Name: DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 배우세요 BSAS를 활용한 DNA 메틸화 정량 분석 방법입니다. 비설파이트 전환과 NGS를 결합하여 특정 게놈 영역의 CpG 메틸화 수준을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 이 기술은 후성유전학 연구에 필수적인 도구입니다.

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저자는 쥐의 망막과 소뇌 샘플에 대해 Colleen Van Kirk에게, 그림 생성에 대해 Peter Gregory에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 MiSeq에 접근할 수 있도록 Allison Gillaspy 박사와 분자 생물학 및 세포 분석 연구 연구소 핵심에 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 DA029405, EY021716 및 AG026607와 Donald W. Reynolds Foundation의 지원을 받았습니다.

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BSAS 샘플 및 대상의 수 두 수의 높은 처리량 기능에 초점을 맞춘, 정확한 DNA 메틸화 정량 수 있습니다. 또한, transposome 매개 tagmentation을 사용하여이 라이브러리 세대는 빠르고, 적은 입력 DNA입니다 필요로하며, 기존의 전단 및 후속 어댑터 결찰 기술보다 더 적은 단계가 포함되어 있습니다. 기존의 방법에 비해 이러한 개선은 관심의 대상의 정확한 기본 수준 DNA 메틸화 분석 할 수 있습니다. 또한, BSAS는 전체 게놈 중아 (22) 또는 캡처 (23) 접근 방식을 사용하여 식별 된 관심의 영역 (차별적 메틸화 지역 (DMRS)의 CpG 섬, 규제 지역)의 확인을위한 새로운 방법을 제공한다. 직교 확인 방법 등을 정량적으로 정확한 방법을 사용하여 에피 지노믹스 연구의 치밀한 분석을 향상시킨다. BSAS 달성 높은 읽기 깊이는 다시 좁은 신뢰 구간의 정확한 정량이 가능정확한 정량 16 sulting. 또한, 하나의 실험에서 많은 샘플을 실행할 수있는 능력은 통계적 전력을 증가 전체 게놈의 확정 방법에 대한 샘플 크기를 증가시킬 수있다; 많은 현재의 후생 유전 학적 연구의 약점. 중요한 것은, BSAS은 후생 유전 학적 연구에 대한 검증 가능한 가설의 생성을 허용베이스 고유의 CpG 메틸화 정량을 제공합니다. 이러한 특정 응답 요소의 증가 메틸화와 같은 가설이 감소 특정 전사 인자의 결합을 발생합니다. 한 쌍의 mRNA 발현 데이터와 결합 BSAS은 조직 또는 세포 집단의 단일 조각 내에 후생 유전 학적 규제 mRNA 발현 양을 얻기위한 방법을 제공한다. 규제와 표현의 짝 측정은 또한 과학적인 엄격함과 결과의 영향을 증가시킨다. BSAS 프로토콜 내에서 중요한 단계는 프라이머 디자인, 앰플 리콘 최적화 및 라이브러리 생성 / 포함QC. 프라이머가 적절하게 설계 효율이 다른 8로 증폭하지 않으면 PCR 바이어스가 도입된다. 이러한 효소 적으로 생성 된 100 % 및 0 % 시토신 메틸화 표준 같은 메틸화 표준의 사용은 어떤 경우 메틸화 정량 바이어스, 정도를 결정하는데 사용하고, 메틸화 (16)을 정량 할 때 적절한 방법론 제어하다 할 수있다. 단일 고품질의 증폭 물을 생성하기위한 PCR 반응을 최적화 할 때 마찬가지로주의를 기울여야한다. 앰플 리콘은 어떠한 프로토콜에서 상세히 제시된 지침을 이용하여 존재하지 않는 경우, 최적화 단계가 증가하는 PCR 사이클 번호 또는 bsDNA 입력량을 포함한다. 프라이머 이량 체 등 다양한 PCR 제품들이 존재하는 경우, 최적화 단계는, bsDNA 입력량 감소 PCR 프라이머 몰 입력 농도 저하, 소둔 온도의 증가, 또는 PCR 싸이클 횟수 감소 등. 이러한 최적화 절차 중 하나 또는 조합이 단일 HIG를 생성하기에 충분한 결과를 얻을H-품질 증폭 물. 또한, 프라이머를 재 설계하는 것은 하나의 증폭을 생성하지 않는 프라이머 세트를위한 좋은 방법입니다. 재 설계에 적합 또는 수 없습니다 그 지역의 경우 두 역 프라이머에서의 CpG 사이트에서의 CpG 앞으로 프라이머의 사이트와 아데닌의 구아닌의에서 시토신의 티민의이 작동을 포함 프라이머 세트를 퇴화. 그러나, 이들 프라이머 세트는 바이어스가 발생하는 어떠한 PCR,이 프로토콜의 범위를 벗어난 프로세스 없도록 위해 추가 최적화를 필요로한다. 품질 라이브러리는 성공을 위해 매우 중요합니다. 품질 관리 조치를 시퀀싱하기 전에 라이브러리의 크기, 질과 양을 결정하기 위해 수행되어 있는지 확인합니다. 시퀀싱 반응은 저품질 라이브러리의 입력에 실패하는 경향이있다. 메틸화 정량의 바이어스는 메틸화 주파수가 앞으로 모두에 존재하고 시퀀싱 읽기 역하도록함으로써 완화 될 수있다. 또한,의 CpG 사이트에 정렬 기지의 품질 평가 점수가 높은 협력을위한 ≥Q30해야정량에 nfidence. 다른 사람은 위에 설명 된 기준을 보장 중아 변환 된 DNA (19)의 tagmentation 반응에서 어떤 편견 이전에 작은 표시하고 있지만 낮은 바이어스 메틸화 정량의 확인을 할 수 있습니다. BSAS 현재 그러나,이 방법의 미래 확장은 바이 설 파이트 변환 24 전에 칼륨 퍼 루테 네이트를 도입으로하는 5- MC 및 5- HMC 구별 실험 단계에 첨가 된 CpG -5- HMC의 페어링 측정을 허용 소비재 부위에서 메틸화를 측정한다. 이것은 DNA 메틸화 유전자 발현 조절의 역할을 결정하기 위해, 한 쌍의 메틸화시킴으로써 5-MC 및 5- HMC 및 발현 데이터를 모두 BSAS 유틸리티의 영향을 증가시킬 것이다. PCR 증폭 산물의 Transposome 매개 라이브러리 제조 증폭 영역의 단부에서 감소 된 깊이 순서화 될 않는다. 따라서, 높은 관심의 영역이 증폭 산물의 중간에 위치하도록 설계되어야한다. 방법BSAS가 생성하기 때문에 지금까지, 시퀀싱&gt; 1000 X, 증폭 된 영역의 끝 근처 측정이 여전히 높은 5-MC의 양적 정도의 깊이를 읽어보십시오.

