Name: 형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 학습하세요 TALEN을 이용한 AAVS1 안전항자리 유전자편집으로 GFP를 표적 삽입하는 인간 iPSC 클론 분리법을. 누클레오펙션, 푸로마이신 선택, 형광현미경 검증을 통해 안정적인 형질전환 세포주를 확립할 수 있습니다.

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이 연구는 국립 관절염, 근골격계 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases)의 NIH Common Fund and Intramural Research Program의 지원을 받았습니다.

1. 지하실 막 매트릭스의 준비 및 plasticware에의 코팅 <ol><li> 얼음에 -20 ° C에서 냉동 기저막 매트릭스 스톡을 넣고 4 ℃에서 밤새 해동. </li><li> 해동 후, 미리 차게 에펜 도르프 튜브에 기저막 매트릭스의 피펫 2 mg을 분취. 필요할 때까지 -20 ° C에서 이러한 보관하십시오. </li><li> , 기저막 매트릭스 코팅 된 플레이트를 준비 에펜 도르프 튜브 사라 얼음의 마지막 조각 (보통 2 ~ 내 시간)까지 얼음에 하나 나누어 해동합니다. </li><li> 해동 후, 기저막 매트릭스 코팅 용액을 차가운 (5 ° C) DMEM / F12 12 ml의 기저막 매트릭스를 추가한다. </li><li> 적절한 배양 용기에 기저막 매트릭스 솔루션을 추가한다. 6 잘 플레이트를 들어, 잘 당 1 ml의 분배. 기저막 매트릭스 솔루션은 완전하게 잘 다루고 있는지 확인하기 위해 판을 소용돌이. </li><li> 파라 필름은 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시를 밀봉하고, 루 부화사용하기 전에 1 시간 동안 m 온도. 또한, 매장 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 4 ° C에서 요리와 코팅 2 주 이내에 사용한다. 참고 : 건조를 방지하기 위해 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시에 추가 DMEM / F12를 추가합니다. 39 ° C 보관 기저막 매트릭스 - 코팅판 / 접시를 사용하기 전에 생물학적 안전 캐비넷에 배치하고 적어도 30 분 동안 실온에 올 수있다. </li><li> 완전 배지 및 세포의 첨가 이전 대기음 기저막 매트릭스. </li></ol> E8 매체의 제조 2 <ol><li> 4 ℃에서 하룻밤 E8 보충을 해동하여 E8 문화 매체를 준비합니다. </li><li> 500 ml의 재고에서 E8 기초 10 ml의 배지를 제거하고 폐기합니다. </li><li> 직접 E8 기초 배지 490 ml의에 E8 보충의 전체 10 ml의 유리 병을 피펫. 반복 온도 변동 공단에서 bFGF에 저하 될 수로서, 37 ° C 물욕없는 따뜻한 완전한 E8 매체를 수행TE E8 매체. </li><li> 보충 또한 2 주 이내에 완료 E8 매체를 사용합니다. </li></ol> iPSCs 3. 해동 <ol><li> 드라이 아이스에 액체 질소와 장소에서 냉동 iPSCs의 병을 제거합니다. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 유리 병을 해동; 얼음 유적의 아주 작은 조각까지 수조의 유리 병을 소용돌이 친다. </li><li> 생물 안전 캐비닛에 70 % 에탄올 및 전송을 유리 병 스프레이. </li><li> 직접 유리 병에 실온 E8 매체 적가의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 2 ㎖를 피펫을 사용하여, 15ml의 원뿔형 튜브에 E8 배지 9 ㎖ 중에 세포 현탁액을 적가 옮긴다. 세포와 매체가 신속하게 잘 혼합되도록 자주 튜브를 소용돌이. </li><li> 5 분 동안 200 XG에 세포를 원심 분리기. </li><li> 상등액을 흡인하고, 10 μM Y-27632로 보충 E8의 적절한 부피 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 지하의 적절한 숫자로 셀을 추가 membran하룻밤 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 전자 매트릭스 코팅 우물과 장소. 그것은 해동 후 신속한 복구를 가능하게하는 6 웰 플레이트의 웰 당 최소 0.2 × 10 6 IPSC을 도금하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 유지 보수 및 i​​PSCs의 일상과 Passaging <ol><li> 매일 E8 매체를 새로 고칩니다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 형태와 세포의 포화 상태를 모니터링합니다. 높은 품질의 iPSCs는 별개의 테두리 평면 식민지에서 성장; 개별 식민지는 &quot;조약돌 같은&quot;모양을 가지고있다. </li><li> 통로 iPSCs 세포들은 70 % ~ 포화 상태에 도달 할 때. </li><li> 0.9 g의 NaCl 500 ML의 DPBS에 500 ㎕의 0.5 M EDTA를 추가하여 EDTA의 계대 솔루션을 준비합니다. NaCl을 살균하고, 진공 필터를 용해 잘 섞는다. 