Name: 유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 학습하세요 STED 현미경을 이용하여 유리 지지 평면 지질 이중층에서 NK 세포 면역 시냅스의 초고해상도 이미징 방법을. 이 기술은 면역학 연구자들이 세포 수준에서 면역 반응을 상세히 관찰할 수 있게 합니다.

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이미징 및 디콘볼루션 분석을 제공해 주신 Emily Mace와 Malini Mukherjee에게 감사드립니다. Liu 실험실에서의 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)의 Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant 번호 AI36211, Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children's Hospital Pediatric Pilot Research Fund, Baylor College of Medicine 및 Methodist Research Institute의 Lymphoma SPORE Developmental Research Program의 일부 지원을 받았습니다.

리포좀 1. 준비 <ol><li> 1,2- dioleoyl-SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DOPC) 및 1,2- dioleoyl-SN 글리세로 -3- phosphoethanolamine-N-캡 바이​​오틴 클로로포름 탁 스톡 용액의 양을 계산 (비오틴 PE) 원하는 최종 농도로 희석 주식을 확인합니다. 10 ㎖를 각각 400 μM의 DOPC 80 μM 비오틴 - PE 인지질의 최종 농도를하려면 별도의 유리 크로마토 그래피 튜브에 10 ㎎ / ㎖의 DOPC의 629 μL, 88 μL 10 ㎎ / ㎖ 비오틴-PE를 배치하여 시작합니다. 참고 :이 DOPC과 비오틴 - PE의 클로로포름 중단 원액을 전송하는 동안, 용액 (120 ml의 물을 포함하는 60g의 수산화 칼륨, KOH 1 L 95 % 에탄올)을 청소하여 유리 해밀턴 주사기 및 유리 크로마토 그래피 관을 청소하는 것이 중요합니다. </li><li> 화학 후드에서 아르곤의 흐름과 함께 클로로포름을 건조. 파라 필름으로 크로마토 그래피 관을 밀봉합니다. </li><li> lyophiliz에서 높은 진공에 새로 건조 된 리포좀을 가하지어 O / N은 ​​잔류 클로로포름을 제거합니다. 60 ~ 90 분간 건조 당일 완료하십시오. </li><li> 동결 건조기을 실행하는 동안, 일부 희석 버퍼를 준비합니다. 이 프로토콜의 경우, 25 mM 트리스, pH를 8.0로 구성된 25 ml의 준비; 150 mM의 NaCl을; 및 (중량) 2 % n- 옥틸-β-D-라노 시드 (OG) 세제. 다음 건조 OG 분말을 추가하기 전에 아르곤과 산소를​​ 치환 함께 먼저 처음 두 재료를 섞는다. 제조 후, 12 ° C에서 OG 0.2 마이크론 셀룰로오스 아세테이트 막과 용액 및 저장소 필터. </li><li> 또한,하지만 OG없이, 같은 농도에서 트리스 식염수 버퍼의 1 L의 두 나사 상단 병을 준비합니다. 각의 바닥에 증류수 세척 자기 교반 막대를 놓습니다. 트리스 식염수 버퍼의 6 추가 리터를 준비합니다. 아르곤과 모든 병에서 산소를 제거하고뿐만 아니라 4 ° C에 배치합니다. </li><li> 동결 건조 후, 각각의 4 mM의 용액을 만들기 위해 식염수 OG 트리스 완충액 건조 지질을 용해. 예를 들어 다음볼륨, 비오틴-PE 관에 DOPC 튜브 2 ml를, 0.2 ml에 추가합니다. </li><li> 함께 DOPC 지질과 비오틴 - PE 지질을 섞는다. 결합 된 비오틴은 포스페이트 헤드 기의 유동성을 저해 할 수 이것은, SLB의 이동도를 향상시킨다. 80 μM PE 비오틴의 최종 농도를 확인하기 위해, 0.2 mM의 4 비오틴 PE ml의 4 mM의 DOPC 1 ㎖를 혼합한다. 그런 다음 트리스 식염수 OG 버퍼의 8.8 ml를 추가합니다. </li><li> 400 μM의 DOPC의 최종 농도를 들어, 단순히 트리스 - 식염수 OG 9 ml로 4 mM의 DOPC 1ml의 섞는다. </li><li> 얼음 물 초음파기를 입력합니다. 유틸리티 클램프를 사용하여 초음파 처리의 중심에 인지질을 함유하는 희석 된 유리관을 넣어. 맑은 용액이 될 때까지 10 분 동안 초음파 처리 희석 인지질. 주 : 초음파가 열을 발생하기 때문에 낮은 온도를 유지하기 위해 초음파기 물을 욕조에 얼음을 추가합니다. </li><li> 액체 위의 공기에서 산소를 대체하기 위해 아르곤으로 튜브를 입력하고, 파라 필름으로 밀봉합니다. </li></ol&gt; 리포좀 2. 투석 <ol><li> 건조 투석 튜브의 두 부분을 잘라 (분자량 컷 - 오프 : 12-14,000, 직경 : 6.4 mm) 적당한 길이의 (이 예에서는, 40cm), 각 인지질 희석 하나를 롤에서. </li><li> 이들을 2 분 동안 유리 비이커에서, 증류수 200ml에 침지 할 수 있도록함으로써 튜브 섹션을 재수. </li><li> 높은 설정에서 5 분 동안이 전자 레인지, 또는 적어도 물이 끓게 올 때까지. </li><li> 각 튜브의 한쪽 끝에서 매듭을 묶어 트리스 식염수 OG 버퍼의 몇 밀리리터로 내부를 씻어. 그 후, 내부에 남아 꼼꼼하게 버퍼의 양을 최소화하기 위해 가능한 본 세척 완충액만큼을 짠다. </li><li> 모든 공기를 배제하도록 층류 후드에서 작은 투석 튜브의 폐쇄 단부와 개방 각 희석 튜브에 인지질을 추가 클램프. 전체 공기 배제 및 아래 클램핑하여 샘플의 작은 볼륨의 희생이 필요합니다# 8220; 물 라인 &quot;. </li><li> OG없이 트리스 식염수 버퍼의 이전 준비 병 샘플을 담근다. 4 ℃에서 O / N를 저어 다시 밀봉 및 장소하기 전에 아르곤와 병에 산소를 치환. </li><li> 적어도 3 회 OG없이 트리스 완충액 식염수의 새로운 병으로 매 12 시간 동안 튜브를 전송합니다. </li><li> 곧 투석 지질을 제거하기 전에 산소를 대체하기 위해 아르곤과 각을 작성하여 지질 나누어지는 데에 작은 튜브의 수를 준비합니다. </li><li> 36 시간 후, 층류 후드에 투석 병을 가지고 병에서 투석 튜브를 제거합니다. 젖은 유출수를 수집하는 손에 벤치 기저귀 또는 비커 있습니다. </li><li> 다음 클립을 조심스럽게 제거하고 얼음에 아르곤 가스로 채워진 튜브 제조 사전에 1 ㎖의 분액으로 피펫을 통해 투석 된 지질 용액을 전송하고, 상기 클립 투석 튜빙을 잘라. </li><li> 수성 리포좀 솔루션을 나누어지는, 나는 산소를 다시 변위 아르곤 스트림을 사용n은 각 튜브. </li><li> 4 °에서 리포좀을 저장합니다. 냉동하지 마십시오. </li></ol> 지질 이중층에 항체 농도 3. 