그것은 자연스럽게 시토신 메틸화 (1)의 형태로 DNA의 변형 발생의 첫 번째 보고서 이후 반세기에 걸쳐있다. 시토신 메틸화베이스 링에 5 번째 탄소 메틸기 (5-MC)는, 가장 빈번하게 포유 동물 게놈에서의 CpG 디 뉴클레오티드 모티브에서 발생 갖는 변성 시토신 뉴클레오티드 염기이다. 부재가 전사 활성과 연관이있는 동안 유전자 프로모터의 5-MC의 존재는 일반적으로 작용 성, 전사 억제와 관련된다. 엄청난 진보 발전 3의 DNA 메틸화, 후생 유전 학적 프로파일 4, 5,6 암 발병 기전 및 다른 연구 분야의 수의 transgeneration 전파의 역할에 대한 이해 만들어왔다. 신규 방법론은 DNA 메틸화 7 프로파일 개발되었다 이러한 많은 진보는 지난 몇 년 동안왔다. 출현 및차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 대중화는 이제 전체 게놈 또는 게놈 (8)의 큰 영역에 걸쳐 DNA 메틸화를 프로파일 링하는 방법은 여러 가지가있을 수 있습니다. 이러한 접근은 DNA 메틸화 패턴 및 DNA 메틸화의 차이를 정량화 연구의 발견 가능성을 연다. 이러한 가설 발생 방법에 더하여, 타겟 / 가설 테스트 DNA 메틸화 정량 방법에 대한 상당한 필요성이 존재한다. pyrosequencing 기법, 메틸화 특이 PCR, 바이 설 파이트 변환 된 DNA와 직접 생거 시퀀싱은 대상 영역의 분석을 위해 가장 많이 사용되는 방법이 있었다 (예를 들어, 하나의 유전자의 프로모터 영역 또는 CpG 아일랜드) 9-12. 메틸화 된 시토신의 그대로 13, 14을 유지하면서 이러한 모든 방법, 중아 변환, 메틸화 된 시토신의이 우라실의로 변환 화학 탈 아미 노화 반응에 의존하고있다. bisulfite-의 PCR 증폭차동 메틸화 염기 차이로서 판독 할 수 티민 15 우라실의 여분의 DNA에 변환 결과. 매우 유용하지만, 이러한 방법에 제한이 낮은 양적 정확성, 짧은 읽기 길이, 낮은 시료 처리를 포함한다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 우리가 (BSAS) 16 바이 설 파이트의 증폭 시퀀싱이라고 한 방법을 개발했다. 이 방법의 목적은 높은 정밀도로 정량 많은 수의 샘플에 대한 관심의 대상 게놈 영역을 분석 할 수 있어야한다. BSAS은 기존의 방법의 요소 (중아 변환 및 지역별 PCR 증폭)를 사용하고 간단한 차세대 라이브러리 건설 (transposome 매개) (17) 및 벤치 탑 NGS (18) (그림 1)로 결합되어 있습니다. 이 방법은 관심의 영역에서 시토신 메틸화를 검사 할 수있는 정량적 및 높은 처리량 방법을 제공한다. 여기에 우리가 제시세부 방법 및 문제 해결과 품질이 BSAS 프로세스를 확인하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanlyzer</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech PCR 플레이트 96&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>세미 스커트</td></tr><tr><td>히트씰링 필름</td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>Heatsealing Foil</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>Heat Sealer</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 &#956; l 팁</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &#956; l 팁</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1,000 &#956; l 팁</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT DNA 시료 전처리 키트</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html">Nextera XT 인덱스 키트</a></td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 인덱스</td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/systems/miseq.html">MiSeq 데스크탑 시퀀서</a></td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html">MiSeq 시약 키트 v2</a></td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 사이클</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST 범용 qPCR 키트</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석 키트</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA 분석 키트</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex 96-well PCR 시스템</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% TBE DNA gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td><td>10-well</td></tr><tr><td>Novex TBE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr><tr><td>Novex 고밀도 TBE 시료 버퍼</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10mg/ml 에티듐 브로마이드</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT 고속 실시간 PCR 시스템</td><td>Life</td><td>Technologies</td><td>4329001 384-웰 블록</td></tr><tr><td>DynaMag-96 사이드 스커트</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 비드</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5mm</td></tr><tr><td>CLC 유전체학 워크벤치</td><td>메틸화 파이프라인용</td><td>Qiagen</td><td></td> 소프트웨어</tr><tr><td>QIAQuick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS 염산염</td><td>Sigma</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384웰 풀 스커트 플레이트, 표준</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>앱솔루트 qPCR 씰</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA 메틸화-라이트닝 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq DNA 중합효소</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

