Name: 나노 바디 및 항체 기반의 검증 생체 종양 이종 이식 NIRF 이미징 실험 사용 전의 VIVO 유동 세포 계측법 및 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 학습하세요 생체 내 근적외선 형광 이미징의 생체 외 검증 방법을 마우스 종양 이종이식 모델에서 나노바디 및 항체를 이용한 유동 세포 계측법과 현미경으로 확인하는 기술입니다.

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이 작품은 독일 연구 협회의 공동 연구 센터 877 (프리드리히 코치 - 놀테)에 의해 대학원 &#39;염증과 재생&#39;독일 연구 협회의 공동 연구 센터 (841) (알렉산더 렌즈, 발렌틴 Kunick, 윌리엄 Fumey)의,에 의해 지원되었다 , 빌헬름 샌더 재단 베르너 오토 재단 (피터 Bannas), (피터 Bannas, 프리드리히 코치 - 놀테)에 의해 독일 연구 협회 (마틴 Trepel, 프리드리히 하겐과 프리드리히 코치 - 놀테)에 의해. 우리는 생체 광학 이미징 핵심 시설과 직원 UKE 상담 및 높은 품질의 서비스에서 대학 암 센터 함부르크 (UCCH를) 감사합니다. 핵심 시설은 도이치 Krebshilfe (독일어 암 보조)에서 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다.