결정 <ol><li> 다음과 같은 농도에서, 바이오틴, 형광 표지 된 항체의 희석 시리즈, 각 희석 볼륨 50 μl를 준비합니다 (공백)이 0 ㎚, 10 nM의 50 nm의, 100 nm의, 500 nm의. (이하는 &quot;샘플 시리즈&quot;이라한다). </li><li> 96 웰 V-바닥 판의 6 우물에 실리카 비드의 1 μl를 추가합니다. 그들이 정착하는 경향이 잘 피펫 팅 전에 구슬을 흔들어해야합니다. 참고 : 중단보다는 건조 구슬을 지시 한 경우, 희석 제조업체의 지침을 따르십시오. </li><li> : 1 비율로 1 바이오틴 인지질 :이 구슬에,이 혼합 DOPC의 μl를 추가합니다. 각 웰에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 구슬과 인지질과의 상호 작용을 장려하기 위해 10 초마다 중간 강도에서 3 번 vortexer를에 접시 펄스. </li><li> 5 % CAS의 150 μl를 추가각 웰에 EIN. 피펫 팅에 의해 세 번 아래로 잘 섞는다. </li><li> 플레이트는이어서, 10 분 동안 카제인 용액에 부화 씻어 보자. 세척, HEPES 250 μL의 총 부피로 각 웰을 채우는 1 % 인간 혈청 알부민 (HSA)과 식염수 (HBS)를 버퍼링. 2 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 아웃 피펫 맨 상층 액을 200㎕를 버리고, 3 회의 세탁 총 두번 반복한다. </li><li> 333 NG / ml의 농도에서 스트렙 타비 딘의 50 μl를 추가합니다. 다시 10 초를 3 배 판 펄스, 그리고 15 분 동안 진탕에 앉아 보자. 워시 배 단계 6과 결합되지 않은 스트렙 타비 딘를 제거합니다. </li><li> 이전에 준비 희석 시리즈에서 형광 표지 된 비오틴 항체의 50 μl를 추가 아니라 각 (단계 3.1 참조), 20 ~ 30 분 동안 진탕에 접시를 교체합니다. 워시 배 단계 6과 결합되지 않은 항체를 제거합니다. </li><li> 최종 세척 한 후, 다음 FACS 튜브로 전송, HBS / 1 % HSA 100 ㎕에 구슬을 재현 탁. 에이 두 번 반복300 μL의 총 아니라 모든 구슬의 효율적인 제거를 확인하고 각각의 웰에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 유량 계측기에 결과 튜브를 가져와. 그것은을 읽을 수있는 시간입니다. </li><li> 형광 강도 캘리브레이션 (FIC) 비드 키트에서 &quot;B&quot;로 표시된 병에서 1 방울 추가를 FACS 튜브 (이하 &quot;표준 시리즈&quot;라고 함), 및 HBS / 1 % HSA 300 μL로 희석 하였다. </li><li> 이 튜브를 읽을 수 있지만 아직 데이터를 기록하지 않습니다. 지금은 단순히 빈 구슬이 제대로 제로되어 있는지 확인합니다. 피크가 히스토그램의 왼쪽 끝에가 될 때까지 적절한 채널에서 측정 된 비드의 형광을 나타내는 히스토그램을 확인한 후 다운 여기 레이저의 시프트 전압. </li><li> 튜브를 제거하고 같은 튜브 (1 ~ 4 표시) 시리즈의 다른 4 관의 각 1 방울을 추가합니다. 이제, 다시 기계에 튜브를 배치하고 5 별개의 봉우리로 나타납니다 결과 데이터를 기록한다. </리&gt; <li> 샘플 시리즈에서 각각의 튜브를 읽어보십시오. </li><li> FACS 분석 소프트웨어를 사용하여, 최대량의 절반 지점에서 일련의 표준 히스토그램의 각 피크의 전체 폭에 걸쳐 게이트를 그린다. 즉, 각 피크에 대한 하나의 게이트입니다. 각 샘플에 대해 동일한 작업을 수행합니다. MFI 각 게이트에 대한 (평균 형광 강도) 참고. </li><li> 적절한 위치에서 스프레드 시트 프로그램을 입력 MFI 측정 값을 이용하여. 또한 입력 MESF 값 (이에 상응하는 수용성 형광 색소의 분자) 표준 시리즈의 각 병 (각 비드 코팅 형광 분자의 평균). 이 정보는 플라스틱의 방향이 튜브에 와서 항아리에 따라 찾을 수 있습니다. </li><li> 형광체의 수 및 측정 된 세기 간의 선형 상관 관계를 생성 MESF 값들에 대해 플롯 것 MFI 스프레드 시트를 사용한다. </li><li> Pro에 염료의 비율을 결정하기 위해 마이크로 볼륨 분광 광도계 &#39;단백질 및 라벨&#39;의 모듈을 사용표지 된 항체에 TEIN. </li><li> 입력 샘플 단백질의 표지 효율, 지질 코팅 비드의 평균 직경은, 각 항목에 대한 값 MFI. 스프레드 시트를 자동으로 각 희석 및 단백질 농도에서 각 샘플의 단백질 시딩 MESF 밀도 값을 계산하는 단계에서 생성 3.16 선 그래프에서 수식을 사용한다. </li></ol> 4. 분리 및 배양 인간 NK 세포 <ol><li> 나누어지는 15 ml의 50 ML 원뿔 튜브에 말초 혈액이나 버피 코트. PBS 1의 비율로 1 % FBS를 함유하는 혈액이 희석 : 1. </li><li> 부드럽게 10 ml의 혈청 학적 피펫 튜브의 바닥에 피콜의 13 ML을 추가합니다. </li><li> 원심 분리기 (20) 가속기와 1200 XG에 분 휴식 오프 또는 가장 낮은 설정에서이 튜브. </li><li> 원심 분리 후, W (PBMC를) 말초 혈 단핵 세포의 플로팅 흐린 백색 중간층을 수집 혈청 피펫을 사용HICH 앉아서 맑은 노란색 상위 계층과 적혈구 (적혈구)의 최하층 위에 앉아 둘 다 더 흐린 옅은 색의 하위 계층 사이의 교차한다. 참고 PBMC를 수집의 모든 적혈구를 수집하지 마십시오. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 수집 된 PBMC를 배치하고 PBS 1 % FBS를 포함하여 용량을 희석. 다시 원심 분리기, 300 x g에서 5 분 동안 최대의 브레이크와 가속,이 시간. </li><li> 뜨는을 취소하고 1 % FBS를 포함하는 PBS 10ml에 세포를 재현 탁. </li><li> 단계 4.6에서와 같이 한 번 더 동일한 설정에서 원심 분리하는 동안 세포를 계산합니다. </li><li> 다시 한번 상층 액을 제거하고, 천만 세포 / ml의 밀도로 배지에서 R10 세포를 재현 탁. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, 5 ml의 폴리스티렌 튜브 천만 세포를 가지고, 자기 분리 키트를 사용하여 NK 세포를 분리. 분리 후, 500,0의 밀도로 세포 하나 더 재현 탁를 계산R10 완전 배지에서 00 세포 / ㎖ (88 % RPMI, 10 % FBS, 1 % HEPES; 1 % 피루브산 나트륨) IL-2 (100 U / ml)로 보충. CO 2 배양기에서 37 °,과에서 문화는 2 ~ 3 회 주간 매체를 교체합니다. </li></ol> 5. 유리 지원 평면 지질 이중층 조립 <ol><li> 비이커에 3 : 1의 비율로 황산 30 % 과산화수소를 혼합함으로써 100 ㎖의 피라냐 용액을 준비한다. 참고 : 항상 제대로 지정 화학 흄 후드에서 황산 등 유해 에이전트와의 작업을 수행. </li><li> 이 솔루션으로, 20 ~ 30 분 동안 피라나 용액이 직사각형 # 1.5 된 커버를 체험. 