DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

이 절차의 전반적인 목표는 관심 조직 또는 세포에서 분리한 게놈 DNA의 표적 관심 영역 내 CPG 메틸화를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 중아황산염 특이적 PCR 프라이머를 설계하여 중아황산염 전환 게놈 DNA로부터 관심 영역을 증폭함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 중아황산염 전환된 관심 영역을 증폭하고, 해당 증폭 산물로부터 차세대 염기서열 분석 또는 NGS 라이브러리를 생성합니다.

다음으로, 라이브러리를 시퀀싱하여 분석을 위한 FASTQ 파일을 생성합니다. 마지막 단계에서는 시퀀싱 리드를 바이설파이트 처리된 참조 표적 서열에 정렬하며, 최종적으로 설파이트 앰플리콘 시퀀싱 또는 BS-AS를 통해 5-mc 백분율을 계산함으로써 모든 모델 생물의 관심 영역 내 CpG 메틸화를 정밀하고 정확하게 정량화할 수 있습니다. 생거 시퀀싱과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 BS-AS가 신속하고 고처리량인 방식으로 정확하고 정밀한 CpG 메틸화 정량을 제공하여, 다수의 샘플에서 여러 영역을 분석할 수 있는 기회를 제공한다는 점입니다.

표적을 식별하고 프라이머를 설계한 후, 단일 앰플리콘의 표적 증폭 최적화를 위한 반응물을 준비하고, PCR 플레이트를 열 밀봉 필름으로 밀봉하여 PAGE 전기영동으로 앰플리콘을 시각화합니다. 다음으로, 적절한 웰에 30 µL의 PCR 반응물 또는 래더를 로딩한 후, 200 V에서 약 45분 동안 겔을 실행합니다. 첫 번째 염색약이 겔 끝에 도달하면 반응을 중단하고, 겔 전체를 새로 조제한 5 µg/mL의 AUM bromide로 덮습니다.

5분 후, 482 nm의 여기 파장에서 UV 투과조명기를 통해 겔의 이미지를 획득합니다. 래더를 사용하여 PCR 증폭산물의 크기를 측정함으로써 반응의 특이성을 결정합니다. 예상되는 증폭산물 크기 외에 다중 밴드가 나타나는지 확인하여 검출된 라이브러리 피크의 평균 크기와 몰 농도 추정치를 결정합니다.

다음으로, 제조사의 지침에 따라 고감도 DNA 분석법이 적용된 모세관 전기영동 DNA 크기 측정 칩으로 라이브러리를 분석합니다. QPCR을 통해 라이브러리를 정량화하십시오. 생성된 라이브러리의 어댑터 서열에 대응하여 설계된 프라이머와 농도를 알고 있는 표준 물질을 사용하여 리얼타임 분석 기기에서 분석하며, 제조사의 지침에 따라 절대 정량 설정값을 사용합니다.

그런 다음 라이브러리의 크기와 QPCR의 몰 정량 값을 사용하여 라이브러리의 몰 농도를 계산합니다. 시퀀싱 후, 압축된 fast Q 파일을 적절한 시퀀싱 분석 파이프라인으로 가져오기(import)하고, 리드 트리밍 애플리케이션에서 Q 점수를 유지할 수 있도록 리드 생성에 사용된 시퀀싱 방법을 선택합니다. 적절한 압축 fast Q 리드 파일을 가져온 다음, 일반 옵션(general options)에서 품질 점수 삭제(discard quality scores) 항목을 선택 해제합니다.

가져온 리드(reads)를 저장할 위치를 선택하고 완료를 클릭합니다. 그런 다음 NGS 핵심 도구(NGS core tools)에서 시퀀스 트리밍(trim sequences)을 선택합니다. 트리밍할 리드를 강조 표시하여 Q 30 이상의 점수를 가진 리드만 남깁니다.

그 다음, quality scores를 이용한 trim을 선택하고 제한 값을 0.001로 설정하십시오. 모호한 뉴클레오타이드(ambiguous nucleotide)가 1개 이하로 포함된 리드(read)만 추가로 선택하려면, trim ambiguous nucleotides를 선택하고 모호성 최대 개수를 1로 설정하십시오.