dna 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

유전자 발현 조절에서 후성유전학적 과정의 역할은 수년 동안 알려져 왔습니다. 시토신 잔기에서의 DNA 메틸화는 유전자 발현의 오래 지속되는 동적 조절자인 것으로 입증되었기 때문에 후성유전학 연구에서 특히 중요합니다. 건강과 질병의 후성유전학적 변화를 조사하려는 노력은 처리량이 많고 정량적으로 정확한 방법이 없기 때문에 방해를 받았습니다. 차세대 염기서열분석(NGS) 기술의 출현과 대중화로 인해 이러한 도구는 이제 기존의 유전체 및 전사체 방법론 외에도 후성유전체학에 적용되고 있습니다. 특정 유전자 프로모터 또는 CpG 섬과 같은 관심 영역이 확인되고 높은 정량적 정확도로 상당한 수의 샘플을 검사해야 하는 시토신 메틸화의 후성유전학적 연구를 위해 BSAS(Bisulfite Amplicon Sequencing)라는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 중아황산염 변환과 관심 영역의 표적 증폭, 트랜스포좀 매개 라이브러리 구축 및 벤치탑 NGS를 결합합니다. BSAS는 한 번에 최대 96개의 샘플에서 최대 10kb의 대상 영역을 분석할 수 있는 빠르고 효율적인 방법을 제공하며, 이는 기본적인 분자 생물학 기술을 갖춘 대부분의 연구 그룹이 수행할 수 있습니다. 그 결과 염기 특이성을 가진 시토신 메틸화의 절대 정량화를 제공합니다. BSAS는 모든 DNA 소스의 모든 게놈 영역에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 전체 게놈 중아황산염 염기서열분석, 감소된 대표성 중아황산염 염기서열분석 및 메틸화된 DNA 면역침전 염기서열분석과 같은 게놈 전체 메틸화 분석에서 확인된 영역을 확인하는 것뿐만 아니라 관심 대상 영역에 대한 가설 테스트 연구에 유용합니다.