참고 : 피라 솔루션으로 된 커버를 청소하는 것이 필수적이다. </li><li> 된 커버를 청소하는 동안 이전에 400 μM의 DOPC 지질 및 이전에 80 μM 비오틴 - PE 지질 준비의 1 튜브 준비의 1 관을. 아르곤 탱크에 얼음을 운반. </li><li> 아르곤으로 새로운 microcentrifuge 관에서 산소를 대체,: 1의 비율로 다음 1 DOPC과 비오틴-PE를 함께 추가합니다. 특정 볼륨이 실험의 요구에 따라 달라질 수 있지만, 최소 2 μL를 각에 있어야합니다. 냉장고에 후자를 리턴하기 전에, 한번뿐만 아니라 아르곤 가스, 개별 시약 튜브 혼합물을 튜브에서 산소를 변위. </li><li> 그들은 청소를 마친 후, 철저하게 증류수로 된 커버를 씻어냅니다. 몇 분 동안 건조 공기 아웃 된 커버를 설정합니다. </li><li> 단계 5.4에서 제조 한 리포솜 혼합물의 1.5 μl를 취하여 슬라이드 챔버의 챔버 레인 중 하나에 한 방울에 나누어지는. 레인 당 2 방울의 전형적인 사용되지만, 필요하지 않다. </li><li> 신속하고 효율적으로 물방울을 통해 건조 커버 슬립을 배치합니다. coverslip에 배치되면 그들이 병합하지 않도록 방울 충분히 이격되어 있는지 확인합니다. 또한, 방울 챔버 벽의 가장자리를 건드리지 않고, 원형과 잘 정의 된 남아 있는지 확인하십시오. 단단히 누르십시오사이 각 레인의 주위에 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 방수 씰을 보장합니다. </li><li> 마커 펜을 사용하여 방울의 위치를​​ 마크 </li><li> 이중층을 차단하는 챔버를 통해 수성 5 % 카제인 100 ㎕ 합격. 유량 용기에 기포가 없음을 확인하십시오. </li><li> 각 레인에 333 ng / ml의 농도에서 스트렙 타비 딘 100 ㎕를 주입한다. 실온에서 10 ~ 15 분 동안 품어. 그 후, 여분의 스트렙 타비 딘을 제거하기 위해 각 레인을 통해 HBS / 1 % HSA 3 ㎖를 실행하여 세척한다. </li><li> 이러한 이전에 20 ~ 30 분 동안 어둠 속에서 제 3 절 품어에 가장 효과적인 것으로 판단 단백질 농도에 알렉사 플 루어 (568)으로 바이오틴 형광 표지 된 항 CD16의 100 μl를 추가합니다. 각 레인을 통해 HBS / 1 % HSA 3 ㎖를 실행하여 다시 씻으십시오. </li><li> 명세서의 비 - 특이 적 결합의 가능성을 초과 스트렙 타비 딘을 결합하고, 따라서 제거하기 위해 상기 챔버를 통해 농도 25 nm에서 D-100 μL 비오틴 흐름셀 reptavidin. </li><li> HBS / 1 % HSA 500,000 / ml의 농도에서 NK 세포에 resuspend 카운트. </li><li> 셀을 아래로 회전하는 동안, 레인 당 HBS / 1 % HSA의 또 다른 3 ml의 챔버에서 D-비오틴을 씻는다. </li><li> 이전에 NK 세포를 추가로 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 공 초점 현미경에 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구하여 SLB에 리간드의 이동성을 확인합니다. </li><li> 세포가 구동을 완료하고 원하는 농도로 재현 탁하고 나면, 각 레인에 100 μl를 추가합니다. </li><li> 30 ~ 60 분 동안 37 ° 5 % CO 2 배양기에서 챔버를 놓습니다. </li><li> 이 잠복기 후, 10 ~ 20 분 동안 실온에서 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 고정합니다. 파라 포름 알데히드를 제거하기 위해 각 레인을 통해 PBS의 3 ㎖를 실행하여 씻으십시오. </li><li> 버퍼 (5 % 정상 당나귀 혈청 0.2 % PBS에서 Tritron X-100)를 차단 400 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 얼룩 F - 굴지 및 광고에 의해 퍼포딩 희석 형광 표지 팔로이 딘에 200 μL (1 단위 / ㎖의 표지 팔로이 딘) 및 형광 표지 항 퍼포 항체 (500 NG / ml의 항 - 퍼포 단클론 항체). 1 시간 동안 실온에서 품어. </li><li> PBS의 3 ㎖를 실행하여 씻으십시오. 챔버는 이미징을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> STED를 사용하여 지질 이중층에 NK 냅 6. 이미징 <ol><li> 필요한 모든 하드웨어 모듈의 전원을 켭니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 시작. 공진 검사 및 STED 모듈을 모두 사용합니다. 이러한 선택을 한 후, 소프트웨어가 시작하기 약 3-5 분 동안 기다립니다. </li><li> 화면 상단의 &quot;구성&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> 선택 &quot;레이저 구성&quot;을 선택 후 흰색 빛과 STED 592 nm의 레이저를 켭니다. </li><li> 100 배 목표를 선택하고, 592 nm의 고갈 레이저로 여기 레이저 빔을 맞 춥니 다. </li><li> , &quot;레이저 구성&quot;모듈을 선택 592 고갈을 해제레이저 및 660 nm의 고갈 레이저에 전원을 켭니다. </li><li> 렌즈를 통해, 무대에 슬라이드를 놓습니다. 백색광 램프와 접안 렌즈를 사용하여 초점 경계가 이중층 지역에 바인딩 세포를 가져와. </li><li> 직접 &quot;구성&quot;탭의 오른쪽에, &quot;취득&quot;탭으로 돌아갑니다. </li><li> &quot;스위치 WhiteLight의에&quot;탭을 클릭 한 다음에 해당 모듈을 설정하고 적절한 파장에 여기 레이저 선을 드래그합니다. </li><li> 다음, 적절한 파장의 범위를 포함하는 것으로 검출 범위를 설정 가능한 사람들의리스트에서 원하는 감시를 선택. 참고 : 여기 빔 바로 아래에 감지 범위를 넣어하지 마십시오. </li><li> 왼쪽 도구 모음의 맨 아래에있는 순차 주사 대화 상자를 불러옵니다 왼쪽에있는 &quot;Seqential&quot;버튼을 &quot;취득&quot;도구 모음을 클릭합니다. 따라서, 사용자가 여러 서열을 추가 할 수 있도록 각다른 색상마다 서로 다른 여기 빔과 함께. &quot;프레임 사이&quot;를 클릭 한 다음 단계 6.9 및 6.10에서와 같이 각각의 추가 색상의 여기 주파수 검출기 및 검출 범위를 설정합니다. </li><li> 모든 설정이 최적화되면, 인수 과정을 시작하려면 &quot;시작&quot;을 누르십시오. </li><li> 이전 13 설명한 바와 같이, STED의 디컨 볼 루션 위해 디자인 된 설정을 사용하여 무료 디컨 볼 루션 소프트웨어 (호이겐스)를 적용합니다. </li></ol>

