과 호중구 반응의 맥락에서 부상 관련 염증을 연구하는 데 사용되어 왔다10,11. 배아에 대한 손상은 손상 부위의 세포와 손상에 반응하고 그 해상도를 조절하기 위해 모집된 선천성 면역 세포로부터 고도로 보존된 세포 반응을 초래합니다11,12. 다른 부상 모델은 집속 레이저 펄스를 사용하여 뉴런, 근육 세포 및 심근 세포13-15를 포함한 특정 세포 유형에 대한 손상을 공간적으로 국소화했습니다. 
제브라피시 배아는 기계적 혈전과 레이저 유도 혈전 형성을 모두 사용하여 약리학적 및 유전자 조작 조건에서 지혈 및 혈전증을 연구하기 위한 모델로 사용되었습니다16-19. 응고 캐스케이드(coagulation cascade)의 구성 요소는 잘 보존된 것으로 보이며 형질전환은 응고 부위에서 혈소판 세포 및 피브린 침착에 대한 자세한 연구를 가능하게 했습니다17,20,21. 이 논문에 제시된 절차는 혈관 파손, 혈전 형성 및 해결, 혈관 수리를 초래하는 기계적 혈관 손상을 연구하기 위한 시스템을 제공함으로써 이러한 방법을 보완합니다.

<table><tbody><tr><td>Minutia Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>팁 직경 0.0125 mm, 막대 직경 0.1 mm</td></tr><tr><td>핀 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Tip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Glass Depression Slide</td><td>Aquatic Eco-Systems</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Agarose</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>50081</td><td>42 &ordm으로 예열; C</td></tr><tr><td>, N-Phenylthiourea(PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td>, <td>P7629</td><td></td></tr>, <tr><td>3-aminobenzoic acid(Tricaine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr>, <tr><td>Hirudin</td><td>, Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 이미징 접시</td>, <td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td>, <td>Olympus</td><td>SZH10</td><td></td></tr>, <tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>수족관 소금</td><td>인스턴트 오션</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기 28.5 G 바늘</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>329461</tr></tbody></table>

zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

얼룩말(Danio rerio) 배아는 다양한 발달 및 질병 과정을 연구하는 데 강력한 모델임이 입증되었습니다. 외부 발달 및 광학적 투명성으로 인해 이러한 배아는 특히 현미경 검사에 적합하며, 형광 단백질로 특정 세포 유형을 표지하는 수많은 형질전환 세포주를 사용할 수 있으므로 제브라피시 배아는 생체 내 손상 및 복구 중 혈관, 조혈 및 기타 세포 유형의 상호 작용을 시각화하는 데 이상적인 시스템입니다. 제브라피쉬의 정유전학(forward and reverse genetics)이 잘 발달되어 있으며, 약리학적 조작이 가능합니다. 우리는 지혈 및 혈관 복구를 포함한 혈관 손상에 대한 반응을 연구하기 위해 이러한 기능 중 몇 가지를 활용하는 미세 조작 기술을 사용하여 기계적 혈관 손상 모델을 설명합니다. 비디오와 타임랩스 현미경의 조합을 사용하여 이 혈관 손상 방법이 지혈 및 상처 복구 중에 측정 가능하고 재현 가능한 반응을 일으킨다는 것을 입증합니다. 이 방법은 전체 동물 모델에서 혈관 손상 및 복구를 자세히 연구할 수 있는 시스템을 제공합니다.

기계 혈관 손상은 배아 (- C도 2A), DPF (2) 상에 수행 하였다. 신속하고 신뢰성있는 응집 부상 응답 결과 (도 2D)를 출혈 중단 시간에 의해 측정. 응고 반응의 차이를 측정 할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 항응고제 히 루딘은 (대 직전 (5-10 NL을 물에 용해 히 루딘 μL 당 1 단위)을 상처에 퀴비에의 덕트 내로 주입하여 배아 투여했다 퀴비에의 덕트에 주사의 데모는, 이전 조브 제 23 조) (24)을 참조하십시오. 부상 이전에이 결과 히 루딘의 관리는 크게 차량 제어 (그림 2D)에 비해 배 출혈 증가했다. (: EGFP kdrl) 및 적혈구 (gata1a : 혈관 손상과 응고의 증거는 내피 세포에 대한 유전자 변형 라인을 사용하여 즉시 후 부상을 볼 수는 DsRed </...