BSAS 제대로도 5를 닮은 것 변환 된 레퍼런스 시퀀스에 정렬 읽는다. CpG 디 뉴클레오티드는 명확히 식별 할 수 있고, 메틸화 상태는 읽기에 매핑 된 CpG 부위에서베이스 호출을 관찰함으로써 추정 될 수있다. 예를 들어, 메틸화 컨트롤, 0 %는 모든 메틸화가 T의 (도 5a)를 함유 된 CpG 부위에 매핑 판독 될 것이다. 100 % 메틸화 컨트롤 매핑 읽기 모두가 C의 (그림 5B)를 포함 된 CpG 사이트에 대한 읽기가 발생합니다. 된 CpG 부위에서 주파수 시토신 (C / C + T)의 정량은 원래 샘플 메틸화 주파수를 산출한다. 전체 게놈의 메틸화 컨트롤 (N = 3 / 메틸화 비율)에서 발생하는 대표적인 표준 곡선은 각 메틸화 비율 (그림 6)에서 정량의 메틸화 정량의 선형성뿐만 아니라 정밀도를 보여줍니다. 총이 방법의 예로서, RNA 및 DNA는 공동 ISO이었다<html> 마우스 소뇌와 망막 (N = 4 / 그룹)에서 lated. 선택적 망막 조직에서 발현 로돕신 발현, qPCR을 사용하여 측정 하였다. 표현은 망막 (그림 7A)에서 검출되었다. BSAS를 사용하여, 메틸화 된 CpG 수준은 로돕신의 프로모터 영역에서 정량화 하였다. 프로모터 영역에 걸쳐 누적 메틸화 수준은 망막 (p &lt;0.001, 파라 메트릭 테스트 t) (도 7B)에서 &lt;15 %에 비해 소뇌에서&gt; 80 %이었다. 부위 특이 적 메틸화 정량로부터 BSAS 메틸화 정량 이점 및 메틸화 수준은 특정 지역 전체 게놈의 CpG 관련 기초 비교 될 수있다. 망막 샘플 (p &lt;0.001, 각 사이트에서의 CpG 파라 메트릭 테스트 t) (도 7C)에 비해 로돕신 프로모터 걸쳐 메틸화 된 CpG 소뇌 수준은 샘플에서 유의하게 높았다. 1highres.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. BSAS 방법의 도식이 방법에서는 게놈 DNA는 유라에 unmethylation의 사이토를 수정할 변환 중아입니다. 그 후, PCR 동안 이러한 유라는 thymines로 변경됩니다. PCR 증폭은 관심 영역에 대해 유도 및 높은 단지 이러한 시퀀스 풍부하게된다. 얻어진 PCR 증폭 산물은 간단한 공정을 통해 tagmentation 듀얼 인덱싱 라이브러리로 이루어진다. 그 후 라이브러리는 벤치 탑 차세대 시퀀서에 순서가되고, 순서는 시토신의는베이스 고유의 방식으로 결정된다 실리에서 변환 된 기준 서열과 퍼센트 메틸화에 매핑되는 읽습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 관심 지역의 실리 중아 변환의 모든 게놈 기준에서 관심의 모든 영역이 SELEC 될 수 있습니다실리코 중아 변환에 대한 테드. 비의 CpG 사이토는 티민의 기준 순서로 대체됩니다. 의 CpG 사이토는 중아에서 사이토가 참조를 변환 남아있다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> 그림 3 :. 프라이머 배치 바이 설 파이트 PCR 프라이머가 실리 중아에 대해 설계는 레퍼런스 시퀀스로 변환. 뇌관은 CG 디 뉴클레오티드를 중첩하지 않도록 설계되거나 CG 디 뉴클레오티드에 인접 설계되어야한다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> 그림 4 : 높은과 낮은 품질의 PCR 증폭 산물과 염기 서열 라이브러리의 예 대표 electropherogram 추적 및 젤 쇼 (A) 하나 고와 transposome 매개 라이브러리 생성을위한 최적의 증폭.농도 제품입니다.이 증폭 물에서 생성 (B) 라이브러리 (C) 품질이 낮은 PCR 증폭 산물의 크기, 농도가 낮을 수있다. 고농도 심지어 크기 분포를 보여 주며, 여러 제품 및 / 또는 프라이머 이량 체를 포함한다. 이러한 낮은 품질의 증폭 산물은 (D)으로 이어질 낮은 농도와 낮은 크기 분포와 라이브러리 생성을 실패합니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> 그림 5 : 메틸화 컨트롤에서 시퀀싱 출력의 예. 인 실리코 (A)가 된 CpG 사이트와 참조 순서가 빨간색으로 강조 변환. 매핑 0 % 메틸화 컨트롤의 CpG 사이트에서 선택한 영역 표시 thymines (탐욕 강조 표시) 매핑을 읽습니다. 매핑 (B) 100 % 메틸화 컨트롤의 CpG 사이트에서 시토신의 (파란색 강조 표시) 매핑을 보여 읽습니다. 도 6 :. 메틸화 컨트롤 범위에서 메틸화 정량 0 %에서 100 %까지 메틸화 비율 (N = 3 / 비)로 혼합 전체 게놈 메틸화 BSAS 컨트롤을 사용하여 정량 하였다. 정량화 대 예상의 정량을 플로팅 메틸화 제어 정량의 선형성을 보여줍니다. 모든 컨트롤에 걸쳐, 메틸화 정량의 높은 정밀도가 있었다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> 도 7 : 조직 샘플로부터의 페어링 된 DNA 메틸화와 유전자 발현 분석의 예. (A) 마우스 소뇌와 망막 조직에서 로돕신 상대 mRNA 발현. (B) 소뇌 및 망막 DNA (*** p &lt;0.001, 파라 메트릭 t-test를) 사이에 BSAS에 의해 정량화 로돕신 평균 프로모터 메틸화. &lt;마우스 소뇌와 망막 DNA의 전사 시작 사이트 [TSS])를 기준으로 로돕신 프로모터 (+6 -244에 걸쳐 강한&gt; C)의 CpG 사이트 별 메틸화 수준.