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본 연구의 참신은 NK 세포의 시냅스를 공부 STED와 SLB 기술을 결합한 것입니다. 이전의 연구는 세포막 6 T 세포의 시냅스 형성 (8) 및 신호 분자 인신 매매를 공부 TIRF와 지질 이중층을 이미지화했다. 다른 사람은 항체 코팅 된 유리 슬라이드 13, 14를 사용하여 NK 세포 시냅스의 STED 영상을 설명했다. 본 명세서에서 더 설명 하이브리드 방법은 지질 이중층 표면에 초 - 해상도 이미징에 의해 수득 향상된 선명도와 NK 세포에 의해 시냅스 촬상 이러한 노력을 토대로하는 APC 나은 모델의 동적 표면. SLB 수 실제 표적 세포 또는 항원 제시 세포 골격이 소유하는 것이, 지질 뗏목 부족 인공 세포막 및 기타 리간드이지만,이 기술은 이동 방향 및 리간드로서 중요한 기능 요점을 되풀이 할 수있다. 이 SLB 시스템은 해부 t에 환원 주의적 접근 방법이 될 수 있습니다IS의 형성과 IS의 역학에 대한 개별 수용체와 리간드의 그는 기여. SLB 수의 가장 중요한 특징은 연구자는 공 초점 현미경과 같이 TIRF 고해상도 영상화 방법과이 방법을 결합 할 수 있다는 것이다. STED 현미경의 도입은 더욱 연구와 임상 응용 프로그램입니다에 전례없는 통찰력을 제공,이 장점을 증가시킨다. 이 시스템의 하나의 잠재적 인 비판은 SLB 적절 따라서 결과 시냅스에 잠재적으로 비 생리적 해부학 적 특징에 상승을 제공, APC의 복잡한 표면을 모방하지 않습니다. 이 SLB에 표면 분자의 제한된 레퍼토리가 완전히 APC의 불 균질 인구 표면 요점을 되풀이하지 않는 것은 사실이지만 그것이 시냅스 형성에 개인 수용체와 리간드 상호 작용의 영향을 결정하기 위해 수사관을 허용한다는 점에서,이 제한은 유리할 수 . 티여기에 그 과정에서 몇 가지 중요한 단계입니다. 가장 중요한 중 리포좀의 산화 단계는 1.10, 2.6, 2.11처럼 끊임없이 튜브 용액에서 산소를 변위 시키 통해 아르곤을 사용하여 방지 될 수있다. 지질의 산화에 따라서 자유롭게 이동 시냅스 구조에 참여하는 표면 단백질의 능력을 방해, 감소 된 지질 이동성을 초래할 것이다. 마찬가지로, 동결 건조한다 (스텝 1.2)에 의해 모든 리포솜 클로로포름을 제거하는 것도 중요하다. 지질 이중층에서 단백질 농도의 결정에있어서, 먼저 클러스터가없는 균질 한 현탁액에 실리콘 비드를 분산시키는 것이 중요하다. 필요한 경우, 비드의 초음파를 적용 할 수있다. 된 커버 청소되는 것을 특징으로하는 SLB 조립에서, 초기 단계 (5.1-5.8)는, 방울 배치하고, 커버 슬립은 매우 중요 부착되어 있습니다. 이들의에서의 실수 (섹션 5의 시작 부분에서)를 통해 실험을 시작하기 필요로 할 수 있습니다. 이 때문에,은사고의 경우에는 시간을 절약하기 위해 필요한 것보다 더 좋은 방법은 더 된 커버를 청소합니다. 이 시스템과 함께 작동 할 때 비 클러스터링은 가장 흔한 문제입니다. 최종 단계에서 세포를 시각화하는 경우, 어느 하나의 형광을 시냅스 찾는데 실패하는 경우, 취할 수있는 몇 가지 단계가있다. 세포가 시냅스 관여하는 표면 단백질이 해야하는, 유리 커버 슬립 또는 이중층 표면에 비특이적으로 부착 할 수 있지만 동족 세포 표면 수용체에 대한 또 다른 얼룩은, 셀이 이중층으로 시냅스 형성되지 않았 음을 확인하기 위해 상기 챔버에 첨가 될 수있다 맞물려 있지 않은 표면 단백질이 세포의 둘레와 같은 확산 염색 나타나야하는 반면, 셀 이중층 인터페이스의 평면에서와 같은 별개의 클러스터를 표시. 이 방법이 실패 할 경우, 하나는 특정 마커 하나가 세포 표면에 적절한 풍부하게 표현 공부하기를 희망하고있다 있도록 유동 세포 계측법을 통해 자신의 세포를 확인해야합니다. 특정 표면 보호 자전거인은 생체 내 문화에 장기적으로 하향 조절되는 것으로 알려져있다. 이 프로토콜 세부 사항이 구체적으로 어떻게 NK 세포의 시냅스 형성을 시각화하는 동안, SLB 시스템은 단순히 단계 5.11의 기본 리간드의 치환 상상할 수있는 모든 면역 세포에서 시냅스 형성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 다수의 리간드는 또한 동시에 첨가 될 수있다. 하나는 이중층 내 표면 접착 단백질을 스트렙 타비 딘 - 비오틴 시스템을 사용할 필요가 없다. 니켈 - NTA : 히스티딘의 상호 작용도 가능한입니다. 그러나, 스트렙 타비 딘의 높은 강도와​​ 특이성 : 비오틴 상호 작용, 우리 연구소는이 시스템을 선호한다. 하나는 단계 513에서 소정의 밀도에서 이중층 상 추가 셀의 농도뿐만 아니라 성숙의 다른 단계에서 시냅스를 관찰하기 위해 후속하는 배양 기간만큼 다를 수있다. 물론 이것은 STR 세포를 시각화 가능성을 배제하더라도 이것은 심지어 라이브 할 수uctures (그들은 이미 융합 형광 태그로 표시하지 않는 한, 우리의 실험실은 몇 이러한 변형 된 세포주를 사용한다). 때문에이 프로토콜에서 가능한 사용자 정의의 높은 수준에, 하나는 기본 지질 역학 (15), 시냅스 형성을 포함, 면역학, 세포 생물학, 생화학 질문에 믿을 수 없을만큼 다양한 범위를 해결하기 위해, STED 영상과 함께, 기본 SLB 기술을 사용할 수 있습니다 16, 17, 세포 내 신호 전달 및 종양 세포의 전이 (18).