참고 : 실험 동물의 윤리적 사용에 대한 국제 가이드 라인에 따라 수행하고, 대학 의료 센터, 함부르크의 지역 동물 복지위원회에 의해 승인되었다. 종양 세포, 마우스, 및 항체를 구축 1. 준비 <ol><li> 림프종 세포의 준비 및 지하 매트릭스의 분취 (마트 리겔). <ol><li> 종양 세포의 주입 전날 살균 팁 상자 (1000 μL 팁) 및 -20 ° C의 냉동고에서 적절한 피펫을 넣어. </li><li> 4 ° C 냉장고 O / N에서 얼음에 지하 매트릭스와 병을 녹여. </li><li> 주사의 날에 얼음 통을 작성하여 피펫 팁과 함께 지하 행렬을 배치하고 얼음에 30 G 바늘 1 ml의 주사기. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 RPMI 배지 100 ㎕의 부피 나누어지는 림프종 세포와 지하 매트릭스 100 ㎕ 조심스럽게 섞는다. 사전 냉각들로 그리기주사기와 주입까지 얼음에 넣어. 참고 : 좋은 무균 기술을 사용하여 얼음에 지하 행렬의 막힘을 방지하기 위해 모든 시간을 작동 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 마우스 준비 <ol><li> 8~10주 오래된를 누드 마우스 (NMRI- Foxn1 N U)를 사용합니다. </li><li> 소장의 형광도 전에 생체 내 이미징 1 주일 동안 알팔파없는 다이어트에 마우스를 유지 줄일 수 있습니다. </li><li> 림프종 세포 주입 유도 챔버에 2 % 이소 플루 란 행하도록 쥐를 마취. 이소 플루오 란을 사용하여 매니 폴드 절차 동안 1-2 %의 이소 플루 란을 유지한다. </li><li> 어깨 옆구리 피하 림프종 세포를 주입한다. 직접 인트라 개별 비교를 위해 각각 우측과 좌측에 항원 - 양성 및 음성 세포 항원을 주입. <ol><li> 마우스의 피부를 꼬집어 마우스의 몸에서 멀리 당겨 엄지와 검지 손가락을 사용합니다. 천천히 고르게에 주입아래의 피부 세포의 단일 클러스터 작성 손가락에 의해 만들어진 파우치. 지하 행렬은 장소에 주입 된 세포를 유지하는 데 도움이됩니다. </li></ol></li></ol></li><li> 항체를 구축 준비 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 형광 염료 AlexaFluor-680 (AF680) (여기 파장 = 679 nm의 발광 파장 = 702 ㎚)에 시판 단백질 라벨 키트와 함께 단일 클론 항체와 단일 도메인 나노 바디 레이블. 15,720 몰 -1 cm -1 203,000 몰 -1 cm -1, 각각의 몰 흡광 계수를 이용하여 나노 바디 기존 항체 당 염료의 수를 계산합니다. SDS-PAGE 크기 분류 쿠마 화려한 푸른 얼룩에 의해 항체 구조의 순도를 평가합니다. </li><li> 실제 묘화 연구 전에 시험관 일련의 실험을 수행함으로써 표지 복합체의 특이성을 확인. 표지의 특이성을 테스트tibody 차단 연구를 통해 체외에서 생성하고 불특정 이소 타입은 8,20을 제어합니다. 참고 : 단계에서 항원 음성 및 항원 양성 세포 (또는 다른 세포 라인)에 대한 1.2.4 세포 수는 다른 성장 속도에 따라 적응해야 할 수 있습니다. 이 실험을 위해, 0.5x10 6 DC27.10 ARTC2 부정과 1.5 × 6 DC27.10 ARTC2 양성 세포는 비슷한 크기의 종양을 얻기 위해 사용되었다. 단계 1.3.1에서 형광 물질과 항체 프로브의 표지 및 라벨 효능의 과정은 사용되는 라벨 키트에 따라 다를 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 생체 이미징 <ol><li> 50 μg의 2 염료 / 분자 : 종양이 직경 ~ 8mm에 도달하면 7~9일 후, AlexaFluor680의 50 μg의 정맥 마우스의 꼬리 정맥 (단클​​론 항체-AF680에 200 ㎕의 생리 식염수 볼륨에서 항체의 구조를 표시 주입 ≈ ~ 4 ^ 14 형광 색소 ≈ ~ 0.8 μg의 형광 색소, 나노 바디-AF680 : 50 μ0.3 염료 g / 분자 ≈ ~ 5.6 ^ 14 형광 색소 ≈ ~ 1.1 μg의 형광 색소). </li><li> 촬상 시스템을 초기화하고 3 % 이소 플루 란 이전에 촬상 유도 챔버 XGI -8- 마취 시스템을 이용하여 행하도록 쥐를 마취. 촬상 챔버 내에 수용 매니 폴드를 사용하여 이소 플루 란 촬상 과정의 기간 1-2 %의 이소 플루 란을 유지한다. <ol><li> 카메라를 향해 지시 종양 가열 이미징 단계에 위치 마우스. 발가락 또는 동물의 꼬리를 곤란하게하여 적절한 마취 모니터; 동물의 반응은 마취가 너무 빛을 나타냅니다. </li><li> 호흡 속도를 모니터링; 마취 호흡 속도가 너무 크게하면 빛과 너무 깊이 호흡율이 감소되는 경우, 깊거나 불규칙적이다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고와 동물의 각막을 보호합니다. </li></ol></li><li> 여기에 대한 615-665 nm의, emissio에 대한 695-770 나노 미터의 형광 필터 세트를 선택n 및 51 배 (512), 화소 매트릭스의 크기와 배경 공제 580-610 nm의 여기. 매체에 자동으로 노출 시간, 픽셀 비닝 (binning)을 설정하고 F는 / 2를 중지합니다. 주 : 짧은 노출 시간이 빠른 프레임 레이트를 사용; 긴 노출 시간은 더 큰 감도를 제공한다. 비닝 CCD 카메라의 픽셀 크기를 제어한다. 비닝을 늘리면 화소 사이즈, 감도, 및 프레임 속도를 증가 시키지만, 공간 해상도를 감소시킨다. F / 정지 카메라 렌즈 개구의 크기를 설정한다. 구멍의 크기는 검출 된 빛의 양 및 설정 장치 및 실험 셋업을 묘화 다를 수 field.Note의 깊이를 제어한다. 최적의 결과에 대한 제조업체의 설명서를 참조하십시오. <ol><li> 이미징 소프트웨어 최적화 노출 시간에서, F / 정지 및 픽셀 비닝 세포주의 발현 수준에 따라. 양적 결과에 영향을주지 않고 실험 기간 동안 언제든지 이러한 설정을 변경합니다. 또한, 이미징 마법사 소프트웨어가 자동으로 결정하도록매개 변수를 설정합니다. </li></ol></li><li> 이미지 주입하기 전에 마우스와 항체 구조의 주사 후 6 시간. 주 : 라벨 효능이 최적의 이미징 결과에 필요한 필요한 용량에 영향을 미칠 수 있습니다. 최적의 촬상 결과를 위해 필요한 항체의 구조 때문에 양은 경험적으로 결정되어야한다. 그것은 라벨 효능 및 크기 구조물뿐만 아니라 종양 모델과 대상 항원 발​​현에 따라 달라질 수있다. </li></ol> 3. 수확 및 종양의 준비 <ol><li> 얼음 통 채우고 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 인산염 완충 식염수 (PBS) / 프로테아제 억제제 (AEBSF)과 얼음 PBS / 0.2 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 놓는다. </li><li> 이미징 세션이 종료되면, 4 % 이소 플루 란으로의 농도를 증가시킨다. 동물이 호흡을 중단 한 후, 이미징 단계에서 제거하고 자궁 전위를 수행합니다. </li><li> 마운트 스티로폼 블록에 마우스와 70 % 에탄올로 스프레이. </li><li> 사용 가위s와 집게는 외부 피부를 잘라 종양을 노출 조심스럽게 뒤로 당겨. 종양 조직은 그대로 유지하기 위해 메스로 종양을 제거합니다. </li><li> 메스를 사용하여 반으로 잘라 종양. PBS / FACS에 대한 AEBSF 분석과 면역 조직 화학 염색에 대한 4 % PFA와 50 ML 튜브의 다른 절반 포집 관에서 절반을 놓습니다. </li><li> 면역 조직 화학 염색을위한 준비 <ol><li> 24 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 4 % PFA에 종양을 유지합니다. PBS / 30 % 자당과 관에 종양을 전송하고 튜브의 바닥에 종양 싱크까지 4 ° C에서 냉장고에 보관하십시오. </li><li> cryomolds에 적합한 조각 종양을 잘라. cryomolds에 종양을 넣고 종양이 적용되도록의 OCT 화합물을 입력합니다. </li><li> 드라이 아이스에 금형을 넣고 화합물이 완전히 고정 될 때까지 기다립니다. 냉동 종양 -80 ° C 냉장고에 전송 및 면역 조직 화학 염색을 위해 저장합니다. </li><li> 잘라 마이크로톰 8 μm의 섹션에서 종양을 냉동. 표준 immunohisto를 사용하여화학 프로토콜은 핵을 시각화하기 위해 혈관과 diamidino 페닐 인돌 (DAPI)를 시각화하는 CD31-AF488에 대한 항체로 염색합니다. 참고 : 이미 형광 표지 항체를 포함하기 때문에 종양 섹션은 빛에 매우 민감하다. 가급적 빛에의 노출을 최소화. </li></ol></li><li> FACS 분석을위한 준비 <ol><li> 얼음에 페트리 접시를 놓고 2.0 ML의 주사기에서 플런저를 제거합니다. 셀 스트레이너에 종양을 넣고 메스를 사용하여 3 ~ 4 조각으로 부드럽게 잘라. 페트리 접시에 초기 PBS를 붓고 셀 스트레이너 내 종양을 반하게하기 위해 플런저의 평평한 끝을 사용합니다. </li><li> 10ml를 피펫으로 모든 세포를 씻어 초기 PBS와 셀 스트레이너를 플래시합니다. 5 분 동안 500 XG에서 새로운 튜브와 스핀에 세포 현탁액을 전송합니다. 뜨는을 취소하고 10 ml의 PBS / 0.2 % BSA에서 세포를 재현 탁. 세포를 계산합니다. </li><li> 5 ml의 FACS 관에서 나누어지는 1 ~ 5 × 10 6 림프종 세포. 다시 스핀 세포 ((500)XG), 100 μl의 PBS / 0.2 % BSA에 뜨는에 resuspend 폐기합니다. </li><li> 선택적으로, 사용하는 블록의 FcR 항 CD16 / 10 분 동안 얼음 위에서 FcγR에 결합 CD32 단클론 (FcgR3 / 2). PBS로 한 번 세포를 씻으 / 0.2 % BSA를. </li><li> 다른 세포로부터 백혈구를 구별 안티 CD45 단클론 추가합니다. PBS / 0.2 % BSA 두 세척 다음 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 품어. </li><li> 오른쪽 요오드화 프로피 듐와 FACS 분석 얼룩 전에 얼음에 15 분은 일반 PBS로 두 세척 다음 죽은 세포를 식별하기 위해. FACS 분석을위한 150 μL에 재현 탁. 주 : 단계 3.7.4 및 3.7.5 단계에서 다른 항체는 종양 엔티티에 따라 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 4. FACS 분석 <ol><li> CD45 양성 세포를위한 게이팅 및 항원 양성 세포를위한 게이팅 큰 산란 겹 차별, 사균의 배제의 형태로 게이트에 관심 인구 게이팅 일련의 도구를 사용. <ol><li> 먼저, 게이트 밖으로 세포두 매개 변수 플롯을 사용하여 측면 산란 (SSC-A) 대 앞으로 분산 형 (FSC-A)의 파편. 다음 폐기 전지는 이중. 마지막으로, 게이트 밖으로 비 (CD45) CD45 항원 양성 죽은 / 세포 죽어가는 (LD - 라이브 / 죽은 얼룩). </li></ol></li><li> 모든 실험에 대해 동일한 템플릿을 사용하여 기록 샘플. 참고 : 하드웨어 및 분석 소프트웨어의 사용에 대한 기술적 조언 제조업체의 프로토콜을 참조하십시오. </li></ol> 5. 현미경 분석 <ol><li> 기름 침지 렌즈 (40 배 목표)와 공 초점 현미경을 사용하여 스테인드 종양 저온부를 분석합니다. AF680의 그는 네온 633 nm의 레이저 여기, AF488에 대한 아르곤 레이저 및 DAPI에 대한 405 다이오드를 사용합니다. </li><li> 현미경과 호환 소프트웨어를 이용하여 원시 이미지 데이터를 처리. 배경 보정 및 노이즈 필요한 경우 필터링을 수행합니다. 같은 단면 자르기뿐만 아니라 밝기 및 대비 조정 등의 추가 이미지 조정을 수행합니다. <ol><li> 마지막으로 GE모든 검출 채널에서 단일 복합 오버레이 이미지를 nerate. 각 층의 밝기와 대비를 조정합니다. 합성 이미지는 세포 (녹색 AF488 얼룩) (DAPI 얼룩, 파랑), 표지 된 항체 구조 (빨간색 AF680 얼룩) 및 혈관의 분포의 현지화를 표시합니다. </li></ol></li></ol> 생체 이미징 분석 6. <ol><li> 이미징 소프트웨어 이미지 파일 열기 및 형광 화상 데이터와 사진 영상 데이터를 결합하여 합성 이미지를 생성한다. 특정 형광 신호로부터 조직자가 형광 배경 신호를 제거하여 화상 표시를 최적화. 이 트레이서 특정 세트의 필터로 취득한 화상으로부터 배경 세트의 필터로 취득한 화상을 감산함으로써 수행 될 수있다. </li><li> 항원 양성 종양 항원 음성 종양 주위의 관심 (ROI)의 동일한 원형 측정 영역을 그립니다. 백그라운드 신호 강도를 결정하기 위해 ROI를 배치 원형형광 신호는 (예를 들어, 다리 뒷다리)으로 낮다 동물의 장소. <ol><li> 모든 시점에서 모든 동물에 대해 동일한 ROI를 사용합니다. 위치 결정을위한 종양 마진을 식별하는 사진 흑백 이미지를 사용한다. </li></ol></li><li> 측정 표에 표시 ROI 데이터. 또한 통계 분석을위한 형광 신호의 정량적 비교를 가능하게 평균 방사 효율 데이터를 사용합니다. <ol><li> 디스플레이 및 절대 신호 세기와 같은 데이터를 비교하거나 표적 조직 및 조직으로부터 배경 ROI 측정 된 데이터를 이용하여 신호 대 바탕 비율을 계산한다. 뒷다리에서 결정된 배경 값에 의해 종양 흡수 값을 나눔으로써 종양 대 백그라운드 비율을 계산한다. </li><li> 대조군으로, 또한 생체 내에서의 신호의 특이성을 평가하기 위해 표지 된 이소 타입 대조군과 주입 된 항원 음성 및 항원 양성 동일한 동물에서 종양뿐만 아니라 동물을 분석한다. </li></ol></lI&gt; </ol>

