DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

이 절차의 전반적인 목표는 관심 조직 또는 세포에서 분리된 게놈 DNA에서 관심 대상 영역의 CPG 메틸화를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 아황산염 특이적 PCR 프라이머로 설계하여 이중 아황산염으로 전환된 게놈 DNA에서 관심 영역을 증폭함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 bi-sulfite 변환된 관심 영역이 증폭되고 amplicon cons에서 차세대 염기서열분석 또는 NGS 라이브러리가 생성됩니다.

다음으로, 라이브러리가 시퀀싱되고 분석을 위해 FASTQ 파일이 생성됩니다. 마지막 단계에서, 염기서열분석 판독은 중아황산염 변환된 참조 표적 염기서열에 정렬되고, 5mc 퍼센트는 궁극적으로 아황산염 앰플리콘 염기서열분석에 의해 계산되거나 BS as를 수행하여 모든 모델 유기체의 관심 영역에서 CPG 메틸화를 정확하고 정확하게 정량화할 수 있습니다. Sanger 염기서열분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 BS A S가 빠르고 높은 처리량 방식으로 정확하고 정밀한 CPG 메틸화 정량화를 제공하여 많은 수의 샘플에서 여러 영역을 분석할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다.

타겟을 확인하고 프라이머를 설계한 후, 단일 앰플리콘의 타겟 증폭 최적화를 위한 반응을 조립한 후, 페이지 전기영동으로 앰플리콘을 시각화하기 위해 열밀봉 필름으로 PCR 플레이트를 밀봉합니다. 다음으로, 적절한 웰에 30마이크로리터의 PCR 반응 또는 래더를 로드한 다음 약 45분 동안 200볼트에서 겔을 실행합니다. 첫 번째 염료가 겔 끝에 도달하면 반응을 중단한 다음 갓 준비한 AUM 브로마이드 밀리리터당 5마이크로그램으로 전체 겔을 덮습니다.

5분 후, 482나노미터의 여기 파장에서 UV 투광기를 통해 겔을 이미지화합니다. 래더를 사용하여 PCR AMPLICON의 크기를 측정하고 반응의 특이성을 확인합니다. 검출된 라이브러리 피크의 평균 크기와 몰 농도의 추정치를 결정하기 위해 예상 앰플리콘 크기 이외의 여러 밴드를 찾습니다.

다음으로, 제조업체의 지침에 따라 고감도 DNA 분석을 사용하여 모세관 전기영동 DNA 크기 조정 칩에서 라이브러리를 실행합니다. QPCR로 라이브러리를 정량화합니다. 생성된 라이브러리의 어댑터 염기서열과 함께 설계된 프라이머와 실시간 기기에서 농도가 알려진 상태로 설계되었으며, 제조업체의 지침에 따라 절대 정량화 설정을 사용합니다.

그런 다음 라이브러리의 크기와 QPCR의 몰 정량화를 사용하여 라이브러리의 몰 농도를 계산합니다. 염기서열분석 후 압축된 빠른 Q 파일을 적절한 염기서열분석 파이프라인으로 가져오고, 가져오기를 선택한 다음, 판독을 생성하는 데 사용되는 염기서열분석 방법을 선택하여 읽기 트리밍 응용 프로그램에 대한 Q 점수를 유지합니다. 적절한 압축된 빠른 Q 읽기 파일을 가져온 다음 일반 옵션에서 discard quality scores를 선택 취소합니다.

가져온 읽기의 위치를 선택하고 마침을 클릭합니다. 그런 다음 NGS core tools(NGS 코어 도구)에서 trim sequences(트림 시퀀스)를 선택합니다. 트리밍할 판독값을 강조 표시하고 Q 30 점수 이상을 포함하는 판독값만 유지합니다.

그런 다음 품질 점수를 사용하여 트림을 선택하고 제한을 0.001로 설정합니다. 또한 하나의 모호한 뉴클레오티드보다 작거나 같은 것을 포함하는 갈대만 선택합니다. Trim ambiguous nucleotides(모호한 뉴클레오티드 잘라내기)를 선택하고 최대 모호성 수를 1로 설정합니다.