그런 다음 트리밍된 리드(reads)를 저장할 위치를 선택하고 finish를 클릭하여 트리밍된 리드를 in silico 황산염 변환 유전자 참조 서열(sulfite converted gene reference)에 매핑합니다. NGS 핵심 도구(NGS core tools)에서 map reads를 선택합니다. Reference 항목에서 매핑할 트리밍된 리드를 선택하고 next를 클릭합니다.

그런 다음 레퍼런스 마스킹(reference masking)에서 변환된 레퍼런스 서열을 선택하고 마스킹 없음(no masking)을 선택하십시오. '다음(Next)'을 클릭한 후 미스매치(mismatch), 삽입(insertion) 및 결실(deletion)에 대해 3점의 점수를 부여하십시오. 레퍼런스에 매핑되는 리드 길이의 최소 분율(minimum fraction of read length map to the reference)에는 1점을 부여하고, 비특이적 매치 처리(nonspecific match handling)의 매핑-리드-레퍼런스 간 최소 동일성 분율(minimum fraction of identity between the map, read and reference)에는 0.9점을 부여한 후 '무시(ignore)'를 선택하고 출력 옵션(output options)에서 '다음(Next)'을 클릭하십시오.

다음으로, Create standalone read mappings를 선택하십시오. 그런 다음 result handling 항목에서 save를 클릭하십시오. 리드 매핑을 저장할 위치를 선택하고 finish를 클릭하여 매핑된 리드에 대해 변이 호출(variant calling)을 실행하십시오.

재시퀀싱 분석에서 저빈도 변이 검출(low frequency variant detection)을 선택하고 분석할 리드 매핑(read mapping)을 선택하십시오. 다음(next)을 클릭한 후, 저빈도 변이 파라미터에서 0.01%를 입력하고 다음(next)을 클릭하십시오. 일반 필터(general filters)에서 최소 커버리지를 1000으로 설정하여 시퀀스 깊이가 1000 x 이상이 되도록 하십시오.

마지막으로 [다음]을 클릭한 후, 출력 옵션에서 [주석 처리된 표 생성]을 선택하고 변이 표 파일을 저장할 위치를 지정한 뒤 [마침]을 클릭합니다. 변이 표 파일에서 관심 영역 내 주석 처리된 CPG 사이트의 변이 빈도를 사용하여, 전환된 참조 서열에 적절히 정렬된 설파이트 앰플리콘 시퀀싱 리드(sulfite amplicon sequencing reads)를 통해 CG 컨텍스트 내 참조 사이토신의 사이토신 메틸화 빈도를 계산하면 그림에 예시된 것과 유사한 결과가 나타납니다. CPG 디뉴클레오타이드를 명확하게 식별할 수 있으며, CPG 사이트의 염기 호출(base call)을 관찰함으로써 메틸화 상태를 추정할 수 있습니다. 매핑된 리드에서 메틸화가 0%인 경우, CPG 사이트에 티민이 매핑된 리드가 생성됩니다.

100% methylation 대조군은 CpG 사이트에 매핑된 사이토신을 포함하는 매핑 리드 결과로 나타납니다. 본 실험에서는 생쥐의 소뇌와 망막에서 RNA와 DNA를 공동 분리하였습니다. 그 후, 예상대로 망막 조직에서 선택적으로 발현되는 옵신(opsin)의 발현량을 QPCR을 사용하여 측정하였습니다.

중아황산염 증폭 시퀀싱(bisulfite amplification sequencing)을 통해 opsin 프로모터 영역의 CpG 메틸화 수준을 정량 분석한 결과, opsin RNA는 망막에서만 검출되었습니다. 그러나 프로모터 영역 전체의 누적 메틸화 수준은 망막의 15% 미만에 비해 소뇌에서는 80%보다 높았습니다. BS-AS 메틸화 정량 분석은 부위 특이적 메틸화 정량이 가능하므로, 임의의 게놈 영역 전체에 걸쳐 CpG별 메틸화 수준을 비교할 수 있다는 장점이 있습니다.

실제로 본 실험에서는 망막 시료와 비교했을 때 소뇌 시료의 옵신 프로모터 전반에 걸친 CpG 메틸화 수준이 유의미하게 더 높은 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 조직 또는 세포에서 분리한 게놈 DNA의 특정 관심 영역 내 CpG 메틸화를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.