<ol><li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies+from+llama+effectively+and+specifically+block+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies from llama effectively and specifically block T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 in vivo.</a> FASEB J. 21, 3490-3498 (2007).</li>
<li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+monoclonal+antibody+detects+a+developmentally+regulated+mouse+ecto-ADP-ribosyltransferase+on+T+cells%3A+subset+distribution%2C+inbred+strain+variation%2C+and+modulation+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new monoclonal antibody detects a developmentally regulated mouse ecto-ADP-ribosyltransferase on T cells: subset distribution, inbred strain variation, and modulation upon T cell activation.</a> J Immunol. 163, 6014-6022 (1999).</li>
<li>Koch-Nolte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+genetic+immunization+to+raise+antibodies+recognizing+toxin-related+cell+surface+ADP-ribosyltransferases+in+native+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of genetic immunization to raise antibodies recognizing toxin-related cell surface ADP-ribosyltransferases in native conformation.</a> Cell Immunol. 236, 66-71 (2005).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+and+specificity+of+toxin-related+mouse+T+cell+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+depends+on+its+association+with+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activity and specificity of toxin-related mouse T cell ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 depends on its association with lipid rafts.</a> Blood. 105, 3663-3670 (2005).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+magnetic+resonance+imaging+of+enzyme+activity+on+the+cell+surface%3A+in+vitro+and+in+vivo+monitoring+of+ADP-ribosyltransferase+2+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative magnetic resonance imaging of enzyme activity on the cell surface: in vitro and in vivo monitoring of ADP-ribosyltransferase 2 on T cells.</a> Mol Imaging. 9, 211-222 (2010).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+overexpression+of+toxin-related+ecto-ADP-ribosyltransferase+ART2.2+sensitizes+T+cells+but+not+B+cells+to+NAD-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transgenic overexpression of toxin-related ecto-ADP-ribosyltransferase ART2.2 sensitizes T cells but not B cells to NAD-induced cell death.</a> Mol Immunol. 48, 1762-1770 (2011).</li>
<li>Hottiger, M. O., Hassa, P. O., Luscher, B., Schuler, H., Koch-Nolte, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+unified+nomenclature+for+mammalian+ADP-ribosyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward a unified nomenclature for mammalian ADP-ribosyltransferases.</a> Trends Biochem Sci. 35, 208-219 (2010).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+targeting+of+T+cells%3A+comparison+of+nanobodies+and+conventional+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells: comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies.</a> Contrast Media Mol Imaging. 9, 135-142 (2014).</li>
<li>Scheuplein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAD%2B+and+ATP+released+from+injured+cells+induce+P2X7-dependent+shedding+of+CD62L+and+externalization+of+phosphatidylserine+by+murine+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NAD+ and ATP released from injured cells induce P2X7-dependent shedding of CD62L and externalization of phosphatidylserine by murine T cells.</a> J Immunol. 182, 2898-2908 (2009).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies%3A+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Med Microbiol Immunol. 198, 157-174 (2009).</li>
<li>Vaneycken, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+screening+of+anti-HER2+nanobodies+for+molecular+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Preclinical screening of anti-HER2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer.</a> FASEB J. 25, 2433-2446 (2011).</li>
<li>Xavier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+preclinical+validation%2C+dosimetry%2C+and+toxicity+of+68Ga-NOTA-anti-HER2+Nanobodies+for+iPET+imaging+of+HER2+receptor+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Synthesis, preclinical validation, dosimetry, and toxicity of 68Ga-NOTA-anti-HER2 Nanobodies for iPET imaging of HER2 receptor expression in cancer.</a> J Nucl Med. 54, 776-784 (2013).</li>
<li>Tchouate Gainkam, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+Between+Epidermal+Growth+Factor+Receptor-Specific+Nanobody+Uptake+and+Tumor+Burden%3A+A+Tool+for+Noninvasive+Monitoring+of+Tumor+Response+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlation Between Epidermal Growth Factor Receptor-Specific Nanobody Uptake and Tumor Burden: A Tool for Noninvasive Monitoring of Tumor Response to Therapy.</a> Mol Imaging Biol. 13 (5), 940-948 (2011).</li>
<li>Vosjan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+labelling+of+an+anti-epidermal+growth+factor+receptor+Nanobody+with+68Ga+via+a+novel+bifunctional+desferal+chelate+for+immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Facile labelling of an anti-epidermal growth factor receptor Nanobody with 68Ga via a novel bifunctional desferal chelate for immuno-PET.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 38, 753-763 (2011).</li>
<li>Oliveira, S., Heukers, R., Sornkom, J., Kok, R. J., van Bergen En Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumors+with+nanobodies+for+cancer+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeting tumors with nanobodies for cancer imaging and therapy.</a> Journal Of Controlled Release. 172 (3), 607-617 (2013).</li>
<li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+optical+imaging+of+human+breast+tumour+xenografts+using+anti-HER2+VHHs+site-directly+conjugated+to+IRDye+800CW+for+image-guided+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid optical imaging of human breast tumour xenografts using anti-HER2 VHHs site-directly conjugated to IRDye 800CW for image-guided surgery.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, 1718-1729 (2013).</li>
<li>Zaman, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+bioconjugated+near-IR+quantum+dots+for+targeted+cellular+imaging+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanosci+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody bioconjugated near-IR quantum dots for targeted cellular imaging of pancreatic cancer.</a> J Nanosci Nanotechnol. 11, 3757-3763 (2011).</li>
<li>Oliveira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+visualization+of+human+tumor+xenografts+through+optical+imaging+with+a+near-infrared+fluorescent+anti-epidermal+growth+factor+receptor+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Rapid visualization of human tumor xenografts through optical imaging with a near-infrared fluorescent anti-epidermal growth factor receptor nanobody.</a> Mol Imaging. 11, 33-46 (2012).</li>
<li>Gainkam, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+biodistribution+and+tumor+targeting+of+two+99mTc-labeled+anti-EGFR+nanobodies+in+mice%2C+using+pinhole+SPECT%2Fmicro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of the biodistribution and tumor targeting of two 99mTc-labeled anti-EGFR nanobodies in mice, using pinhole SPECT/micro-CT.</a> J Nucl Med. 49, 788-795 (2008).</li>
<li>Chakravarty, R., Goel, S., Cai, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody%3A+the+%27magic+bullet%27+for+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Nanobody: the 'magic bullet' for molecular imaging.</a> Theranostics. 4, 386-398 (2014).</li>
<li>Siontorou, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+as+novel+agents+for+disease+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanobodies as novel agents for disease diagnosis and therapy.</a> International journal of nanomedicine. 8, 4215-4227 (2013).</li>
<li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+trends+in+antibody-based+oncologic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent trends in antibody-based oncologic imaging.</a> Cancer Lett. 315, 97-111 (2012).</li>
<li>Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+targeting+to+tumors%3A+principles%2C+pitfalls+and+%28pre-%29+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Drug targeting to tumors: principles, pitfalls and (pre-) clinical progress.</a> Journal Of Controlled Release. 161, 175-187 (2012).</li>
<li>Jain, R. K., Stylianopoulos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+nanomedicine+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Delivering nanomedicine to solid tumors.</a> Nature reviews. Clinical Oncology. 7, 653-664 (2010).</li>
<li>Lisy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging+of+carcinoembryonic+antigen-expressing+tumor+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging of carcinoembryonic antigen-expressing tumor cells in mice.</a> Radiology. 247, 779-787 (2008).</li>
<li>Herzog, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cancer+heterogeneity+with+multispectral+optoacoustic+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cancer heterogeneity with multispectral optoacoustic tomography.</a> Radiology. 263, 461-468 (2012).</li>
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Friedrich Koch-Nolte와 Friedrich Haag는 함부르크-에펜도르프 대학 의료 센터의 전액 출자 자회사인 MediGate GmbH를 통해 항체 및 단백질 판매의 지분을 받습니다.