이 기사는 제브라피시 배아에서 기계적 혈관 손상을 일으키는 방법을 설명합니다. 이 부상 모델은 실시간 현미경 검사에 이상적으로 적합한 유기체에서 지혈, 부상 관련 염증 및 상처 치유를 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다.

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

다음 절차의 전반적인 목적은 제브라피쉬 배아에 기계적인 혈관 손상을 유도하는 것입니다. 이는 미세 핀을 사용하여 제브라피쉬 배아의 총배관(coddle vein)을 천자함으로써 수행됩니다. 그 다음, 상처 부위에서 혈액이 활발하게 흐르는 시간을 측정하여 지혈 상태를 평가합니다.그다음, 혈관 복구와 같은 상처 치유 양상을 시각화하기 위해 타임랩스 현미경 관찰을 수행합니다. 결과에 따르면 제브라피시 배아의 기계적 혈관 손상은 출혈 시간 및 혈류 재개 시간과 같은 지혈 및 상처 복구 양상을 재현성 있게 측정하는 데 활용될 수 있음을 보여줍니다. 생쥐나 다른 표준 손상 모델과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 제브라피시 배아에서 염증, 지혈 및 복구 과정을 실시간 현미경으로 용이하게 시각화할 수 있다는 점입니다.먼저, 미뉴티아 핀을 핀 홀더에 삽입하고 미세 핀셋을 사용하여 핀을 고정합니다. 핀의 끝부분을 조심스럽게 구부려 약간의 갈고리 모양을 만들어, 손상 유도 과정 동안 배아를 조작하고 안정화할 수 있도록 합니다. 니들 노즈 플라이어를 사용하여 인슐린 주사기에 장착된 28 gauge, 1/2 inch 바늘의 끝을 구부립니다.다음으로, 이전에 설명한 대로 브리딩 쌍을 설정하고 egg water로 알을 수집하여 제브라피시 배아를 준비합니다. 수정 후 8~24시간(HPF)이 되면, 수정 후 2일(DPF)에 색소 형성을 방지하기 위해 egg water에 PTU를 첨가합니다. 미세 핀셋을 사용하여 배아의 난막을 제거하고, 최종 농도 0.02%의 Buffered tricaine을 사용하여 배아를 마취시킨 후 배아 혈관에 기계적 손상을 입힙니다.트랜스퍼 피펫을 사용하여 마취된 배아를 오목 슬라이드 위에 올립니다. 해부 현미경 아래에서 주로 사용하는 손에 주사바늘의 짧고 평평한 면을 잡고, 배아의 복측 표면이 바늘 반대 방향을 향하도록 배아를 옆으로 눕힙니다. 이제 미뉴시아 핀의 끝이 비뇨생식공 뒤쪽의 물고기 복측 표면을 직접 향하도록 배치합니다.곡선형 팁이 외피를 뚫고 곧바로 배꼽맥으로 들어갈 수 있도록 약간의 각도를 유지하며 잡으십시오. 그런 다음 주사기 바늘을 사용하여 배를 조작합니다. 미세 핀을 사용하여 배꼽맥을 뚫는데, 주사기 바늘로 배를 핀 쪽으로 톡톡 쳐서 핀이 맥에 살짝 걸리도록 합니다.배아를 미뉴셔 핀(minutia pin)에서 끌어당겨 혈관에 작은 찢어짐을 만듭니다. 손상이 성공적으로 이루어지면 정맥에서 즉시 출혈이 발생합니다. 이 절차를 위해, 혈구의 순환이 육안으로 확인되는 배아만을 선택하십시오.미뉴셔 핀(minutia pin)을 꽂은 상태에서 혈관으로부터 핀을 뽑고, 상처 부위에서 출혈이 관찰되는 즉시 타이머를 시작하십시오. 상처 부위의 출혈이 멈추면 타이머를 중지하고 총 시간을 출혈 시간으로 기록하십시오. 응고가 억제된 경우에는 더 이상 가시적으로 순환하는 세포가 없는 시점을 기록하십시오. 부상 후 동물들을 현미경 관찰을 위해 유리 바닥 이미징 디쉬로 옮기고, 배양액(egg water)의 대부분을 제거하십시오. 그 다음 0.02% trica가 첨가되어 42에서 45 °C 사이로 가열된 0.3 내지 1.2% 저융점 아가로스(low melting agarose)로 배아를 덮으십시오.포셉을 사용하여 배아를 옆으로 눕힙니다. aro가 식은 후, 배양 접시에 egg water에 희석한 0.02% trica를 채웁니다. 이미징 후 명시야 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.포셉을 사용하여 배아를 다시 난수(egg water)로 옮깁니다. 이 영상은 2D PF 배아에 가해진 기계적 혈관 손상을 보여줍니다. 활동성 출혈이 관찰된 후 출혈이 멈추는 것을 볼 수 있으며, 출혈 정지 시간으로 측정된 손상 결과는 신속하고 신뢰할 수 있는 응고 반응을 나타냅니다. 이는 응고 반응의 차이를 측정할 수 있는지 여부를 결정하기 위함입니다.손상을 입히기 직전, 항응고제 odin을 QVA 관에 주입하여 배아에 투여하였습니다. 여기에서 보시는 바와 같이, 이 약물은 대조군에 비해 출혈 시간을 유의하게 증가시켰습니다. 본 영상에서는 혈관 내피 및 적혈구 마커 형질전환 라인을 사용하여, 부상 직후 혈관 손상과 응고의 증거를 확인할 수 있습니다.상처 치유의 서로 다른 단계들을 보여주기 위해 12시간 동안 5분 간격으로 이미지를 획득하였습니다. 이 영상을 시청한 후에는 제브라피쉬 배아에 기계적 손상을 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