그런 다음 trimmed read를 저장할 위치를 선택하고 finish를 클릭하여 trimmed res를 in silico by sulfite converted gene reference에 매핑합니다. NGS core tools(NGS 코어 도구)에서 map reads(맵 읽기)를 선택합니다. 참조하려면 매핑할 트리밍된 읽기를 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다.

그런 다음 참조 마스킹에서 변환된 참조 시퀀스를 선택하고 마스킹 없음을 선택합니다. 다음을 클릭하고 불일치, 삽입 및 삭제에 대해 3점을 할당합니다. 참조에 대한 읽기 길이 맵의 최소 비율에 대해 1의 점수를 할당하고 비특정 일치 처리에서 맵, 읽기 및 참조 사이의 최소 식별 부분에 대해 0.9의 점수를 할당하고 출력 옵션에서 선택, 무시 및 다음을 클릭합니다.

다음으로, 독립 실행형 읽기 매핑 만들기를 선택합니다. 그런 다음 결과 처리(Result Handling)에서 저장(Save)을 클릭합니다. 읽기 매핑을 저장할 위치를 선택하고 마침을 클릭하여 매핑된 읽기에서 변형 호출을 실행합니다.

Re-sequencing analysis(재시퀀싱 분석)에서 low frequency variant detection(저빈도 변형 검출)을 선택하고 분석할 read mapping(판독 매핑)을 선택합니다. 다음을 클릭한 다음 low frequency variant parameter(저주파 변형 매개변수)에서 0.01%를 입력하고 다음을 클릭합니다. 일반 필터에서 최소 커버리지를 1000으로 설정하여 시퀀스가 1000 x보다 크거나 같은 깊이에 있도록 합니다.

마지막으로, 다음을 클릭한 다음 output options(출력 옵션)에서 create annotated table(주석이 추가된 테이블 생성)을 선택하고 variant table 파일을 저장할 위치를 선택한 다음 finish(마침)를 클릭하고 variant table 파일의 관심 영역에 있는 주석이 추가된 CPG 사이트의 variant 빈도를 사용하여 변환된 reference sequence에 적절하게 정렬된 sulfite amplicon sequencing read에 의해 CG 컨텍스트의 reference cytosine에서 cytosine methylation의 빈도를 계산합니다. 그림에서. CPG 디뉴클레오티드를 명확하게 식별할 수 있으며 CPG 부위의 염기 호출을 관찰하여 메틸화 상태를 추정할 수 있습니다. 매핑된 판독에서 0%메틸화는 CPG 부위에 매핑된 티민을 포함하는 매핑된 판독을 초래합니다.

100% 메틸화 제어는 CPG 부위에 매핑된 사이토신을 포함하는 매핑된 읽기를 초래합니다. 이 실험에서 RNA와 DNA는 마우스, 소뇌 및 망막에서 공동 분리되었습니다. 그런 다음 망막 조직에서 선택적으로 발현된 옵신 발현을 예상대로 QPCR을 사용하여 측정했습니다.

opsin RNA는 bi-sulfite 증폭 염기서열분석을 통해 Opsin promoter region에서 CPG 메틸화 수준을 정량화한 후 망막에서만 검출되었습니다. 그러나 프로모터 영역 전체에 걸친 누적 메틸화 수준은 소뇌에서 80% 이상이었던 반면 망막에서는 15% 미만이었습니다. B SAS 메틸화 정량화는 부위 특이적 메틸화 정량화의 이점을 통해 주어진 게놈 영역에서 CPG 특이적 기준으로 메틸화 수준을 비교할 수 있습니다.

실제로, 이 실험에서 옵신 프로모터 전체의 CPG 메틸화 수준은 망막 샘플과 비교할 때 소뇌 샘플에서 훨씬 더 높은 것으로 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조직 또는 세포에서 분리된 게놈 DNA의 대상 관심 영역에서 CPG 메틸화를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.