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

이 절차의 전반적인 목표는 관심 조직 또는 세포에서 분리한 게놈 DNA의 표적 관심 영역 내 CPG 메틸화를 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 중아황산염 특이적 PCR 프라이머를 설계하여 중아황산염 전환 게놈 DNA로부터 관심 영역을 증폭함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 중아황산염 전환된 관심 영역을 증폭하고, 해당 증폭 산물로부터 차세대 염기서열 분석 또는 NGS 라이브러리를 생성합니다.다음으로, 라이브러리를 시퀀싱하여 분석을 위한 FASTQ 파일을 생성합니다. 마지막 단계에서는 시퀀싱 리드를 바이설파이트 처리된 참조 표적 서열에 정렬하며, 최종적으로 설파이트 앰플리콘 시퀀싱 또는 BS-AS를 통해 5-mc 백분율을 계산함으로써 모든 모델 생물의 관심 영역 내 CpG 메틸화를 정밀하고 정확하게 정량화할 수 있습니다. 생거 시퀀싱과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 BS-AS가 신속하고 고처리량인 방식으로 정확하고 정밀한 CpG 메틸화 정량을 제공하여, 다수의 샘플에서 여러 영역을 분석할 수 있는 기회를 제공한다는 점입니다.표적을 식별하고 프라이머를 설계한 후, 단일 앰플리콘의 표적 증폭 최적화를 위한 반응물을 준비하고, PCR 플레이트를 열 밀봉 필름으로 밀봉하여 PAGE 전기영동으로 앰플리콘을 시각화합니다. 다음으로, 적절한 웰에 30 µL의 PCR 반응물 또는 래더를 로딩한 후, 200 V에서 약 45분 동안 겔을 실행합니다. 첫 번째 염색약이 겔 끝에 도달하면 반응을 중단하고, 겔 전체를 새로 조제한 5 µg/mL의 AUM bromide로 덮습니다.5분 후, 482 nm의 여기 파장에서 UV 투과조명기를 통해 겔의 이미지를 획득합니다. 래더를 사용하여 PCR 증폭산물의 크기를 측정함으로써 반응의 특이성을 결정합니다. 예상되는 증폭산물 크기 외에 다중 밴드가 나타나는지 확인하여 검출된 라이브러리 피크의 평균 크기와 몰 농도 추정치를 결정합니다.다음으로, 제조사의 지침에 따라 고감도 DNA 분석법이 적용된 모세관 전기영동 DNA 크기 측정 칩으로 라이브러리를 분석합니다. QPCR을 통해 라이브러리를 정량화하십시오. 생성된 라이브러리의 어댑터 서열에 대응하여 설계된 프라이머와 농도를 알고 있는 표준 물질을 사용하여 리얼타임 분석 기기에서 분석하며, 제조사의 지침에 따라 절대 정량 설정값을 사용합니다.그런 다음 라이브러리의 크기와 QPCR의 몰 정량 값을 사용하여 라이브러리의 몰 농도를 계산합니다. 시퀀싱 후, 압축된 fast Q 파일을 적절한 시퀀싱 분석 파이프라인으로 가져오기(import)하고, 리드 트리밍 애플리케이션에서 Q 점수를 유지할 수 있도록 리드 생성에 사용된 시퀀싱 방법을 선택합니다. 적절한 압축 fast Q 리드 파일을 가져온 다음, 일반 옵션(general options)에서 품질 점수 삭제(discard quality scores) 항목을 선택 해제합니다.가져온 리드(reads)를 저장할 위치를 선택하고 완료를 클릭합니다. 그런 다음 NGS 핵심 도구(NGS core tools)에서 시퀀스 트리밍(trim sequences)을 선택합니다. 트리밍할 리드를 강조 표시하여 Q 30 이상의 점수를 가진 리드만 남깁니다.그 다음, quality scores를 이용한 trim을 선택하고 제한 값을 0.001로 설정하십시오. 모호한 뉴클레오타이드(ambiguous nucleotide)가 1개 이하로 포함된 리드(read)만 추가로 선택하려면, trim ambiguous nucleotides를 선택하고 모호성 최대 개수를 1로 설정하십시오.그런 다음 트리밍된 리드(reads)를 저장할 위치를 선택하고 finish를 클릭하여 트리밍된 리드를 in silico 황산염 변환 유전자 참조 서열(sulfite converted gene reference)에 매핑합니다. NGS 핵심 도구(NGS core tools)에서 map reads를 선택합니다. Reference 항목에서 매핑할 트리밍된 리드를 선택하고 next를 클릭합니다.