계대 이전에 37 ° C의 물을 용기에 계대 용액의 분취 량을 따뜻하게. </li><li> 통로, 기음 문화 매체를 소비하고 따뜻한 싶어서 같은 부피로 한 번 세포를 씻어솔루션을 징. 코트에 대기음, 피펫 충분히 EDTA 계대 솔루션 세포 (6 웰 플레이트의 웰 당 1 mL)를 첨가 하였다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 세포를 놓고 IPSC 식민지를 관찰합니다. 자란 콜로니 테두리 내의 구멍의 모양은 2 내지 5 분 이내에 분명해질 것이다. </li><li> 조심스럽게 EDTA의 계대 솔루션을 대기음. </li><li> 직접 잘 계대 할 각에 고압 (6 웰 플레이트를 사용하는 경우) 10ml를 피펫을 사용하여, E8 매체의 4 ml의 분배. </li><li> IPSC 덩어리를 수집하고, 1 ~ 분할 비에 따라 웰의 적절한 개수로 분할 : 1:12 8. 오버 피펫으로 세포 덩어리의 세분화는 가난한 생존 발생합니다하지 마십시오. </li><li> 인큐베이터에서 플레이트를 배치하고, 세포를 분산시키는 전후 및 좌우로 수회 플레이트 바위. </li></ol> Tansfection에 대한 MEFs에와 iPSCs 5. 준비 <ol><li> transfectio하기 48 시간 전에N, 통로 iPSCs는 ~ 1 : 지하실 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트의 네 개 이상의 우물에 6 그들은 이일 때문에 70 % 융합 될 수 있도록. </li><li> 다음 날, 10 % FBS 및 1X MEM-NEAA 보충 DMEM (높은 포도당)로 구성된 MEF 매체에 DR4 MEFs에 해동. </li><li> ~ 2 × 104 세포 / cm 2에서 2 개의 10-cm 요리에 플레이트 DR4 MEFs에와 하룻밤에 37 ° C를 품어. </li><li> 형질의 날, 30 분 iPSCs에 형질 전환을 수행하기 전에 10 μM Y-27632 보충 E8에 MEF 매체를 변경합니다. </li><li> 옵션 : iPSCs 후 형질의 유세포 분석이 필요한 경우, 실온에서 기저막 매트릭스 코팅 4 ° C 접시와 장소를 제거합니다. </li><li> 선택적 : 4 시간에 형질 감염 전 10 μM의 최종 농도 Y-27632 미리 형질 IPSC 배양을 보충. </li></ol> 6. 부드러운 세포 해리 시약 처리차 형질은 iPSCs의 일렉트로 시스템을 사용하여 <ol><li> 4 ° C에서 P3 일차 전지 형질 솔루션을 꺼내 ~ 실온에 30 분을 제공 할 수 있습니다. 사용하기 전에 형질 전환 솔루션으로 전체 100 μL 보충제를 추가합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 부드러운 세포 분리 시약. </li><li> AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 및 PZT-AAVS1-R1) -20 ° C에서와 AAVS1 - CAG-EGFP 기증자를 구합니다. </li><li> 인큐베이터에서 iPSCs를 제거하고 DPBS 한 번 씻는다. </li><li> 웰 당 부드러운 세포 해리 시약 1 mL를 넣고 5 분 동안 37 ° C에서 배양 한 iPSCs, 또는 세포의 50 % 초과가 배양 용기로부터 해리 될 때까지. </li><li> 위로 배양 용기에 남아있는 모든 세포를 해리하고, IP​​SC 덩어리를 깨고 P1000 피펫을 사용하여 몇 번 아래로 세포를 피펫. </li><li> 푸르트에 10 ml의 피펫을 사용하여 각 웰에 E8 매체의 2 mL를 넣고 피펫 위아래로 여러 번어 하나의 세포로 세포 덩어리들을 분해 주 : 세포 덩어리가 충분히 세분화하지 않다면 형질 효율이 크게 감소한다. </li><li> 3 분 100 XG에 15 ML 원뿔 관에서 iPSCs, 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> E8 매체의 최소량 대기음 상등액과 세포를 재현 탁. </li><li> 중요한 얼룩과 같은 0.4 % 트리 판 블루의 신청 후 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. ( &quot;덩어리&quot;1-3 셀)을 계산하는 동안 세포가 충분히 해리되어 있는지 확인합니다. </li><li> 두 15 ML 원뿔 튜브에 각각 3 × 10 6 세포를 분배하고, 3 분 동안 100 XG에서 다시 스핀 다운. 주 : 저속 원심 분리 세포 스트레스를 줄이고 전기 전에 iPSCs 쉽게 재 현탁한다. </li><li> 인간 배아 줄기 세포주 H9 (프로그램 CB-150)에 대한 세포 형 특정 프로그램에 전기 천공 시스템을 설정한다. </li><li> 원심 분리 후, CEL에서 뜨는을 대기음L 펠렛. 한 펠렛, 제어 샘플로 HR 기증자의 10 μg의를 추가합니다. 