유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 지원되는 지질 이중층에서 자연 살해 또는 NK 세포의 면역학적 시냅스의 초고해상도 이미지를 성공적으로 캡처하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 NK 세포 활성화 수용체 CD 16 In chamber slides에 대한 항체를 포함하는 유리 지지 평면 지질 이중층을 구축하여 수행됩니다. 그런 다음 이전에 분리된 NK 세포를 평면 항체 내장 지질 이중층에 첨가한 다음 f 액틴 및 퍼포린으로 세포를 염색합니다.

마지막 단계는 스테드 현미경을 사용하여 생성된 NK 세포 시냅스를 이미징하는 것이며, 궁극적으로 지지된 지질 이중층에서 NK 시냅스를 이미징하는 것입니다. stead를 사용하면 NK 세포 시냅스를 향상된 세부 사항으로 표시할 수 있으며, 이를 통해 낮은 F 액틴 밀도 영역에 위치한 액틴 세포골격 및 페란 양성 지질 과립의 초미세 구조를 시각화할 수 있습니다. 따라서 이 기술의 mainwan는 유리제 지원 보통 지질 장벽이 정력 세포의 플러스 막, 이 정상적인 지질 장벽에 단백질을 모방할 수 있다 입니다.

그들은 측면으로 움직일 수 있으며, 이는 면역 시냅스와 매우 논리적으로 관련된 형성을 더 잘 요약 할 수 있습니다. 이 메시지는 면역학 분야의 주요 기독교인들에게 답변하는 데 도움이 될 수 있으며, 연구자들은 상업적이고 미시적인 접근 방식을 사용하여 달성할 수 없는 시냅스 형성을 제어 방식으로 자세히 시각화할 수 있습니다. 박사 후 연구원 페인팅과 대학원생 보조금은 유리로 지지되는 평면 지질 이중층을 조립하는 절차를 시연합니다.

먼저 비커에 30%의 과산화수소와 황산을 1:3의 비율로 이 용액에 혼합하여 100ml의 피라냐 용액을 준비합니다. 커버 슬립을 청소하는 동안 두 개의 직사각형 숫자 1.5 커버 슬립을 20-30분 동안 놓습니다. 이전에 준비된 400마이크로몰 DOPC 지질 튜브 1개와 이전에 준비된 80마이크로몰 비오틴 PE 지질 튜브 하나를 검색합니다.

새로운 마이크로 원심분리기 튜브에 산소를 제거한 후 얼음에 담아 아르곤 탱크로 운반합니다. DOPC와 비오틴 PE를 1:1 비율로 추가합니다. 구체적인 부피는 실험 요구 사항에 따라 다르지만 최소 2마이크로리터 이상이어야 합니다.

각 deoxy는 사다리를 냉장고에 반환하기 전에 혼합물 튜브와 개별 시약 튜브에 산소를 공급합니다. 청소가 끝나면 덮개가 증류수로 미끄러집니다. 커버 슬립을 꺼내 몇 분 동안 자연 건조시킨 다음 1.5마이크로리터의 리포좀 혼합물과 분취액을 챔버 슬라이드의 레인 챔버 중 하나로 한 방울 떨어뜨립니다.

레인당 두 개의 드롭을 사용하는 것이 일반적이지만 필수는 아닙니다. 이제 빠르고 효율적으로 드라이 커버 슬립을 방울 위에 놓고 커버 슬립을 놓으면 방울이 합쳐지지 않도록 충분한 간격을 유지해야 합니다. 또한, 방울이 챔버 벽의 가장자리를 건드리지 않고 원형으로 잘 정의되어 있는지 확인하십시오.

덮개 사이의 방수 밀봉을 보장하기 위해 각 레인 사이와 주변을 단단히 누릅니다. 미끄러짐과 슬라이드는 마커 펜을 사용하여 방울의 위치를 표시합니다. 그런 다음 챔버를 통해 100 마이크로 리터의 수성 5 % 케이싱을 통과시켜 이중층을 차단합니다.

흐름 챔버에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 밀리리터당 333나노그램의 농도로 100마이크로리터의 스트렙 아딘을 각 레인에 주입합니다. 실온에서 10-15분 동안 배양한 후, 각 레인을 통해 1%인간 혈청 알부민이 함유된 완충 식염수 3ml를 통과시켜 세척합니다.

과량의 트리틴을 제거하려면, 20-30분 동안 어둠 속에서 배양한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이전에 결정된 단백질 농도로 biotinylated 형광 표지된 anti CD 16 100마이크로리터를 첨가합니다. 각 레인을 통해 1%인간 혈청 알부민이 함유된 3밀리리터의 힙을 버퍼링하여 다시 세척합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 D 비오틴을 25나노몰 농도로 챔버를 통해 흐르게 하여 과도한 STR 타빈과 결합하여 STR 타빈이 세포에 비특이적으로 결합할 가능성을 제거합니다.