우리는 생체 내 및 생체 분석의 복합 비교를 위해 림프종 세포에 동일한 대상에 대하여 지시 근적외선 형광 표지 된 나노 바디와 기존의 단일 클론 항체를 사용 하였다. 우리는 나노 바디 잘 림프종의 신속하고 특정 생체 검출을위한 진단 도구로서 적합한 것으로 나타났다. 생체 내에서, + 16A 680 ARTC2 양성 이종 이식의 빠르고 더 구체적인 검출을 허용이야. 별도로 생체 내에서 가장 종양 시각화를위한 다양한 반응 속도에서, Nika102 680의 주요 단점은 ARTC2 음성 종양 특이 배경 신호로부터 높은 특이 신호였다. 해부 종양이 주입 AF680-접합체의 ARTC2 음성 림프종 세포에 비특이적 결합 없었다에서 생체 유세포는 분산 된 세포를 분석한다. 생체 내 형광 거의 homogen 강한 계시나노 바디는 6 시간 후 종양 이내에는 원격 지역에 도달 할 수되었음을 확인 나노 바디의 + (16a)의 경우 ART2C 양성 종양 부분에있는 세포의 OU를 염색. 대조적으로, 단일 클론 항체는 6 시간 후에 ARTC2 양성 종양 세포의 염색 불균일 및 약한 나타났다. 종래 항체 나은 이미징 결과는 24 시간 또는 48 시간 후에 달성 될 수있다 (데이터는 보이지 않음). 두 개의 상이한 크기의 구조체의 철저한 비교를 수행하기 위해 상이한 시간 점 (직 촬상)에서 촬상 각 구조에 대해 최적의 촬상 시각을 식별하기 위해 수행되어야한다. 이전의 다른 연구들과 마찬가지로, 여기에보고 된 결과는 생체 내에서 표시 나노 바디와 분자 영상은 높은 종양 - 투 - 배경 비율 12-15,17-19와 신속하고 특정 당일 종양 영상을 수 있다는 점을 강조. 이에 반하여, 기존의 항체는 낮은 종양 - 투 - 배경 비율 및 항에서 비특이적 신호 발생때문에 몸에서 자신의 느린 간격으로 초기 주입 후 세대 음성 종양. 종래 항체 최적 촬상 결과를 얻기 위해, 촬영 시간은 24 시간 또는 사출 흔히 필요한 후에도 48 시간을 가리킨다. 이러한 연구 결과는 입증 된 치료 효과와 기존의 항체 분자 영상 17,19,26에서 유틸리티를 제한하는 것이 제안 이전의 연구와 일치하고 있습니다. 나노 바디 인해 순환에서 자신의 신속한 통관에 영상을 위해 오히려 적합하면서 따라서 기존의 항체는 그들의 긴 혈장 반감기 치료 목적 오히려 적합 할 수 있습니다. 이러한 차이점은 기존의 대형 항체 (150 kDa의) 과량의 순환에 유지하면서 작은 나노 바디 (15-17 kDa의) 임의의 과량이 빠르게 신장을 통해 클리어 제거된다는 사실에 기인한다. 따라서 분자 영상 용 나노 바디의 주요 이점은 촬상 이른 시점에서 낮은 배경 신호이다 regardl주입 용량의 ESS. 이것은 당일 촬상 가능하고 임상.에 반하여 병진 수 종래 항체 정확히 표적 조직 (미발표)로부터 특정 신호를 충분히 유지하면서, 비특이적 배경 신호를 최소화하도록 적정되어야한다. 생체 NIRF 이미징 기술의 한계 중 하나는 일반적 아니지만 동소 종양의 피하 모델에만 촬상을 허용 낮은 침투 깊이이다. 그러나,이 제한은 생쥐 (27) 생활의 전신 영상을 허용 최근에 개발 된 단층 촬영 사진 음향 기술로 실험 설정에서 극복 될 수 있습니다. 방사선 핵종 - 매개 이미징에 비해 NIRF 이미징 기술의 다른 제한은 조직 도즈의 평가이다. 그러나, 나노 바디는 이종 이식 모델과 정확한 정량적 평가의 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상에 대한 방사성 표지 될 수있다추적 생체 분포. 사실, 우리의 NIRF 이미징 결과는 나노 바디와 PET 영상에 대한 기존의 항체를 비교하여 최근의 연구에 따라 있습니다. 저자는 또한 나노 바디가 높은 종양 - 투 - 배경 비율 15 당일 영상을 허용 결론에 도달했다. 그러나, 근적외선 형광 염료 AF680와 항체 구조의 단지 라벨은 생체 내에서, 우리를 시험 관내 포괄적시키고 생체 근적외선 형광 촬상 비교 유동 세포 계측법, 형광 현미경, 및 NIRF 이미징 사용. 그것은, 방사성 저렴 고감도이며 비교적 쉽게 생산할 표적 프로브를 사용하기 때문에 이러한 이유로, 우리는 전임상 분자 이미징 새로운 항체 구조의 평가 NIRF 이미징 기법의 사용을지지.