다른 펠렛의 5 μg의와 함께 HR 기증자의 10 μg의를 추가, 각 실험 시료로 TALEN (PZT-AAVS1-L1 및 PZT-AAVS1-R1). </li><li> P3 일차 세포 형질 감염 용액 100 ㎕ 각각의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 큐벳에 옮긴다. </li><li> 형질 전환을 수행하고 즉시 각 큐벳에 실온 E8 매체의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 단계 5.4에서 준비 DR4의 MEFs에를 포함 한 10 cm 접시에 형질 전환 iPSCs 적하을 전송합니다. </li><li> 옵션 : 형질 전환 효율의 anaylsis 유동 세포 계측법이 필요한 경우 기저막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트 잘 하나에 각 실험에서 몇 방울을 추가합니다. </li><li> 반복은 모두 샘플을 완료 6.15-6.17 단계를 반복합니다. 다음 날, DPBS로 세포를 두 번 씻어 E8보다 피더에 더 IPSC 문화를 지원하기 위해 나타납니다 NutriStem에 문화 매체를 전환합니다. </li><li> TR48 시간 포스트 형질 72에서 ansient EGFP 발현 피크; 원하는 형질 전환 효율을 평가. </li></ol> 표적으로 iPSCs 7. 퓨로 마이신 선택 <ol><li> iPSCs는 70 % 포화 상태에 도달하면 퓨로 마이신 선택을 형질 전환 후 72 시간을 시작합니다. </li><li> NCRM5 iPSCs를 들어, NutriStem 배양 배지로 희석하여 0.5 ㎍ / ㎖의 퓨로 마이신 (1/2 전체 용량)에서 퓨로 마이신 선택을 시작합니다. 최적의 퓨로 마이신 농도는 0.25에서 일부 IPSC 라인 1 ㎍ / MLL에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 매일 매체를 새로 고침 3 일간 NutriStem + 0.5 ㎍ / ㎖의 퓨로 마이신의 문화 iPSCs. </li><li> 삼일 후, 1 ㎍ / ml의 퓨로 마이신의 농도를 증가시킨다. </li><li> / ㎖의 퓨로 마이신 선택 1 μg의 아래 문화 iPSCs 다른 7~8일에 대한, 또는 때까지 별개의 식민지는 식민지 따기위한 충분 나타납니다. </li></ol> 8. 식민지 따기 및 대상 iPSCs의 확장 <ol><li> 사용 기저막코팅하는 매트릭스로 각 웰 (12 ㎖의 DMEM / F12에 희석이 MG 기저막 매트릭스) 기저막 매트릭스 코팅 용액 50 μL를 분배하여 96- 웰 플레이트. 4 ° C에서 하룻밤 사용하기 전에 판을 보관하십시오. </li><li> 기저막 기질 - 코팅 플레이트를 실온으로 온시킨 후, 기저막 매트릭스 대기음 10 μM Y-27632를 각 웰에 100 ㎕를 첨가하여 분배 E8. </li><li> 생물 안전 캐비닛에 거꾸로 현미경을 배치하고 소독 70 % EtOH로 가볍게 스프레이. </li><li> 끝에 작은 &quot;훅&quot;가 이상적인 식민지 따기 도구를 얻기 위해 분젠 버너 위에 유리 파스퇴르 피펫을 당깁니다. 70 % EtOH로 소독하고 건조 후드에 배치합니다. </li><li> 인큐베이터에서 대상 IPSC 식민지를 포함하는 요리를 제거하고 현미경으로 후드에 배치합니다. </li><li> 식민지 따기 도구를 사용하여 식민지 국경 주위에 원을 추적하여 iPSCs를 선택합니다.</li><li> 부드럽게 긁어 판의 표면에서 IPSC 식민지를 제거 식민지 따기 도구의 &quot;훅&quot;를 사용합니다. 큰 콜로니를 들어, 콜로니 재 도금 후 세포 성장을 용이하게 분기에 콜로니 피킹 도구 X 드로잉. </li><li> 세포 덩어리가 분리 자유롭게 떠되면, iPSCs를 수집 ~ 30 μl를 설정 P200의 피펫을 사용합니다. 직접 96 웰 플레이트에 플레이트 세포. </li><li> 옵션 : 다음 37 ℃에서 5 분 동안 소화 50 μL 부드러운 세포 분리 시약을 추가, 에펜 도르프 튜브에 iPSCs를 수집 ~ 5 μL로 설정 P20 피펫을 사용합니다. 소화 후, 부드러운 세포 해리 시약 희석시키고 5 분 동안 표준 테이블 탑 마이크로 원심 200 XG에서 세포를 스핀 다운 에펜 도르프 튜브에 500 μL E8 배지를 추가한다. 그런 매체의 대부분을 대기음 ~ 재현 탁하고 96 웰 플레이트에 세포를 전달하는 30 μl를 떠난다. 참고 :이방법은 세포 덩어리와 촬상 콜로니의 빠른 팽창 해리를 촉진 할 것이다. </li><li> IPSC 식민지 충분한 수의 수집 될 때까지 식민지 따기 계속 (약 실험 당 20 ~ 30 식민지 권장). </li><li> 식민지 따기 후, 하룻밤 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 배치합니다. 전체 E8 매체 다음날, 문화 ~ 70 %까지 합류로 새로 고칩니다. </li><li> 로 96 웰에서 통과 세포를 24- 웰, 다음에 6 자, 단계 4.5-4.10에 설명 된대로. 주 : 6- 웰 플레이트 웰보다도 작은 사용시 EDTA 용액 및 E8 매체의 볼륨이 감소 될 비례한다. </li><li> 무작위로 삽입 된 벡터 (16)의 타겟 카세트 통합 및 부재를 확인하기 위해 접합 PCR 남부 오 점 분석에 의해 표적으로 성공을 평가합니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