면역 시냅스 (IS) 세포 활성화 및 기능 1 중요한 교차점에 자리 잡고 있습니다. 이 항원 제시 세포 성 면역이 수행되는 주요 매체이다. 시냅스 형성의 초기 연구는 미세 세포 - 세포 공액 시스템 (2)을 이용했다. 이 방법의 중요한 한계는 따라서 시냅스 구조 자체의 관찰자의 뷰를 제한하는, 말하자면 접합체의 대부분이, &#39;프로파일&#39;보여 질 것이다. 1999 년, 더스틴 연구소는 이전 McConnel 실험실 4,5에 의해 개척되었다 유리 지원 지질 이중층 (SLB) 기술 (3)를 활용하여이 제한을 해결. 단백질이 부착 된 두 개의 차원으로 자유롭게 이동 될 수있는에 유리 지원 평면 지질 표면에 찬성 항원 제시 세포 (APC를) 처분이 방법. 이 방법을 사용하여, 더스틴와 동료 t에 직접 위로 피어 할 수 있었다그는 고해상도 형광 현미경을 이용하여, 처음으로 IS의 구조에서 &quot;일대일&quot;모양을 얻을 시냅스. SLB 시스템의 사용으로, IS가 가시화 될 수있는 세부 사항은 현재의 영상 기술 6-8의 제한에 의해 제한되어왔다. 표준 조명 기술을 이용하여, 최소 해상도 (즉, 그들이 구별 될 수있어서 별개의 두 개체 사이의 최소 거리) &lt;된 레일리 기준 (9)의 200 nm의 기준으로했다. 이 제한은 시냅스를 구성하는 매우 미세한 분자 스케일 구조물의 촬상을 방해, 및 수퍼 - 해상도 이미징 기법 10-12의 개발까지 이러한 구조의 시각화는 전자 현미경을 사용하여 고정 된 세포 이미징에 국한되었다. 이러한 SIM 같이 초 해상 기술, 다양한 최근의 출현 (구조화 조명 현미경)는, PALM (광 활성화 현지화 현미경), STORM (stochastical 광학 재건 현미경) 및 STED 10-12, 연구자들은 지금 다시 IS의 점점 더 명확히 이해를 제공하고 전례가없는 세부 사항, 이러한 시냅스 구조를 연구 할 수 있습니다. STED 현미경의 장점은 (13) 이전에 설명되었다. 여기에서 우리는 새로 개발 된 660 nm의 고갈 레이저가 장착 STED 현미경 슈퍼 해상도 이미징에 대해 설명합니다. 종래의 592 nm의 공핍 레이저에 비해, 660 nm의 레이저는 형광 염료 (http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/ 참조), 특히 이들 적색 형광체의 폭 넓은 선택을 허용한다. 다른 게시물은 항체 코팅 된 유리 슬라이드 13, 14에 NK 세포 시냅스의 STED 영상을 설명했다. 여기서, SLB 시스템은 NK 세포 시냅스 공부 초해 STED 현미경과 결합된다. 이 기술은 항체 위에 이점을 갖는다임베디드 표면 단백질은 이차원 평면의 표면 (xy 평면)으로 자유롭게 이동할 수있는 유체 모자이크,되는 코팅 슬라이드. 이것은 더 충실 타겟 셀의 유기 및 모바일 표면을 모방하고, 결과적으로 더 중요한 생리 면역 시냅스 형성을 되풀이. 이 프로토콜의 목적은 SLB 시스템 및 수퍼 - 해상도 STED 현미경을 조합하여 NK 세포의 방법 이미지 면역 시냅스의 상세한 설명과 함께 최종 사용자에게 제공하는 것이다. 또한 필요한 단계와 최종 사용자에게 제공 할 것이다 : 리포좀을 제조, 단백질 매립 이중층을 구성, 지질 이중층에 단백질 밀도를 결정하고, STED 현미경을 사용하여 초 - 해상도 이미지를 획득. 이러한 기술은 면역학 분야에 한정되지 않고, 광범위하게 다양한 분야에 걸쳐 이용 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>18:1 (&델타; 9-CIS) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>850375C</td><td>리포솜 준비</td></tr><tr><td>18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)</td><td>Avanti&nbsp;</td><td>870273C&nbsp;</td><td>리포좀 제제</td></tr><tr><td>아르곤 가스, 압축</td><td>Airgas&nbsp;</td><td>UN1006</td><td>리포솜 제제</td></tr><tr><td>동결건조기</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Freezone 7740020</td><td>리포좀 준비</td></tr><tr><td>Lyophilizer 튜브</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>7540200</td><td>리포솜 준비</td></tr><tr><td>크로마토그래피 컬럼</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205558</td><td>리포솜 준비</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9856</td><td>리포좀 제제</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Ambion&nbsp;</td><td>AM9759</td><td>리포좀 제제</td></tr><tr><td>Octyl-&beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>O1008</td><td>리포좀 제제</td></tr><tr><td>투석 튜브</td><td><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html? LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html; FrName = Spectra % 2FPor + RC + 튜브; rtm=키트;#KIT">스펙트럼 랩&nbsp; </a></td><td>132676</td><td>리포솜 준비</td></tr><tr><td>96-웰 V-바닥 폴리스티렌 플레이트 (미처리)</td><td>Corning</td><td>3896</td><td>항체 밀도 결정</td></tr><tr><td>비기능성 실리카 비드</td><td>Bangs Laboratories&nbsp;</td><td>SS06N</td><td>항체 밀도 측정</td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-2A&nbsp;</td><td>항체 밀도 측정</td></tr><tr><td>QuantumTM MESF 비드</td><td>Bangs Laboratories</td><td>가변</td><td>항체 밀도 결정</td></tr><tr><td>Casein&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>C0875</td><td>지질 이중층 제제</td></tr><tr><td>HEPES 완충 식염수 + 1% HSA</td><td>수제</td><td></td><td>지질 이중층 제</td></tr><tr><td>제 스트렙타비딘&nbsp;</td><td>생명 기술&nbsp;</td><td>434301</td><td>지질 이중층 제제</td></tr><tr><td>형광 표지된 비오틴화 단백질&nbsp;</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>지질 이중층 준비</td></tr><tr><td>ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>80608</td><td>지질 이중층 제</td></tr><tr><td>제 25x75 mm 유리 커버슬립</td><td>ibidi&nbsp;</td><td>10812</td><td>지질 이중층 제제</td></tr><tr><td>과산화수소(30%)</td><td>Fisher Scientic&nbsp;</td><td>BP2633</td><td>지질 이중층 제제</td></tr><tr><td>황산</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>258105</td><td>지질 이중층 제제</td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>B20656</td><td>지질 이중층 제제</td></tr><tr><td>렌즈 종이</td><td>VWR&nbsp;</td><td>54826-001</td><td></td></tr><tr><td>F형 침수 오일</td><td>이미징용 Leica&nbsp;</td><td>11 513 859</td><td>이미징용</td></tr><tr><td>A Leica TCS STED 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>이미징용</td></tr></tbody></table>