다음으로 인간 NK 세포를 계수하고 1%인간 혈청 알부민으로 완충된 식염수에 밀리리터당 500, 000의 농도로 재현탁합니다. 챔버에서 D 비오틴을 레인당 1%인간 혈청 알부민으로 완충된 식염수 3ml로 세척합니다. 세포가 원하는 농도로 재현탁되면 각 레인에 100마이크로리터를 추가합니다.

챔버를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에 30-60분 동안 놓습니다. 이 배양 기간이 끝나면 실온에서 10-20분 동안 4%파라폼 알데히드로 세포를 고정합니다. 파라폼 알데히드를 제거하기 위해 각 레인을 통해 3ml의 인산염 완충 식염수를 통과시켜 세척합니다.

그런 다음 400마이크로리터의 차단 완충액을 첨가한 후 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 2마이크로리터의 희석된 형광 표지된 Phin과 형광 표지된 안티 페란 단일클론 항체를 실온에서 1시간 동안 배양한 후 챔버를 통해 3ml의 인산염 완충 식염수를 실행하여 세척하여 f 액틴과 퍼포린을 염색합니다. 챔버는 이미징을 시작할 준비가 되었습니다.

스테드 현미경의 필요한 모든 하드웨어 모듈을 켭니다. 이미지 분석 소프트웨어를 시작하고 공진 스캐닝 및 stead 모듈을 모두 활성화합니다. 이러한 선택을 한 후 소프트웨어가 시작될 때까지 약 3-5분 동안 기다립니다.

화면 상단의 구성 탭을 클릭하고 레이저 구성을 선택합니다. 그런 다음 백색광과 stead 592 나노미터 레이저를 켭니다. 100 x objective를 선택하고 excitation laser beam을 592 nanometer depletion laser에 정렬합니다.

레이저 구성 모듈을 선택하고 592 공핍 레이저를 끈 다음 660 나노미터 공핍 레이저를 켭니다. 슬라이드를 s에 놓습니다.tage 렌즈 위로. 경계가 설정된 이중층 영역에 결합된 세포를 백색광 램프와 접안렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다.

그런 다음 구성 탭의 오른쪽에 있는 획득 탭으로 바로 돌아갑니다. switch to white light(백색광으로 전환) 탭을 클릭한 다음 해당 모듈을 켜고 excitation laser line을 적절한 파장으로 드래그합니다. 원하는 검출기를 선택하고 감지 범위를 설정한 후 왼쪽 획득 도구 모음에서 순차적 버튼을 클릭하여 왼쪽 도구 모음 하단에 순차적 스캔 대화 상자를 불러옵니다.

이를 통해 사용자는 각각 다른 색상에 대해 다른 여기 빔을 가진 여러 시퀀스를 추가할 수 있습니다. 프레임 사이를 클릭한 다음 각 추가 색상에 대한 여기 주파수 감지기와 감지 범위를 설정합니다. 모든 설정이 최적화되면 시작을 눌러 획득 프로세스를 시작합니다.

유리로 지지된 평면 지질 이중층의 NK 세포 시냅스의 삼중 색상 스테드 이미지는 빨간색으로 표시된 항 CD 16 항체가 지질 이중층에 축적되어 F 액틴 형성을 유발하고 초점 패널의 f 액틴 메쉬를 통해 파란색으로 표시된 퍼포린의 분극 및 침투를 보여줍니다. 이 결합된 접근 방식을 사용하면 유리로 지지된 지질 이중층 내에서 형광 표지된 anti CD 16의 미세 클러스터를 명확하게 관찰할 수 있으며, 이는 NK 세포에서 CD 16의 클러스터링을 직접 반영합니다. 기존의 컨포칼 이미지와 비교했을 때, CD 16 중앙 클러스터의 고리 구조는 고갈된 주변 형광으로 인해 스테드 이미지에서 더 쉽게 식별됩니다.

또한, actin cytoskeleton의 ultra structure는 상당히 향상된 해상도로 보입니다. 이전 관찰과 일치하게, perin 양성 용해 과립은 F 액틴 밀도가 낮은 영역에 위치하는 것으로 보입니다. 스테드 이미지에서, 컨포칼 이미지에서 대부분 손실되는 중요한 세부 사항은 일단 마스터되면, 이 기술을 진행하는 동안 적절하게 수행하면 약 4시간 동안 수행할 수 있습니다.

산소를 아르곤으로 반복적으로 대체하여 샘플을 탈산소화된 상태로 유지하는 것이 중요하며, 챔버를 조립할 때 샘플 위에 커버 슬립을 신속하게 놓고 케이싱 용액에 담그십시오.