(1) 효율적으로 형질 전환에 의해 iPSCs에 TALEN 및 기증자 플라스미드를 전달; AAVS1 안전 항구의 성공적인 세대를위한 가장 중요한 단계는 인간의 iPSCs가되는 대상 (2) 형질 전환 후 형질 전환 및 도금 밀도 전에 단일 세포로 iPSCs의 분리를 최적화; (3) 투여 량 및 IPSC 라인의 성장에 기초한 약물 - 선택 시간을 최적화; (4)주의 깊게 해부 및 대상 식민지를 따기와 / 웰 새 접시에 전송. Hockemeyer의 용지 (10)에 사용 된 유사한 방법에 비해,이 프로토콜에서 사용 iPSCs의 수를 줄이는 데 도움이 오픈 소스 AAVS1-TALENs 쌍 상이한 IPSC 해리 시약과, TALENs 및 도너 벡터를 제공하는 다른 형질 전환 장치를 사용 실험 높은 형질 전환을 달성하고 효율성을 대상으로한다. 인간 iPSCs에서 고효율 유전자 편집을 달성하기 위해, 제 EDI 유전자의 전달을 최적화하기 위해 필수적급성 세포 사멸에게 전달...

배아 줄기 세포와 유사한 유도 만능 줄기 세포로 (iPSCs)를 인간의 체세포를 재 프로그램 할 수있는 기능이 처음 다카하시 등에 의해 발견되었다. 2007 1. 레트로 바이러스는 네 개의 전사 인자를 발현하는 형질 도입 인간 피부 섬유 아세포 (소위 불리는 야마나카는 OCT3 요인 / 4, SOX2, C-Myc와, 그리고 Klf4)는 형태, 증식, 유전자 발현 및 후생 유전 학적 상태에 따라 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기)에 매우 유사한 것으로 나타났다; 결정적 iPSCs 또한 모든 세 배엽 (1)의 세포로 분화 할 수있다. iPSCs의 증식 잠재력과 차별화 용량은 그들에게 매우 매력적인 도구를 만드는; 특정 질병을 앓고있는 환자로부터 세포를 재 프로그래밍함으로써 iPSCs 체외 질병 모델 시스템과 같은 잠재적 치료제로서 모두 사용될 수있다. 후자의 목적을 위해, 몇 가지 문제 iPSCs의 잠재력하기 전에 해결해야임상 환경에서 실현 될 수있다; 시험 관내 배양 된 인간 배아 줄기 및 iPSCs, 리 프로그래밍 및 세포 유지하는 동안 이종 유도체의 사용의 발암 가능성, 및 생체 내에서 이식 된 세포를 추적 할 필요성은 Hentze 외 의해 검토 다 능성 줄기 세포의 임상 적용 (모든 중요한 장애물이다. 2). 분화 된 세포를 이식 후 추적의 필요성에 이상적인 솔루션에 관계없이 응용 프로그램의 침묵과 잡색 레지스트 시각적으로 검출 마커를 포함한다. 외래 DNA가 안전한 항구 궤적에 도입 될 때 통합 된 유전자의 강력하고 지속적인 표현은 가장 쉽게 달성 할 수있다; 즉, 통합 벡터의 충분한 전사를 활성화 이웃 게놈 부위에서 유전자 발현의 3 교란을 완화하는 동시에. 아주 잘 그것의 발견 이후 특징으로 한 그러한 사이트는 아데노 관련 바이러스 integr입니다단백질 인산 가수 분해 효소 (1) 규제 서브 유닛 12C (PPP1R12C) 유전자의 첫 번째 인트론에 ATION 사이트 1 (AAVS1). 이 궤적 유지 및 연장 시간을 통해 통합 된 유전자의 강력한 표현 문화의 체외 분화 3뿐만 아니라, 전사 섭 4에서 유전자를 둘러싼 보호하기 위해 허용 할뿐만 아니라 보였다; 두 기능으로 인해 AAVS1 사이트 (5)의 측면에 내인성 염색질 절연체 요소의 존재에 의한 것으로 생각된다. 방금 지난 10 년간 게놈 엔지니어링 툴의 발전은 크게 임의의 세포 유형의 유전 조작이 달성 될 수있는 용이성 및 효율성을 촉진 하였다. 초기의 성공적인 실험는 ESC -6,7- 타겟팅 유전자를 달성하기 위해 도입 된 도너 내인성 상동 재조합 (HR)의 상당히 낮은 수준에 의존하지만, 예컨대 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 유의 사항과 부위 - 특이 적 뉴 클레아 제의 사용ficantly 같은 실험 8,9의 효율성을 크게 증가 이중 가닥 DNA 휴식의 생성을 통해 상동 재조합을 유도한다. 모두 전사 활성제와 같은 이펙터 식물 병원성 크 산토 모나스 장군의 (이야기)와 원핵 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) 효율적인 사이트 별 디자이너 클레아 제에 / Cas9 시스템의 용도 변경은 만능 줄기 세포에서 표적 유전자를했다 접근 실행 가능한 방법론 10-13. 최근의 논문은 이야기 클레아 제 (TALENs) (14)를 사용하여 인간 iPSCs의 AAVS1 안전 항구의 궤적에 녹색 형광 기자 카세트의 안정적 통합을위한 효율적인 방법을 설명했다. 이러한 목표 iPSCs는의 유용성에 대한 강력한 증거를 제공, 심지어 심근 경색 (MI)의 마우스 모델로 심근 세포 이식에 관한 분화 후 자신의 형광을 유지안정적으로 형광 만능 줄기 세포 (14). 