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

유리로 지지되는 평면 지질 이중층 시스템은 다양한 분야에서 활용되어 왔습니다. 이 기술의 가장 유용한 응용 분야 중 하나는 면역학적 시냅스 형성 연구였는데, 이는 유리로 지지되는 평면 지질 이중층이 수평 계면을 형성하면서 표적 세포의 표면을 모방할 수 있는 능력으로 인해 발생했습니다. 최근 초고해상도 이미징의 발전으로 과학자들은 시냅스 구조의 미세한 부분을 더 잘 볼 수 있게 되었습니다. 이 연구에서는 이러한 고급 기술 중 하나인 STED(Stimulated Emission Depletion)를 사용하여 지지된 지질 이중층에서 자연 살해(NK) 세포 시냅스의 구조를 연구합니다. 여기에는 따라하기 쉬운 프로토콜 세부 정보가 제공됩니다: 유리로 지지된 이중층을 합성하는 데 사용하기 위해 원시 합성 인지질을 준비하는 방법; 주어진 농도의 단백질이 이중층의 부착 부위를 얼마나 조밀하게 차지하는지 결정하는 방법; NK 세포 활성화 수용체 CD16에 대한 항체를 포함하는 지지된 지질 이중층을 구성하는 방법; 마지막으로 NK 시냅스에서 퍼포린 양성 용해 과립과 사상 액틴의 분포에 중점을 두고 STED 초고해상도 현미경을 사용하여 이 이중층에서 인간 NK 세포를 이미지화하는 방법. 따라서 유리로 지지되는 평면 지질 이중층 시스템과 STED 기술을 결합하여 이 결합 기술의 타당성과 응용성뿐만 아니라 초해상도를 가진 NK 면역 시냅스의 세포 내 구조를 입증합니다.

도 1은 지질 이중층에 항체 밀도의 결과를 나타낸다. 원리는 유동 세포 계측법 (A)를 통해 MFI 대 MESF의 표준 곡선을 만들기 위해 표준 비드를 사용하는 것이다. 일련의 샘플의 MFI는 표준 곡선을 사용 MESF로 전환시켰다. 지질 이중층에 대한 항체 농도는 선형 항체 농도 (B)과 상관된다. 유리 -지지 평면 지질 이중층에 NK 시냅스 2보기 트리플 컬러 화상 STED 도표. 지질 이중층에 항 CD16 항체 F 액틴 형성 및 편광 및 NK 세포에서의 면역 시냅스 패널에 초점 F 액틴 메시를 통해 침투하는 perforin 트리거링 축적한다. 이 결합 된 방식을 사용하여, 하나는 깨끗하게 직접 NK 세포에 CD16의 클러스터링을 반영 SLB, 내 안티 CD16 라벨 형광의 microclusters을 관찰 할 수 있습니다. 종래의 공 초점 이미지의 CD16 센트라의 구조에 비해L 클러스터는 더 쉽게 인해 고갈 된 주변 형광에 STED 이미지에서 식별됩니다. 또한, 액틴 세포 골격의 미세 구조가 크게 개선 된 해상도로 볼 수있다. 이전의 관찰 16, 17과 일치, 퍼포 양성 용해성 과립 STED 이미지, 주로 공 초점 이미지 손실 중요한 세부 낮은 F - 굴지 밀도의 영역 위에 위치 볼 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> 지질 이중층에 3G8 항체 그림 1. 밀도. (A) 표준 계열 MESF 및 MFI 간의 선형 상관 관계. (B) 단백질의 농도 및 샘플 단백질 희석 계열의 농도 간의 선형 상관 관계, 당 형광 표지 된 단백질 단량체의 수를 나타내는 지질 코팅시에 증가하는 농도의 함수로서 단위 영역리카 구슬입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> 평면 지질 이중층에 NK 시냅스 그림 2. STED 촬상. 기본 NK 세포, SLB 함유 비오틴 형광 표지 된 항 CD16 (적색)에 자극 고정 투과 가능하고 팔로이 딘 (청색) 및 안티 F 액틴 염색 (녹색). 각각의 셀은 먼저 일반 공 초점 설정 아래에 몇 군데, 다음 STED 설정했다. 공 초점 및 STED 이미지는 호이겐스 소프트웨어를 사용 deconvoluted했다. 스케일 바, 1 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 면역학적 시냅스를 형성하는 유리 지지 지질 이중층 기술과 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경의 초고해상도 이미징 기술의 조합을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 두 가지 기술을 성공적으로 수행하는 데 필요한 지침을 사용자에게 제공하는 것입니다.

