비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

이 절차의 전반적인 목표는 비만 세포, 분비 과립 발달 및 세포작용을 조절하는 메커니즘을 연구하는 것입니다. 이는 첫 번째 요람 세포에 exocytosis에 대한 리포터 유전자와 관심 유전자를 transection함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 세포를 자극하고 외세포작용 중 리포터 유전자의 형광 신호를 모니터링하여 검사된 유전자가 세포외이입에 미치는 영향을 평가하는 것입니다.

다음으로, 테스트된 유전자가 비만세포 비서 과립 생성 및 발달에 미치는 영향을 비만 세포 비서 과립에 국한된 리포터 유전자의 컨포칼 이미징에 의해 평가합니다. 마지막 단계는 분비 과립의 morpho metric 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로 리포터 유전자를 이용한 비만 세포 분비 과립의 형광 표지는 비만 세포의 변화, 분비 과립 발달 및 이들의 엑소사이토시스(exocytosis)를 보여주는 데 사용됩니다.

내인성 매개체, 베타 하아제 또는 히스타민의 방출을 측정하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 exocytosis에 대한 리포터와 함께 유형 돌연변이 또는 S-H-R-N-A가 있는 동안 관심 유전자의 동시 발현을 기반으로 한다는 것입니다. 그런 다음 동시 발현을 통해 유전적으로 조작된 세포로부터의 분비를 독점적으로 모니터링할 수 있으므로 비만 세포의 낮은 transfect 능력으로 인해 내인성 매개체의 방출을 측정할 때 발생하는 높은 잡음 대 신호 비율 문제를 극복할 수 있으며, 이는 결과 해석을 방해합니다. 이 방법은 비만 세포의 세포 생물학 분야에서 칼고 선택, 과립 포장 및 엑소 세포 생성 능력을 포함하여 분비 과립 생성 과정을 제어하는 분자 메커니즘을 식별하는 것과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 또한 이 과정에서 kinases, phosphotase 및 기타 단백질 계열의 관여를 평가하여 exo cytosis를 조절하는 질량 세포의 과정을 제어하는 분자 메커니즘을 식별하는 데 도움이 됩니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 쥐 호염구성 백혈병 세포 및 배지를 준비하여 transfection을 수행합니다. 먼저, 진공 청소기에 연결된 멸균 목초지 피펫을 사용하여 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다.

세포 단층을 예열 트립신(prewarm trypsin)으로 헹굽니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 10분 이상 두지 마십시오. 그런 다음 광학 현미경을 사용하여 세포가 분리되었는지 확인합니다.

일단 분리되면, 배지를 배양 플레이트에 첨가하여 트립신 용액 부피의 최소 2배 부피로 세포를 현탁시킵니다. 세포 수를 계수 한 후, 혈구 분석기 펠릿을 사용하여 200G 및 섭씨 25 도에서 3 분 동안 원심 분리하여 1,500 만 개의 세포를 측정했습니다. SNAT를 버리고 280마이크로리터의 형질주입 배지를 추가합니다.

그런 다음 반응 혼합물을 4mm vete로 옮깁니다. n-p-y-m-r-f-p라고도 알려진 뉴로펩타이드 Y-M-R-F-P를 함유한 플라스미드 20마이크로그램과 대조군 30마이크로그램, 빈 플라스미드 또는 테스트된 플라스미드를 추가합니다. 반응 혼합물의 최종 부피는 300 마이크로 리터이어야합니다.

얼음 위에 10분 동안 놓은 후 수의사의 잔여 물을 닦아냅니다. 그런 다음 300볼트에서 9밀리초 동안 전기천공을 진행합니다. exocytosis를 측정하려면 300마이크로리터의 배지를 포함하는 24개의 웰 조직 배양 접시에서 세포를 즉시 재조정하십시오.

반응 혼합물 8 마이크로 리터를 각각에 첨가하십시오. 그런 다음 nont transfection된 세포를 대조군을 위해 추가 well에 추가합니다. 각 처리에 대해 중복 웰이 있을 수 있도록 충분한 웰을 준비하고, 타임 랩스 현미경 검사를 위한 모든 트랜스펙션에 대해 80마이크로리터의 배지를 포함하는 8웰 챔버 BO 규산염 커버 유리 시스템에서 세포를 즉시 재합성합니다.

각 챔버에 1.5마이크로리터의 반응 혼합물을 첨가하여 FC 엡실론 R one 매개 활성화를 위해 세포를 감작합니다. 밀리리터당 1마이크로그램의 마우스 DNP 특이적 단클론 IgE를 배지에 첨가합니다. 최소 2시간 동안 IgE가 있는 세포를 배양합니다.

18-24시간 후 형광 현미경을 사용하여 세포가 플라스미드를 발현하는지 확인합니다. MRFP의 여기 파장은 584나노미터이고 방출 파장은 607나노미터입니다. N-P-Y-M-R-F-P는 비서 과립에 해당하는 소포 구조에 나타나야 합니다.

N-P-Y-M-R-F-P exocytosis를 측정하려면 배양 배지를 제거합니다. 24 웰 플레이트에서 티로 버퍼로 세 번 세척했습니다. control well에 200마이크로리터의 tyro buffer를 추가하여 자극되지 않은 세포를 준비합니다.

그런 다음 활성화 시약, 희석된 티로 완충액을 첨가한 후 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 각 웰의 S 상등액을 96웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 접시를 얼음 위에 놓고 빛으로부터 보호하십시오.