타겟팅 콜로니를 수득하기 위해, 유전자 트랩 방법 플라이 싱 - 억 셉터 (SA)는, 2A 자체 절단 단백질 서열은 내인성 PPP1R12C 프로모터의 제어 하에서 퓨로 마이신 N- 아세틸 전이 효소 (PAC) 유전자를 배치 상기 사용 하였다; 따라서, AAVS1 유전자좌 DNA 공여체를 도입 한 경우에만 iPSCs는 퓨로 마이신 내성에 기초하여 선택 가능하게 이들을 렌더링 PAC 표현; (그림 1, 15). 이 프로토콜에 기반 iPSCs를 AAVS1-GFP iPSCs가 TALENs와 iPSCs를 형질 감염의 과정과 AAVS1 안전 항구의 궤적에 4.2kb DNA 단편을 통합 할 수있는 9.8 킬로바이트 기증자를 포함, 최근 종이 (14)에보고 생성 선택하는 절차의 자세한 사항 퓨로 마이신 저항 및 클론 확장을위한 따기 식민지. 본원에 설명 된 기술들은 많은 유전체 공학 실험에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>-20°C에서 보관.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Store at 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear TC 처리 다중 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>기저 매체를 4 °C에 저장하고 보충제를 -20 °C에 저장합니다.</td></tr><tr><td>Y-27632 이염산염</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>실온에서 보관하십시오. H2O에 용해되면 -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>울트라퓨어 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated Culture Dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - Academic</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>액체 질소에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>4 &deg;C에 저장.</td></tr><tr><td>정의된 소 태아 혈청, 미국 원산지</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>-20에서 보관 &deg;C. 4에서 해동 &deg; C 하룻밤 및 분취. 부분 표본을 -20 &deg에 저장하십시오. C는 필요할 때까지.</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>4 &deg;C에 저장.</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector 코어 유닛&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>는 전기천공법 시스템</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X 유닛의 일부입니다&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>전기천공법 시스템의 일부</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>도착 시 Primary Cell Solution을 제거하고 보충하고 4°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 세포 해리 시약</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>-20 &deg;C에서 보관.4&deg에서 밤새 해동; C 및 37 &deg에서 부분 표본을 따뜻하게하십시오. C 사용 전 수조.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF 배양 배지</td><td>줄기</td><td>01-0005</td><td>-20에서 보관 &deg;C. 4에서 하룻밤 해동 &deg; C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 및 pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 및 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Store at -20 &deg;C. ddH2O에서 1mg/ml의 작업 분취액을 준비합니다.</td></tr><tr><td>일회용 보로실리케이트 유리 파스퇴르 피펫</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (냉장), 120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 &times; 750 ml 스윙 버킷 로터</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 aavs1 세이프 하버 (safe harbor)에 gfp 유전자 talen는 타겟팅