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 지지 지질 이중층(supported lipid bilayer) 상에서 자연살해세포(natural killer cells 또는 NK cells)의 면역 시냅스 초고해상도 이미지를 성공적으로 캡처하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 챔버 슬라이드 내에 NK 세포 활성 수용체인 CD 16에 대한 항체를 포함하는 유리 지지 평면 지질 이중층을 구축함으로써 달성됩니다. 이후 미리 분리된 NK 세포를 항체가 내장된 평면 지질 이중층에 추가하고, f actin과 perforin으로 세포를 염색합니다.마지막 단계는 stead 현미경을 사용하여 생성된 NK 세포 시냅스를 이미징하는 것이며, 최종적으로 지지 지질 이중층 위의 NK 시냅스를 이미징합니다. stead를 사용하면 NK 세포 시냅스를 더욱 정밀하게 관찰할 수 있어, 액틴 세포골격의 초미세 구조와 F actin 밀도가 낮은 영역에 위치한 perran 양성 용해 과립의 시각화가 가능합니다. 따라서 이 기술의 주요 이점은 유리 지지 평면 지질 장벽이 표적 세포의 세포막과 그 평면 지질 장벽 위의 단백질을 모사할 수 있다는 점입니다.이들은 측면으로 이동할 수 있으며, 이는 면역 시냅스 형성을 더욱 논리적으로 관련 있게 재현할 수 있게 합니다. 이 방법은 면역학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 연구자들이 상용 및 현미경적 접근 방식으로는 불가능했던 상세하고 제어된 방식으로 시냅스 형성을 시각화할 수 있게 해줍니다. 박사후 연구원 Painting과 대학원생 Grant가 유리 지지 평면 지질 이중층을 조립하는 절차를 시연할 것입니다.먼저, 비커에 30% 과산화수소와 황산을 1:3 비율로 혼합하여 피라냐 용액 100 milliliters를 준비합니다. 두 개의 직사각형 1.5번 커버 슬립을 이 용액에 20~30분 동안 담가 세척합니다. 이전에 준비해 둔 400 micromolar DOPC 지질 튜브 하나와 80 micromolar biotin PE 지질 튜브 하나를 꺼냅니다.아르곤으로 산소를 제거한 새 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, 얼음 위에서 아르곤 탱크로 운반하십시오. DOPC와 biotin PE를 1:1 비율로 함께 첨가하십시오. 구체적인 부피는 실험적 필요에 따라 달라지지만, 최소 2 µL 이상이어야 합니다.사다리를 냉장고에 넣기 전에 각 탈산소 혼합물 튜브와 개별 시약 튜브를 밀폐하십시오. 세척이 끝난 후 커버 슬립을 증류수로 충분히 헹굽니다. 커버 슬립을 몇 분 동안 공기 중에서 건조시킨 다음, 리포좀 혼합물 1.5 µL를 취하여 챔버 슬라이드의 레인 챔버 중 하나에 한 방울씩 분주합니다.레인당 두 방울씩 사용하는 것이 일반적이지만 필수적인 것은 아닙니다. 이제 건조한 커버슬립을 액적 위에 신속하고 효율적으로 덮어주되, 커버슬립을 덮었을 때 액적들이 서로 합쳐지지 않도록 충분한 간격을 유지하십시오. 또한, 액적이 챔버 벽의 가장자리에 닿지 않고 원형의 뚜렷한 형태를 유지하는지 확인하십시오.커버 사이에 수밀 씰이 확실하게 형성되도록 각 레인 사이와 주변을 단단히 누릅니다. 마커 펜을 사용하여 드롭의 위치를 표시합니다. 그런 다음, 이층막을 차단하기 위해 100 µL의 수성 5% casing을 챔버에 통과시킵니다.흐름 챔버(flow chamber) 내에 기포가 없는지 확인하십시오. 그런 다음 각 레인에 333 ng/mL 농도의 strept adin 100 µL를 주입하십시오. 실온에서 10~15분 동안 배양한 후, 각 레인에 1% human serum albumin이 포함된 HEPES 완충 식염수를 3 mL 흘려보내 세척하십시오.과잉의 streptavidin을 제거하기 위해, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 이전에 결정된 단백질 농도의 비오틴화 형광 표지 anti CD 16 100 µL를 첨가하고 암소에서 20~30분 동안 배양합니다. 각 레인에 1% human serum albumin이 포함된 HEPES 완충 식염수 3 mL를 흘려 다시 세척합니다. 그런 다음, 과잉의 streptavidin을 결합시켜 세포에 streptavidin이 비특이적으로 결합할 가능성을 제거하기 위해 25 nM 농도의 D-biotin 100 µL를 챔버에 흘려줍니다.다음으로 인간 NK 세포의 수를 측정하고, 1% human serum albumin이 포함된 HEPES 완충 식염수에서 mL당 500,000개의 농도로 재현탁합니다. 레인당 1% human serum albumin이 포함된 HEPES 완충 식염수 3mL를 추가로 사용하여 챔버 내의 D-biotin을 세척합니다. 세포가 원하는 농도로 재현탁되면, 각 레인에 100 µL씩 첨가합니다.챔버를 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 넣고 30~60분 동안 배양합니다. 배양 기간이 지난 후, 상온에서 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 10~20분 동안 세포를 고정합니다. 각 레인에 3 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 흘려 파라포름알데히드를 제거하며 세척합니다.그 다음 400 µL의 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이어서, 희석된 형광 표지 Phalloidin 2 µL와 형광 표지 anti-perforin 단클론 항체를 추가하여 f-actin과 perforin을 염색하고, 실온에서 1시간 동안 배양한 후 챔버에 3 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 흘려 세척합니다. 이제 챔버에서 이미징을 시작할 준비가 되었습니다.stead 현미경의 모든 필요한 하드웨어 모듈을 켭니다. 이미지 분석 소프트웨어를 시작하고 resonant scanning 및 stead 모듈을 모두 활성화합니다. 이 선택을 마친 후, 소프트웨어가 초기화될 때까지 약 3분에서 5분 정도 기다립니다.화면 상단의 configuration 탭을 클릭하고 laser config를 선택하십시오. 그런 다음 백색광과 592 nm 레이저를 켭니다. 100x 대물렌즈를 선택하고 여기 레이저 빔을 592 nm 고갈 레이저와 정렬하십시오.레이저 설정 모듈을 선택하고, 592 depletion 레이저를 끈 다음 660 nanometer depletion 레이저를 켭니다. 슬라이드를 렌즈 위의 스테이지에 놓습니다. 백색광 램프와 접안렌즈를 사용하여 표시된 bilayer 영역에 결합된 세포의 초점을 맞춥니다.그 후 구성 탭 바로 오른쪽에 있는 획득(acquisition) 탭으로 돌아갑니다. 백색광(white light) 탭의 스위치를 클릭하여 해당 모듈을 켠 다음, 여기 자극 레이저 라인을 적절한 파장으로 드래그하십시오. 원하는 검출기를 선택하고 검출 범위를 설정한 후, 왼쪽 획득 툴바에 있는 순차적(sequential) 버튼을 클릭하여 왼쪽 툴바 하단에 순차적 스캔 대화 상자를 띄웁니다.이를 통해 사용자는 서로 다른 색상을 위해 각각 다른 여기 빔(excitation beam)을 갖는 여러 시퀀스를 추가할 수 있습니다. 프레임 사이를 클릭한 다음, 추가하려는 각 색상에 대해 여기 주파수 검출기와 검출 범위를 설정하십시오. 모든 설정이 최적화되면 시작을 눌러 획득 프로세스를 시작하십시오.유리 지지 평면 지질 이중층 상의 NK 세포 시냅스를 촬영한 3색 STEAD 이미지는 빨간색으로 표시된 anti CD 16 항체가 지질 이중층에 축적되어 F actin 형성을 유발하며, 파란색으로 표시된 퍼포린이 국소 패널의 F actin 망을 통해 편극화 및 침투하는 모습을 보여줍니다. 이러한 결합된 접근 방식을 통해 유리 지지 지질 이중층 내의 형광 표지된 anti CD 16 마이크로 클러스터를 명확하게 관찰할 수 있으며, 이는 NK 세포 상의 CD 16 클러스터링을 직접적으로 반영합니다. 기존의 공초점 이미지와 비교했을 때, STEAD 이미지에서는 주변 형광이 제거되었기 때문에 CD 16 중앙 클러스터의 고리 구조를 더 쉽게 식별할 수 있습니다.또한, 액틴 세포골격의 초미세 구조가 상당히 개선된 해상도로 관찰됩니다. 이전의 관찰 결과와 일치하게, perin 양성 용해 과립은 F actin 밀도가 낮은 영역 위에 위치한 것으로 확인됩니다. 이는 공초점 이미지에서는 대부분 소실되는 중요한 세부 사항으로, STEAD 이미지에서 확인할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행할 경우 전체 과정을 약 4시간 내에 완료할 수 있습니다.아르곤으로 산소를 반복적으로 치환하여 샘플의 탈산소 상태를 유지하고, 커버 슬립을 샘플 위에 빠르게 덮은 후 케이싱 용액에 침전시켜 챔버를 조립함으로써 샘플의 탈산소 상태를 유지하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