그런 다음 레퍼런스 마스킹(reference masking)에서 변환된 레퍼런스 서열을 선택하고 마스킹 없음(no masking)을 선택하십시오. '다음(Next)'을 클릭한 후 미스매치(mismatch), 삽입(insertion) 및 결실(deletion)에 대해 3점의 점수를 부여하십시오. 레퍼런스에 매핑되는 리드 길이의 최소 분율(minimum fraction of read length map to the reference)에는 1점을 부여하고, 비특이적 매치 처리(nonspecific match handling)의 매핑-리드-레퍼런스 간 최소 동일성 분율(minimum fraction of identity between the map, read and reference)에는 0.9점을 부여한 후 '무시(ignore)'를 선택하고 출력 옵션(output options)에서 '다음(Next)'을 클릭하십시오.다음으로, Create standalone read mappings를 선택하십시오. 그런 다음 result handling 항목에서 save를 클릭하십시오. 리드 매핑을 저장할 위치를 선택하고 finish를 클릭하여 매핑된 리드에 대해 변이 호출(variant calling)을 실행하십시오.재시퀀싱 분석에서 저빈도 변이 검출(low frequency variant detection)을 선택하고 분석할 리드 매핑(read mapping)을 선택하십시오. 다음(next)을 클릭한 후, 저빈도 변이 파라미터에서 0.01%를 입력하고 다음(next)을 클릭하십시오. 일반 필터(general filters)에서 최소 커버리지를 1000으로 설정하여 시퀀스 깊이가 1000 x 이상이 되도록 하십시오.마지막으로 [다음]을 클릭한 후, 출력 옵션에서 [주석 처리된 표 생성]을 선택하고 변이 표 파일을 저장할 위치를 지정한 뒤 [마침]을 클릭합니다. 변이 표 파일에서 관심 영역 내 주석 처리된 CPG 사이트의 변이 빈도를 사용하여, 전환된 참조 서열에 적절히 정렬된 설파이트 앰플리콘 시퀀싱 리드(sulfite amplicon sequencing reads)를 통해 CG 컨텍스트 내 참조 사이토신의 사이토신 메틸화 빈도를 계산하면 그림에 예시된 것과 유사한 결과가 나타납니다. CPG 디뉴클레오타이드를 명확하게 식별할 수 있으며, CPG 사이트의 염기 호출(base call)을 관찰함으로써 메틸화 상태를 추정할 수 있습니다. 매핑된 리드에서 메틸화가 0%인 경우, CPG 사이트에 티민이 매핑된 리드가 생성됩니다.100% methylation 대조군은 CpG 사이트에 매핑된 사이토신을 포함하는 매핑 리드 결과로 나타납니다. 본 실험에서는 생쥐의 소뇌와 망막에서 RNA와 DNA를 공동 분리하였습니다. 그 후, 예상대로 망막 조직에서 선택적으로 발현되는 옵신(opsin)의 발현량을 QPCR을 사용하여 측정하였습니다.중아황산염 증폭 시퀀싱(bisulfite amplification sequencing)을 통해 opsin 프로모터 영역의 CpG 메틸화 수준을 정량 분석한 결과, opsin RNA는 망막에서만 검출되었습니다. 그러나 프로모터 영역 전체의 누적 메틸화 수준은 망막의 15% 미만에 비해 소뇌에서는 80%보다 높았습니다. BS-AS 메틸화 정량 분석은 부위 특이적 메틸화 정량이 가능하므로, 임의의 게놈 영역 전체에 걸쳐 CpG별 메틸화 수준을 비교할 수 있다는 장점이 있습니다.실제로 본 실험에서는 망막 시료와 비교했을 때 소뇌 시료의 옵신 프로모터 전반에 걸친 CpG 메틸화 수준이 유의미하게 더 높은 것으로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 조직 또는 세포에서 분리한 게놈 DNA의 특정 관심 영역 내 CpG 메틸화를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