제브라피시 성체 신경 발생 및 재생의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 제브라피시 성체 텔렌스팔론에서 기계적 손상을 일으키는 침습적 수술과 면역조직화학 또는 현장 교잡화에 의한 찌른 반구의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다.

Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

제브라피쉬는 유전 및 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 비드 이식은 국소 세포 환경에 변화를 일으켜 발달 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 귀중한 조직 조작 기술입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 마이크로비드 이식을 수행하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

이 프로토콜의 목적은 생리적 및 병리학적 조건 모두에서 배아 제브라피시의 분절 심장 기능 평가를 위한 새로운 방법을 자세히 설명하는 것입니다.

심근 기계 변형의 변위 분석 (DIAMOND) 배아 제브라피시에 있는 심장 기능의 분할 이질성을 제시합니다

우리는 무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 및 후속 신경 재생의 기초 메커니즘에 따라 병리학의 폭을 검사하기 위해 성인 얼룩말 물고기에 대한 Marmarou 체중 드롭 모델을 수정했습니다. 이 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 인간의 TBI에서 관찰 부상 이질성을 다시 수상.

성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

성체 제브라피시에서 새로운 복강내(IP) 주사 방법에 대해 설명합니다. 독소루비신(doxorubicin)과 같은 독성 화합물을 취급할 때 이 절차는 이전에 보고된 두 가지 IP 방법보다 더 효과적입니다. 이 기술은 제브라피시 모델에 대한 경험이 제한된 연구원들이 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었습니다.

성체 제브라피시의 복강 내 주사 기법으로 신체 손상 및 관련 폐사율을 최소화합니다.

이 프로토콜은 미세 수술을 통해 발달 중인 제브라피시 심장에 자기 구슬을 이식하는 방법을 설명하여 생체 내에서 기계적 힘을 조작하고 심내막 세포에서 기계적 자극 의존성 칼슘 유입을 트리거할 수 있습니다.

자성 구슬을 사용하여 발달 중인 제브라피시 심장의 기계적 힘 조작

이 프로토콜은 제브라피쉬 배아의 심장 형태 및 기능을 평가하기 위한 저비용 광학 현미경 방법을 설명하여 고급 이미징 시스템 없이도 발달 심장 독성을 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

표준 현미경 및 비디오 분석을 사용한 제브라피쉬 배아의 기능적 심장 영상: 환경 및 생물 의학 연구에서의 응용

학습하세요 제브라피시 태아에서 기계적 혈관 손상을 유도하는 방법을. 미세 핀으로 미궁정맥을 천자하여 지혈과 상처 치유를 실시간 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 혈관 생물학 연구에 유용합니다.

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

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