이 비디오에서는 살아있는 T 세포와 항원 제시 세포 간의 상호 작용을 시각화하기 위한 격자 광시트 현미경 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 초박형 격자 광시트를 상호 작용하는 세포 쌍에 집중시켜 일련의 2차원 이미지를 얻고, 이를 결합하여 세포-세포 상호 작용의 시공간 역학을 나타내는 고해상도 4차원 이미지를 얻는 것을 포함합니다.

살아있는 세포에서 수용체-리간드 상호작용을 시각화하기 위한 Lattice Light Sheet 현미경 검사

이 비디오는 지원되는 지질 이중층(SLB)에서 자연살해(NK) 세포의 면역학적 시냅스 형성을 시각화하는 기술을 보여줍니다. SLB는 먼저 형광단 표지된 NK 세포 활성화 수용체 리간드로 표지된 다음 NK 세포로 배양합니다. 그 후, 세포는 중합된 액틴 및 퍼포린 양성 용해 과립을 위해 염색됩니다. 이 접근 방식을 사용하면 STED(Stimulated Emission Depletion) 현미경을 사용하여 시냅스 형성을 시각화할 수 있습니다.

지원되는 지질 이중층에서 NK 세포 면역학적 시냅스 형성의 초고해상도 이미징

이 비디오는 일차 인간 T 세포와 지지된 지질 이중층(SLB) 사이의 면역 시냅스 형성을 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. T 세포 표면 단백질은 SLB에 고정된 각 리간드와 상호 작용하여 면역 시냅스를 형성한 다음, lytic granule이 시냅스를 향해 이동하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

지원되는 평면 지질 이중층과의 T 세포 상호 작용을 연구하기 위한 In Vitro 기술

여기에서 우리는 두 가지 색상 STED의 nanoscopy에 의해 유리에 효과적으로 요약 NK 세포의 세포 독성 면역 시냅스 이미징을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 우리는 시냅스 단백질과 세포 골격의 하위 100 nm의 분해능을 얻을 수 있습니다.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

적응 면역은 T 세포와 항원 제시 세포 사이에 형성된 역동적인 '면역학적 시냅스'에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜은 연구가 부족한 생리학적 APC이자 새로운 유형의 '평면 세포 APC 모델'로서 내피 세포를 조사하는 방법을 설명합니다.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

프로토콜 평면 지질 bilayers를 사용 하 여 시 냅 스 인터페이스를 형성 하는 기본 polyclonal 인간 T 세포의 기능을 연구 하는 기법을 설명 합니다. 우리 림프절과 주변 혈액에서 파생 하는 인간의 기본 T 세포의 차별 시 냅 스 형성 기능을이 기법을 사용 합니다.

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

이러한 프로토콜은 면역학적 시냅스 형성및 면역학적 시냅스를 향한 후속 편광 분비 트래픽을 모두 이미지화한다. 세포 접합체는 초항원 펄스 라지 세포 (항원 제시 세포역할을 함)와 Jurkat 클론 (이펙터 도우미 T 림프구로 작용)사이에 형성되었습니다.

인간 면역학적 시냅스 이미징

학습하세요 STED 현미경을 이용하여 유리 지지 평면 지질 이중층에서 NK 세포 면역 시냅스의 초고해상도 이미징 방법을. 이 기술은 면역학 연구자들이 세포 수준에서 면역 반응을 상세히 관찰할 수 있게 합니다.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

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