본 보고서에서는 생체 해부가 이종 이식 종양을 유동 세포 계측법 및 형광 현미경을 사용하여 생체 내 이미징 이종 이식 실험 검증을위한 근 적외 형광 표지 된 프로브의 구현을 기술한다. 우리는 단일 도메인 나노 바디 (S + 16A, 17 kDa의) (1)와 생체 내에서 특정 대해 동일한 표적 항원에 대해 지시 된 모노클로 날 항체 (Nika102 150 kDa의) 2,3- 비교 근적외선 림프종 이종 이식 모델에서 형광 이미징. 대상 항원 ADP-ribosyltransferase ARTC2.2은 림프종 세포 4-9로 GPI-고정 세포 표면 체외 효소로 표현된다. 카멜 리드로부터 유도 나노 바디는 중쇄 전용 항체는 가장 작은 항원 - 결합 단편 (10,11)이다. 만 ~ 15 kDa의,이 작은 항체 단편은, 용해 매우 안정적이며 renally 순환 8,10에서 삭제됩니다. 티HESE 특성은 생체 12-20에서 종양 항원의 특정하고 효율적인 타겟팅에 특히 적합하다. 가능한 나노 바디의 공통 항원 타겟 (EGFR1 또는 HER-1), 인간 표피 성장 인자 2 형 (HER-2 또는 CD340), 암 배아 항원 (CEA) 및 혈관 세포 유착 분자 -1 (VCAM-1 표피 성장 인자 수용체 아르 ) 21. 나노 바디 복합체는 염증성 질환 (22)의 암 면역 요법 및 치료를위한 유망한 도구입니다. 최근의 연구는 더 높은 종양 - 투 - 배경 (T / B)는 생체 분자 이미징 애플리케이션 8,17,19에서 기존의 항체보다 -ratios 나노 바디 허용 것으로 나타났습니다. 이 대상이 아닌 조직 (23)에 기존의 항체, 순환에서 느린 통관, 긴 보존의 상대적으로 가난하고 느린 조직 침투에 의해 주로 설명한다. 또한, 종래의 항체의 과량 비특이적 I 축적에 이르게향상된 통기성 및 체류 (EPR)에 의한 N 개의 표적 항원 음성 종양 (24, 25)에 영향. 이것은 종래의 항체의 고용량 따라서 달성 가능한 최대 종양 대 백그라운드 비율을 줄여 특정 신호들뿐만 아니라, 비특이적 신호뿐만 아니라이 증가 할 수 있다는 것을 의미한다. 대조적으로, 나노 바디의 도즈를 증가시키는 것은 아니라 정상 조직 또는 종양 항원 음성 (미발표) 중 항원 양성 종양의 신호를 증가시킨다. 나노 바디 기존 항체의 비교를 넘어, 우리는 인해 EPR 효과에 특정 비특이적 신호를 직접 비교를 위해 동일한 쥐에서 항원 양성 및 -negative 이종 이식의 intraindividual 평가를 설명합니다. 근적외선 형광 물질은 우리가 프로브, 근 적외 형광 영상을 이용하여 생체 내 및 생체 내의 단일 프로브를 이용하는 유동 세포 계측법, 형광 현미경시켰다. 우리의 프로토콜을 적용하면 비 허용이러한 특정 종양 타겟팅에 대한 새로운 항체 구조의 평가와 같은 생체 분자 이미징 실험, 방사성 매우 민감하고, 저렴 최적화. 이 튜토리얼 연구의 목적은 임상 분자 영상의 새로운 항체 구조의 평가를위한 NIRF 이미징의 사용을 강조하는 것입니다. 이 프로토콜에서, 모든 실험은 작은 동물 NIRF 이미징 시스템을 사용하여 수행하고, 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS)는 유동 세포 계측기 및 공 초점 현미경.