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

targeted transgene addition은 바이러스 벡터 매개 무작위 통합으로 인한 유전자 침묵 및 삽입 돌연변이 유발을 우회하면서 지속적인 유전자 발현을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 검증된 오픈 소스 TALEN과 유전자 트랩과 같은 공여체를 활용하여 이식유전자를 세이프 하버 유전자 자리로 전달하는 것을 기반으로 인간 iPSC에서 보편적이고 효율적인 이식유전자 표적 추가 플랫폼을 설명합니다. 중요한 것은 효과적인 유전자 편집이 유전자 편집 벡터의 전달 효율성에 의해 속도가 제한된다는 것입니다. 따라서 이 프로토콜은 먼저 높은 핵 전달 효율을 달성하기 위해 transfection을 위한 iPSC를 준비하는 데 중점을 둡니다. 부드러운 세포 해리 시약을 사용하여 iPSC를 단일 세포로 해리하고 최적화된 프로그램을 사용하여 transfection하면 >50%의 세포가 큰 유전자 편집 벡터를 흡수하도록 유도할 수 있습니다. AAVS1 자리는 활성 유전자(PPP1R12C)의 인트론에 위치하기 때문에 스플라이싱 수용체(SA) 연계 퓨로마이신 저항성 유전자(PAC)를 사용하여 무작위 통합 전용 및 transfection되지 않은 세포를 제외하고 표적 iPSC를 선택했습니다. 이 전략은 표적 클론을 얻을 가능성을 크게 증가시키며 다른 활성 유전자 표적화 실험에도 사용할 수 있습니다. 특정 iPSC 라인에 맞게 조정된 용량에서 퓨로마이신을 선별한 지 2주 후, 클론은 크고 분리된 콜로니를 더 작은 조각으로 수동 해부하여 추가 확장 및 유전적 및 기능적 스크리닝을 위해 더 작은 웰에서 새로운 배지로 옮겨 선별할 준비가 됩니다. 이 프로토콜을 따라서 생체 내 및 체외 이미징 및 세포 분리에 유용한 여러 GFP 리포터 iPSC 라인을 쉽게 얻을 수 있습니다.

프로토콜의 시각화는 iPSCs가 NutriStem에 대한 하나 E8 녹색 또는 청색에 의해 강조 다른 배지에서 배양있는 기간으로, 그림 2에서 제공됩니다. 그것은 단지 고품질 iPSCs를 형질 것이 중요하다; 일상적인 유지 보수 전반에 걸쳐 배양 접시를 검토하고 IPSC 문화는 조약돌 모양의 형태를 베어링 주로 별개의 식민지 (그림 3A)가 들어 있는지 확인; 분화 세포는 배양의 10 % 이상을 점유 안된다. iPSCs의 Transfectability 인해 작은 크기로 전형적으로 달성 가능한 최대의 효율을 나타낸다 PMAX-GFP로 형질 감염 작은 PMAX-GFP 벡터 (도 4A-B)를 사용하여 평가 및 최적화된다. 예를 들어, 우리는 PMAX-GFP (도 4b)로 68.6 %의 형질 전환 효율을 달성 하였다. AAVS1 안전한 항구를 대상으로 지정하려면, iPSCs는 부드러운 단일 셀 해리 시약을 사용하여...