DNA의 methylation 분석을위한 황금 표준 bisulphite 변환 DNA의 게놈 시퀀싱 수 있습니다. 이 방법은 산성 조건 하에서 deamination을 bisulphite 5 - methylcytosine (5 멕)과 비교 사이 토신의 증가 감도 활용합니다. Unmethylated cytosines는 대상 게놈의 DNA의 PCR 증폭 후 methylated cytosines 구별하실 수 있습니다.

의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing은 시토신 중아황산염 변환과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 DNA 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 준비하는 방법입니다. 이 프로토콜은 50ng의 시작 물질이 필요하며 GC가 풍부한 게놈 영역에서 염기쌍 분해능 데이터를 생성합니다.

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

여기, 우리 프로토콜 및 관련 만성 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인을 쥐 모델을 사용 하 여 메 틸 Seq, epigenomic 플랫폼의 구현을 설명 합니다. 결과 쥐 메 틸-Seq 플랫폼은 쥐에서 스트레스 노출에서 발생 하는 메 틸 화 차이 감지 수를 보여 줍니다.

쥐 메 틸-Seq 플랫폼 관련 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인 하

여기서 설명된 메틸화 특이적 프로브 증폭 방법은 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포에서 LINE-1 원소의 메틸화 수준을 분석하는 방법이다. 태아 소 혈청에서 세포 외 소포를 분리하는 인기있는 절차인 초원심분리도 입증되었습니다.

골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석

본명, 위장관암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석을 위한 절차를 기술하고 있다. 절차는 유전자의 메틸화 패턴과 위장암에 있는 발암발생에 기여하는 요인 사이 관계를 조사하는 연구 결과에 관련성입니다.

위장암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

배우세요 BSAS를 활용한 DNA 메틸화 정량 분석 방법입니다. 비설파이트 전환과 NGS를 결합하여 특정 게놈 영역의 CpG 메틸화 수준을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 이 기술은 후성유전학 연구에 필수적인 도구입니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

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