<table><tbody><tr><td>AF680 단백질 라벨링 키트</td>, <td>Invitrogen</td><td>A20172</td><td></td></tr>, <tr><td>Anti-CD16/CD32-항체</td>, <td>BioXCell</td><td>BE0008</td><td></td></tr>, <tr><td>Anti-CD31-항체</td>, <td>Santa Cruz</td>, <td>sc-1506</td>, <td>AF488</td></tr>, <tr><td>Anti-CD45-항체, V450</td>, <td>BD Biosciences,</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision LE 소프트웨어</td>, <td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td></td></tr><tr><td>기저막 매트릭스</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &micro; m</td><td>Corning</td><td>431751</td> 대체 제품은 컨포칼 현미경 Leica<td>를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td></td><td>다음 레이저를 가진 Leica SP5를 www.leica-microsystems.com 하십시오: He-Neon은 AF680, Argon Laser는 AF488, 그리고 DAPI는 405-Diode를 사용하십시오</td></tr>. <tr><td>DAPI</td><td>당당 프로브</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DC27.10 셀&nbsp;</td><td>실험실 특정</td><td></td> : <td>표면 타겟이 다른 다른 세포를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>: DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>www.bdbiosciences.com</td><td></td></tr><tr><td>Flourescence mircoscope</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td>Zeiss Axiovert 200 with Filter Set # 32 for AF680 : 000000-1031-354</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>대체 생체 내 이미징 시스템을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Leica LAS 소프트웨어</td><td>Leica</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>사용되는 현미경 전용 소프트웨어</td></tr><tr><td>Living Image 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>이미징 시스템 전용 소프트웨어</td></tr><tr><td>Needles 30 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>대체 제품을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Nika102-항체 AF680</td><td>실험실 특정</td><td></td><td>다른 표면 표적에 대한 다른 항체를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>P6148</td><td>잠재적 위험: 발암성, 눈과 피부를 자극할 수 있음, 접촉은 피부 건조 및/또는 알레르기성 피부염을 유발할 수 있습니다</td></tr><tr><td>S+16a-나노바디 AF680</td><td>실험실 특이적</td><td></td><td>다른 표면 표적에 대한 다른 항체를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>주사기 1 ml</td><td>Braun</td><td>916 1406 V</td><td>대체 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

나노 바디 및 항체 기반의 검증<em&gt; 생체</em마우스에서&gt; 종양 이종 이식 nirf 이미징 실험 사용<em&gt; 전의 vivo</em&gt; 유동 세포 계측법 및 현미경

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

이 프로토콜은 형광단 표지 나노체 및 기존 항체를 사용하여 마우스에서 NIRF(in vivo near-infrared fluorescence) 이종이식 이미징 실험의 생체 외 검증을 수행하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.
먼저 개체 내 비교를 위해 동일한 마우스에서 항원-음성 세포주를 음성 대조군으로, 항원-양성 세포를 양성 대조군으로 사용하여 마우스에서 피하 종양을 생성하는 방법을 설명합니다. 근적외선 형광단으로 표지된 (AlexaFluor680) 항원 특이적 나노체와 기존 항체를 정맥 주사하는 방법을 간략하게 설명합니다. In vivo 이미징은 소동물 NIRF-Imaging 시스템으로 수행했습니다. 생체 내 이미징 실험 후 마우스를 희생했습니다. 그런 다음 in vivo 이미징 결과를 검증하기 위해 유세포 분석 및 형광 현미경 검사를 통한 병렬 생체 외 분석을 위해 종양을 준비하는 방법을 설명합니다.
근적외선 형광단으로 표지된 나노체를 사용하면 생체 내에서 비침습적 당일 이미징이 가능합니다. 당사의 프로토콜은 유세포 분석에 의한 종양 세포의 특정 표지 효율의 생체 외 정량화와 형광 현미경 검사에 의한 종양 내 항체 구조의 분포 분석을 설명합니다. 근적외선 형광단 표지 프로브를 사용하면 유세포 분석 및 형광 현미경을 사용한 생체 외 검증 실험을 위한 추가 2차 표지 없이 동일한 프로브를 활용할 수 있는 고유한 기능과 함께 비침습적이고 경제적인 in vivo 이미징이 가능합니다.