세이프 하버 AAVS1 유전자 자리에서 TALEN 매개 유전자 편집을 통해 인간 iPSC에서 고효율 전이유전자 추가가 가능합니다. 이 프로토콜은 TALEN 및 donor vector 전달을 위해 iPSC를 준비하고, iPSC를 transfection하고, iPSC 클론을 선택 및 분리하여 GFP 유전자의 표적 통합을 달성하여 리포터 라인을 생성하는 절차를 설명합니다.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

이 절차의 전반적인 목표는 GFP를 발현하는 단일 세이프 하버(safe harbor) 표적 유도 만능 줄기세포(iPSC) 클론의 단일 분리주 AA vs one을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 뉴클레오펙션(nucleofection)을 통해 AAVs one talons 및 A VS one C-A-G-E-G-F-P 공여체 플라스미드를 iPSC에 효율적으로 전달함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 마우스 배아 공급 세포(feeder cells) 상에서 퓨로마이신(puromycin)을 사용하여 A a vs one 표적 세포를 선별합니다.다음으로, GFP를 발현하는 개별 AAVS1 표적 클론들을 matrigel이 코팅된 96-well 플레이트로 분리하여 옮깁니다. 마지막 단계로, AAVS1 GFP-iPSC 클론들을 E8 배지와 표준 iPSC 배양 기술을 사용하여 증식시킵니다. 최종적으로, 면역형광 현미경 관찰과 유세포 분석을 통해 AAVS1 표적 인간 iPSC 클론에서 GFP가 균일하고 강력하게 발현됨을 확인합니다.이 방법의 시각적 시연은 매우 중요한데, 콜로니 피킹 단계에서 현미경 하에 특수 콜로니 피킹 도구를 사용하여 표적 클론을 미세 해부하는 과정이 포함되어 있어 일대일 교육으로는 학습하기 어렵기 때문입니다. 먼저 IPSC 배양물을 PBS로 각각 한 번씩 세척합니다. 그다음 각 웰에 37 °C의 gentle cell dissociation reagent 1 mL를 첨가하고, 세포의 50% 이상이 배양 용기에서 분리될 때까지 37 °C에서 약 5분 동안 세포를 배양합니다.P 1000 피펫을 사용하여 남아 있는 세포 덩어리나 부착된 세포를 기계적으로 분쇄합니다. 그런 다음 각 웰에 2 mL의 E8 배지를 첨가하고, 10 mL 피펫을 사용하여 배양물을 단일 세포 현탁액으로 더 세밀하게 분산시킵니다. 이제 수확한 세포를 15 mL 원심분리관에 모아 원심분리합니다.세포 수를 측정하기 위해 펠렛을 최소량의 E8 배지에 다시 현탁합니다. 그다음 트립판 블루 배제법으로 배양 세포의 생존력을 확인하고 충분히 해리되었음을 확인한 후, 300만 개의 세포를 두 개의 15 mL 원추형 튜브에 각각 옮깁니다. 세포를 원심 분리하는 동안 전기천공 시스템을 인간 배아 줄기세포주 H9 전용 프로그램으로 설정합니다. 그다음 대조군 샘플을 위해 한 쪽 펠렛에는 10 µg의 상동 재조합 공여체만을 첨가하고, 실험군 샘플을 위해서는 10 µg의 상동 재조합 공여체 플라스미드와 함께 각 Talen 플라스미드 5 µg씩을 첨가합니다.다음으로, 대조군과 실험군 펠릿 각각에 상온의 complete P three 일차 세포 형질전환 용액 100 µL를 첨가하고 세포를 재현탁합니다. 샘플을 개별 큐벳으로 옮긴 후 형질전환 직후에 전기 천공을 실시합니다. 각 큐벳에 상온의 E eight 배지 500 µL를 첨가한 다음, 형질전환된 iPSC 샘플을 DR four 마우스 배아 섬유아세포가 포함된 개별 10 cm 디시에 한 방울씩 옮깁니다. 콜로니를 피킹하기 전, 96-웰 플레이트의 각 웰에 basement membrane matrix 용액 50 µL를 코팅하고 다음 날 아침까지 4 °C에서 하룻밤 동안 플레이트를 보관합니다.플레이트가 실온에 도달하면, 과잉 용액을 흡입하여 제거하고 각 웰에 10 µM Y 2 7 6 3 2가 첨가된 E eight 배지 100 µL를 넣습니다. 다음으로, 도립 현미경을 생물 안전 작업대에 놓고 70% ethanol을 가볍게 분사하여 멸균합니다. 그 후, 70% ethanol로 멸균한 뒤 유리 파스퇴르 피펫을 분젠 버너 위에 올려 팁 끝에 작은 갈고리가 형성된 콜로니 피킹 도구를 만듭니다.후크를 후드 안에 넣어 건조시킨 후, 클론을 선택하기 위해 IPSE 배양물을 현미경 스테이지 위에 올립니다. 저배율에서 적절한 콜로니를 찾고 콜로니 피킹 툴을 사용하여 이를 추적하고 4등분합니다. 그런 다음 4등분된 콜로니를 배양 용기에서 조심스럽게 긁어내고, 약 30 µL로 설정된 P 200 피펫을 사용하여 자유롭게 부유하는 IPC를 수집하여 기저막 매트릭스 위에 세포를 직접 도말합니다.수확된 iPSC는 플레이팅 후 2~4시간 이내에 부착되어야 합니다. 마지막으로 선택한 콜로니를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양하고, 다음 날 아침에 완전 E8 배지로 세포를 교체해 줍니다. 실험 전 과정에서 고품질의 iPSC만을 트랜스펙션하는 것이 중요합니다.iPSC 배양물은 여기 보이는 세포들처럼 주로 조약돌 모양의 형태를 띤 뚜렷한 콜로니들로 구성되어야 하며, 분화된 세포는 배양물의 10%를 초과하지 않아야 합니다. PAX GFP 벡터는 크기가 작아 일반적으로 달성 가능한 최대 효율을 나타내므로, 이를 사용하여 iPSC의 형질전환 능력을 평가하고 최적화할 수 있습니다. A VS one C-A-G-E-G-F-P intel로 형질전환된 iPSC의 일시적 발현은 형질전환 후 48~72시간에 정점에 도달하며, 이는 형질전환된 세포의 일부를 유세포 분석기로 확인하여 검증할 수 있습니다. 형질전환 효율은 매우 다양하게 나타날 수 있습니다.A GFP 양성 분획의 비율이 10%인 실험에서도, 균일한 형광을 나타내는 개별 클론들은 pure mycin 선택 후 콜로니 피킹(colony picking)이 가능할 만큼 충분히 커야 합니다. 또한, 96-웰 포맷으로 확장된 표적 iPSC 클론들은 GFP의 안정적이고 균일한 발현을 보여야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 핵 transfection(nucleofection)을 통해 iPSC를 효율적으로 형질전환하는 방법과 AAV safe harbor를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.콜로니 피킹 도구를 사용하여 표적 IPSE 클론을 분리합니다.

