형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

이 절차의 전반적인 목표는 분리 AA 대 하나의 세이프 하버, 표적 유도성 만능 줄기 세포 또는 GFP를 발현하는 IPSC 클론을 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 AAV, 하나의 발톱 및 A 대 하나의 C-A-G-E-G-F-P 공여체 플라스미드를 핵 애정에 의해 IPC에 효율적으로 전달함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서, A a vs one 표적 세포는 마우스 배아 공급 세포에서 pur mycin에 의해 선택됩니다.

다음으로, A A VS one targeted clone을 발현하는 개별 GFP를 matrigel coated 96 well plate로 선택합니다. 마지막 단계에서, A A VS 1 G-F-P-I-P-S-C 클론은 E 8 배지 및 표준 IPSC 배양 기술로 확장됩니다. 궁극적으로, 면역형광 현미경 검사와 유세포 분석은 AA와 one targeted human IPSC clone에서 GFP의 균일하고 강력한 발현을 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법의 시각적 시연은 군집 채집 단계에는 현미경 아래에서 특수 군집 채집 도구를 사용하여 표적 클론의 미세 해부가 포함되기 때문에 매우 중요하며, 이는 나란히 지시하는 동안 배우기 어렵습니다. PBS로 IPSC 배양물을 각각 한 번씩 세척하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 완만한 세포 해리 시약 1ml를 각 웰에 첨가하고 세포의 50% 이상이 배양 용기에서 해리되었을 때 약 5분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

P 1000 피펫을 사용하여 남아 있는 세포 덩어리 또는 부착된 세포를 기계적으로 파괴합니다. 그런 다음 각 웰에 2ml의 E 8 배지를 추가하고 10ml 피펫을 사용하여 배양물을 단일 세포 현탁액으로 추가로 분해합니다. 이제 수확된 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 모으고 스핀다운합니다.

계수를 위해 펠릿을 최소량의 E 8 매체에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 트리안 블루 배제에 의한 배양물의 생존 가능성과 충분한 해리를 확인한 후, 원심분리 세포가 인간 배아 줄기 세포주 H 9에 대한 세포 유형 특이적 프로그램으로 전기천공법 시스템을 설정하는 동안 각각 300만 개의 세포를 두 개의 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮겼습니다. 그런 다음 대조군 샘플에 대해 1개의 펠릿에 10마이크로그램의 상동 재조합 공여자만 추가하고, 실험 샘플에 대해 각 탈론 플라스미드 5마이크로그램과 함께 10마이크로그램의 상동 재조합 공여자 플라스미드를 추가합니다.

다음으로, 100마이크로리터의 실온 완전 P 3차 세포 형질주입 용액을 대조군 및 실험용 펠릿 각각에 첨가하고 세포를 재현탁합니다. 샘플을 개별 큐벳에 옮긴 다음 transfection 직후 샘플을 먹었습니다. 각 Q 수의사에 500마이크로리터의 실온 E 8 배지를 첨가한 다음 형질주입된 IPSC 샘플을 DR 4개의 마우스 배아 섬유아세포가 들어 있는 개별 10cm 접시에 적가하여 군체를 선택하기 전에 96웰 플레이트와 50마이크로리터의 기저막 매트릭스 용액을 함께 티치한 다음 다음날 아침 섭씨 4도에서 밤새 플레이트를 보관합니다.

플레이트가 실온에 도달하면 초과 용액을 흡입하고 각 웰에 10 마이크로 몰 Y 2 7 6 3 2가 보충 된 100 마이크로 리터의 E 8 매체를 로드합니다. 다음으로, 도립 현미경을 생물 안전 캐비닛에 넣고 70% 에탄올의 가벼운 스프레이로 살균합니다. 그런 다음 분젠 버너 위에 유리 목초지 피펫을 놓고 70% 에탄올로 살균한 후 끝에 작은 고리가 있는 콜로니 피킹 도구를 만듭니다.

후드에 후크를 놓아 건조시킨 다음 IPSE 배양물을 현미경 스테이지에 올려 클론을 선택합니다. 낮은 배율에서 적절한 군체를 찾고 군집 채집 도구를 사용하여 추적하고 4등분합니다. 그런 다음 배양 용기에서 4등분된 콜로니를 부드럽게 긁어내고 약 30마이크로리터로 설정된 P 200 피펫을 사용하여 자유롭게 떠다니는 IPC를 수집하여 세포를 기저 멤브레인 매트릭스에 직접 도금합니다.

IPC는 수확할 때 도금 후 2-4시간 이내에 부착해야 합니다. 마지막으로, 선택한 콜로니를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고 다음 날 아침에 완전한 E 8 배지로 세포를 새로 고칩니다. 실험 전반에 걸쳐 고품질 I PSC만 transfection하는 것이 중요합니다.

IPSC 배양액은 여기에서 볼 수 있는 세포와 분화된 세포가 배양액의 10%를 넘지 않아야 하기 때문에 형태학적으로 조약돌과 같은 조약돌을 지닌 주로 별개의 콜로니를 포함해야 하며, PAX GFP를 사용한 transfection은 일반적으로 작은 크기로 인해 최대 달성 가능한 효율을 나타내므로 IPC의 transfection을 평가하고 최적화할 수 있습니다. A VS ONE C-A-G-E-G-F-P 정보 및 transfection된 IPC의 일시적 발현은 transfection 후 48-72시간에 최고조에 달하며, 이는 유세포분석으로 transfection된 세포의 작은 부분으로 확인할 수 있습니다. transfection 효율은 크게 달라질 수 있습니다.

A GFP 양성 분획을 사용한 실험에서도 10%에 불과하며, 균일한 형광을 나타내는 개별 클론은 순수한 마이신 선택 후 콜로니 피킹을 위해 충분히 커야 합니다. 또한, 일단 96, 웰 포맷에서 팽창된 표적 IPSC 클론은 GFP의 안정적이고 균일한 발현을 나타내야 한다. 이 비디오를 시청한 후에는 핵 애정에 의해 I PSC를 효율적으로 transfection하는 방법과 AV one safe harbor를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

콜로니 피킹 도구를 사용하여 IPSE 클론을 표적으로 삼았습니다.