형광 표지 된 프로브 NIRF 다른 이미징 기법 (도 1a)의 조합을 허용한다. 우리는 생체 내 이미징 (도 1B)에 대한 특정 형광 표지 된 모노클로 날 항체 및 나노 바디를 비교하기 위해서, 생체 NIRF 이미징을 수행하는 유동 세포 계측법, 형광 현미경 순차적보고자. 마우스는 생체 내 이미징을위한 형광 표지 된 구조의 특이성을 평가하기 위해 나노 바디와 단일 클론 항체의 50 μg의 주사 하였다. 결과는 주사 후 6 시간 (그림 2)에서 나노 바디와 단일 클론 항체 모두 항원 양성 종양의 특정 라벨을 보여 주었다. ROI는 모노클로 날 항체 ~ 6에 비해 나노 바디에 대한 훨씬 더 높은 T / B 비를 12 ~ 보였다 항원 양성 종양의 분석. 또한, 나노 바디는 반면, 항원 음성 종양에서 비특이적 신호 없었다모노클로 날 항체는 항원 음성 종양에서 비특이적 교란 신호를 보여 주었다. 네거티브 종양의 비특이적 신호 외에도, 단일 클론 항체는 전체 동물에서 비특이적 백그라운드 신호를 유도. 이는 renally 배설 너무 커서 과잉 자유 순환 항체 쉽다. 이에 반하여, 나노 바디로 주입 된 동물은 나노 바디의 작은 신장의 제거로 인해 신장에 비특이적 인 신호를 보여 주었다. 계측법 종양 세포 현탁액의 흐름을 분석하는 것은 AF680 주입 후 6 시간 접합체 모두 항원 양성 종양 세포의 고유 라벨을 보였다. 모노클로 날 항체 표지 된 세포에 비해 나노 바디 표지화 된 세포의 강한 형광 신호가 생체 NIRF 이미징 결과를 반영한다. 중요한 것은, 유세포 분석은 두 가지 중 하나를 사용하여 항원 - 음성 세포의 비특이적 라벨이 없음을 밝혀구조 (그림 3). 종양 저온부의 형광 현미경은 나노 바디 주입 후 6 시간으로 항원 양성 세포 강하고 거의 균일 라벨링 하였다. 이에 반하여, 모노클로 날 항체는 매우 약한 오히려 불균일 염색 (도 4a)을 나타내었다. 항원 음성 종양이 격자 공간 (그림 4B)에서 기존의 항체 쇼 비특이적 흩어져 염색 주입 반면 항원 음성 종양, 나노 바디의 주사 후 더 염색 6 시간을 표시하지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" /> 그림 1 : Flourescence 이미징 및 항체 생성합니다. 유동 세포 계측법 및 형광 현미경 다음 생체 내 NIRF 이미징 : AF680-접합체의 평가 (A) 이미징 설치. (B </strong&gt;)에서 AlexaFluor680의 도식은 나노 바디의 +의 16A (적색) 및 단일 클론 항체 Nika102 (파란색) 표시. 오렌지 별 AlexaFluor680의 형광 색소를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" /> 도 2 : 생체 NIRF 이미징의 형광 신호의 이미지 항원 양성 (+) 항원 음성 (-) 나노 바디 (S) +의 (16A) (A) 및 모노클로 날 항체 Nika102 (B)을 주사 한 마우스에서 종양. . 생체 내 이미징 (0 시간)과 주사 후 6 시간 전에 실시 하였다. 신호 강도는 방사 효율 (P / 초 / cm 2 / SR) / (μW / cm 2)으로 표시됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" /> 그림 3 :FACS에 대한 FACS 분석 생체 외 종양 세포 현탁액으로부터 세포 결합 항체의 구조. (A) 게이팅 전략은 종양 세포의 분석. (B) 히스토그램 특히 생체 내에서 종양 세포에 결합 정맥 내 주사 AF680 공역 나노 바디 (16A)의 S +와 Nika102 항체의 양을 표시. 항원 음성 종양이 채워지지 히스토그램 및 항원 양성 종양으로 표시됩니다 채워진 막대 그래프로 표시됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" /> 그림 4 :. 6 시간의 + 16A (680) 또는 Nika102 (680)의 주입 후 전체 항원 양성 종양 저온부의 생체 내 형광 현미경 (A) 개요 형광 현미경. 생체 내 정맥에서의 신호 강도모든 보조 라벨링 에이전트없이 투사 AF680-접합체는 빨간색으로 표시됩니다. 예 생체 대조 핵 녹색 파란색과 혈관에 표시됩니다. 점선은 전체 종양의 외부 여백을 나타냅니다. (B) 항원 양성 항원 음성 종양의 근접 형광 현미경.

이 프로토콜은 형광단 표지 나노체 및 기존 항체를 사용하여 마우스에서 생체 내 근적외선 형광 이종 이식 이미징 실험의 생체 외 검증을 수행하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

나노 바디 및 항체 기반의 검증<em&gt; 생체</em마우스에서&gt; 종양 이종 이식 NIRF 이미징 실험 사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 유동 세포 계측법 및 현미경