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

유전자 변형의 최근 발전에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (HESCs)의 transfection은 변덕 과정 남아있다. 우리의 지식, 인간 유도 만능 줄기 세포를 (iPSCs) transfect하는 체계적이고 효율적인 방법은보고되지 않았습니다. 여기, 우리는 효율적으로 transfect과 인간 iPSCs를 nucleofect하는 강력한 프로토콜을 설명합니다.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 비디오는 TALEN을 사용하여 표적 자리에서 이중 가닥 절단을 생성하고 형광 단백질 유전자 통합을 위한 상동성 유도 복구를 유도하는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 정밀한 게놈 편집 기술을 설명합니다.

TALEN 매개 표적 유전자 통합: 형광 단백질 유전자를 hiPSC에 정밀하게 삽입하기 위해 엔지니어링된 염기서열 특이적 뉴클레아제 사용

우리는 렌티바이러스 기반의 재프로그래밍 및 특성화된 무인자 인간 유도 만능 줄기세포를 유도하고 추정되는 임상 등급 조건으로 전환하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

의 유도 및 특성 형질 전환 유전자가없는 인간 유도 다 능성 정의 임상 수준의 조건으로 세포주 및 변환 줄기

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

여기에서 우리는 이전에 설명한 시스템 개선 한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 AAVS1 궤적에 RMCE에 따라 신속하고 효율적인 유전자 편집 방법을보고합니다. 이 기술을 이용하여, 동질 라인 신속하고 안정적으로 형질 전환 hPSCs 매개 연구를 용이하게 적절한 비교 연구를 위해 생성 될 수있다.

에서 재조합 효소 중재 카세트 교환에 의해 재조합 인간 다 능성 줄기 세포의 신속하고 효율적인 생성<em&gt; AAVS1</em&gt; 로커스

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)의 체세포 돌연변이를 충실하게 모델링하는 새로운 전략은 조혈 줄기 세포 생물학 및 혈액 악성 종양을 더 잘 연구하는 데 필요합니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9의 사용과 이중 rAAV 공여체 형질도입을 결합하여 HSPC에서 이형접합체 기능 획득 돌연변이를 모델링하는 프로토콜이 설명됩니다.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

학습하세요 TALEN을 이용한 AAVS1 안전항자리 유전자편집으로 GFP를 표적 삽입하는 인간 iPSC 클론 분리법을. 누클레오펙션, 푸로마이신 선택, 형광현미경 검증을 통해 안정적인 형질전환 세포주를 확립할 수 있습니다.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

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