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

이 절차의 전반적인 목표는 Fluor four가 표지된 나노바디 또는 일반 항체를 사용하여 마우스 내 생체 내 근적외선 형광 이종이식 영상 실험의 ex vivo 검증을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 항원 양성과 음성 이종이식물을 모두 가진 마우스에 근적외선 fluoro-four가 표지된 항원 특이적 항체와 일반 항체를 투여함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 생체 내 영상을 촬영하는 것입니다.영상 촬영 후, 마우스를 희생시켜 이종이식편을 제거하고 ex vivo 분석을 위해 처리합니다. 최종적으로, ex vivo 유세포 분석과 형광 현미경을 사용하여 in vivo 영상 결과를 검증합니다. 핵의학 영상과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 장점은, 근적외선 형광 염료를 사용하여 단일 프로브만으로 유세포 분석, 형광 현미경 및 근적외선 형광 영상을 위한 포괄적인 in vitro, in vivo 및 ex vivo 다중 모드 영상 비교가 가능하다는 점입니다.이 방법은 수술 중 전이 부위의 국소화 및 항종양 치료의 효율성 모니터링과 같이 종양 영상 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 항체를 fluoro force로 표지하면 세포 결합 항체의 정확한 ex vivo 정량이 가능합니다. 이를 통해 in vivo에서 관찰되는 특정 신호가 세포 표면 항원에 결합된 항체에 의한 것인지, 아니면 소위 EPR(enhanced permeability and retention) 효과로 인한 비특이적 신호인지 구분할 수 있습니다.종양 세포 주입 후 7~9일이 지나 종양의 직경이 약 8mm가 되었을 때 진행합니다. 먼저 마우스 영상 촬영을 준비하기 위해 안연고를 도포하고 영상 시스템을 초기화합니다. 그 다음, 마취된 마우스의 종양이 카메라를 향하도록 가열 스테이지 위에 배치합니다.영상 촬영 챔버 내에 설치된 isof fluorine 매니폴드를 사용하여 영상 촬영 절차 전반에 걸쳐 1~2% ISO fluorine 농도를 유지하십시오. 호흡수를 모니터링하십시오. 호흡수가 너무 빠르면 마취가 너무 얕은 것이며, 호흡수가 느리거나 불규칙하면 마취가 너무 깊은 것입니다.그 다음, 기저선 영상을 촬영한 후 마우스를 이미징합니다. LOR six 80으로 표지된 항체 구조체 50 µg을 마우스에 주입합니다. 200 µL의 식염수 부피로 꼬리 정맥에 주입하십시오.이미징 후 마우스를 안락사시키고 스티로폼 블록에 고정한 다음 70% ethanol로 세척합니다. 그다음 피부를 절개하여 종양을 노출시킵니다. 메스로 종양을 제거하며, 이때 종양이 손상되지 않도록 온전하게 유지합니다.종양을 적출한 후 절반으로 자릅니다. 한쪽 절반은 FACS 분석을 위해 얼음 위에 둔 PBS-BSA-FBS 용액이 담긴 디쉬로 옮기고, 나머지 절반은 면역조직화학 염색을 위해 4% PFA 냉각 용액의 2배 부피로 옮깁니다. 4°C의 고정액에서 24시간 동안 처리한 후, 종양을 30% sucrose가 포함된 PBS로 옮겨 용액 속으로 완전히 가라앉을 때까지 4°C에서 보관합니다. 그 다음, cryo mold에 들어갈 수 있는 크기로 종양을 작게 썹니다.몰드에 OCT 화합물을 채우고 종양 덩어리를 몰드로 옮깁니다. 조직은 반드시 OCT에 완전히 잠겨야 합니다. 그런 다음 동결 몰드를 드라이아이스로 옮기고, 완전히 얼었을 때 처리 전까지 -80 °C에서 보관합니다.세포를 준비하려면, 종양의 절반을 셀 스트레이너(cell strainer)로 옮깁니다. 이를 3~4조각으로 자른 후, 2 mL 주사기에서 플런저를 꺼내 조직을 스트레이너에 대고 으깹니다. 스트레이너를 통해 흘러나오는 용액을 수집합니다. 조직을 모두 으깬 후, 스트레이너를 PBS로 세척합니다.그런 다음 수집된 현탁액을 새 튜브로 옮기고 500 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 0.2%BSA가 포함된 10 milliliters의 PBS에 현탁합니다. 이어서 세포 수를 측정하여 100만에서 500만 개의 림프종 세포를 5 milliliter FACS 튜브에 분주하고, 튜브를 500 G에서 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.그 다음 세포를 0.2% BSA가 포함된 100 µL의 PBS에 현탁합니다. 이 단계에서 FC gamma R에 결합하는 항체를 사용하여 FCR을 차단할 수 있습니다. 10분 동안 대기한 후 0.2% BSA가 포함된 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 이제 백혈구를 식별하기 위해 anti CD 45 단일클론 항체를 첨가합니다.이 항체를 사용하여 세포를 암소에서 20분 동안 배양한 후, FACS 분석 직전에 두 번 세척하여 항체를 제거합니다. 죽은 세포를 식별하기 위해 세포를 propidium iodide로 얼음 위에서 15분 동안 염색합니다. 그 다음, 순수한 PBS로 깨끗이 세척합니다.이어서 150 µL의 PBS에 세포를 재부유시킨 후 다음 단계를 진행합니다. 형광 표지된 컨스트럭트의 특이성을 평가하기 위해 마우스에 50 µg의 나노바디와 단클론 항체를 주입하였습니다. 이는 in vivo 이미징을 위한 것입니다.모든 이미징은 주입 유동 후 6시간 후에 수행되었습니다. 종양 세포 현탁액의 세포 분석 결과, 두 AF 680 접합체 모두 항원 양성 종양 세포를 특이적으로 표지하는 것으로 나타났습니다. 두 구조물 모두 항원 음성 세포에 대한 비특이적 표지는 없었습니다.종양의 경우, 냉동 절편에서 나노바디를 이용한 항원 양성 세포의 강하고 거의 균질한 라벨링이 확인되었습니다. 반면, 단클론 항체는 예상된 항원에 대해 훨씬 약하고 불균질한 염색 결과를 나타냈습니다.음성 종양에서는 항체 염색이 나타나지 않았으며, 기존 항체를 주입한 후 항원 음성 종양의 간질 공간에서는 비특이적인 산재성 염색이 관찰되었습니다. 이는 기존 항체를 주입한 후 항원 양성 종양에서 관찰된 염색 양상과 매우 유사하였습니다.본 기술의 이미징 단계는 본 절차에 따라 단 하루 만에 수행할 수 있습니다. 주입된 접합체의 다양한 조직 내 생체 분포 또는 기타 사항을 조사하기 위해 나노바디의 방사성 표지법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, fluoro four로 표지된 프로브를 사용하여 생체 내(in vivo) 근적외선 형광 이미징 경험을 생체 외(ex vivo) 다중 모드 검증으로 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.따라서 본 영상은 전임상 분자 영상을 위한 새로운 항체 구조물을 평가하는 기술을 제공합니다.

validation-nanobody-antibody-based-vivo-tumor-xenograft-nirf-imaging

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

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에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

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마우스 종양 이종이식 모델에서 항체 국소화를 위한 In vivo Fluorescence Imaging

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포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

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나노 바디 및 항체 기반의 검증

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