S 상등액에는 세포에서 방출된 키메라 펩타이드 N-P-Y-M-R-F-P가 포함되어 있습니다. 다음으로, 0.5%Triton X 100을 함유한 tyro buffer 200마이크로리터를 각 웰에 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 이 단계는 세포에서 방출되지 않은 나머지 N-P-Y-M-R-F-P를 포함하는 세포 용해물을 준비하는 데 중요합니다.

세포 용해물을 모아 얼음 위에 놓기 전에 96웰 플레이트로 옮깁니다. 빛이 없는 경우 590 나노미터, 20 나노미터 대역폭 여기 필터 및 635 나노미터가 있는 형광 플레이트 리더를 사용하여 세포 상등액 및 세포 용해물의 형광을 측정합니다. 35나노미터 대역폭 방출 필터는 8개의 챔버가 있는 BO 규산염 커버 유리 시스템에 1.5마이크로리터의 형질 주입된 세포를 시딩합니다.

섭씨 37도의 인큐베이터에서 18-24시간 동안 세포를 배양합니다. 챔버에서 배양 배지를 제거하고 갑상선 완충액으로 3회 세척합니다. 그런 다음 각 챔버에 72마이크로리터의 갑상선 완충액을 추가합니다.

가열된 챔버 이산화탄소 컨트롤러와 40 x 또는 63 x 대물렌즈가 장착된 컨포칼 형광 현미경을 사용합니다. 수은 램프, 컴퓨터 및 레이저를 포함한 현미경 시스템을 켭니다. 가열된 챔버가 적절한 온도에 있는지 확인하십시오.

실험을 시작하기 전에 8웰 챔버 보어 실리케이트 커버 유리 시스템을 가열된 챔버에 놓고 챔버가 올바르게 설치되고 안정적인지 확인하십시오. 관련 floor four에 따라 형광을 켜고 형질 주입된 세포를 시각화하고, 관심 세포가 현장에 있으면 형광을 끕니다. 표백 및 세포 독성을 최소화하기 위해 이 장에는 약 2-3개의 형질 주입된 세포가 포함되어 잘 퍼져 있지만 서로 접촉하지 않도록 해야 합니다.

이 경우, 세포는 리포터 유전자, N-P-Y-M-R-F-P 및 A GFP 태그가 지정된 구성적으로 활성화된 RAB 5 돌연변이체로 간이 침대에 형질주입됩니다. 노이즈 및 과포화 및 독성을 최소화하도록 레이저 출력을 조정하고 게인과 오프셋을 설정하여 신호 대 노이즈 비율을 수정합니다. 레이저 노출 시간을 최소화하기 위해 빠르게 스캔합니다.

다음으로, Zack에 대한 매개변수를 설정하여 이미지를 3차원으로 재구성합니다. 핀홀 크기를 하나의 면적 단위로 조정하여 최상의 신호 대 잡음비를 제공하고 0.7마이크로미터 이하의 광학 슬라이스를 사용하여 Z축에서 2차원 컨포칼 광학 슬라이스를 연속적으로 스캔할 수 있습니다. 이제 각 획득 사이의 간격 시간을 30초로, 총 획득 기간을 15분으로 설정하고 획득 후 5분 후에 이미지 획득을 시작합니다.

시계열을 일시 중지하고 10 x 트리거의 8마이크로리터를 추가한 다음 즉시 수집을 계속합니다. 마지막으로 사진을 저장합니다. 디콘볼루션 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션을 수행하고 스택을 3차원 이미지와 동영상으로 재구성하여 이미지 분석을 수행합니다.

컨포칼 형광 현미경 검사로 얻은 복잡한 시계열 이미지의 데이터를 MRS와 같은 과학적 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 이 소프트웨어는 40 개 이상의 현미경 파일을 읽습니다. 열린 데이터 집합의 끝에 시간 지점을 추가하려면 편집을 선택하고 시간 지점을 추가한 다음 새 데이터 집합을 가져옵니다.

대비와 색조를 조정하여 최적의 이미지 보기를 얻습니다. 다운로드된 파일은 MRFP 채널의 표면을 만듭니다. 표면 마법사 옵션 사용.

기본 알고리즘을 선택하고 채널 N-P-Y-M-R-F-P는 스무딩 옵션을 표시하여 노이즈를 줄입니다. 작은 세부 정보가 손실되지 않도록 하려면 영역 세부 정보 수준을 0.05에서 0.1 미크론 사이로 줄입니다. 다음으로 강도 임계값을 설정합니다.

새 회색 표면이 표시됩니다. 그런 다음 설정으로 이동하여 스타일을 중심점에서 표면으로 전환합니다. 선택한 개체의 속성에 있는 통계 탭으로 이동합니다.

그런 다음 세부 탭과 형광, 강도 또는 볼륨과 같은 특정 값을 선택합니다. 데이터를 검토하고 값이 이미지와 호환되는지 확인합니다. 예를 들어, 두 개 이상의 인접한 과립은 평균 과립 크기를 정량화하기 위해 하나의 더 큰 과립으로 측정될 수 있습니다.

상품 과립의 크기를 실제 과립 수로 나눕니다. 마지막 단계로 원하는 데이터 세트를 Excel 파일로 내보내고 데이터를 분석합니다. 여기에 표시된 것은 구조적으로 활성화된 RAB five의 발현에 의해 형성된 비만 세포 거대 분비 과립의 대표적인 타임 랩스 이미지이며, 외포작용의 동역학 및 단일 분비 과립의 해상도입니다.

자극 후. 비만세포 외세포작용(mast cell exocytosis) 동안, 비서 과립은 원형질막(plasma membrane)을 향해 이동하여 융합합니다. 과립은 녹색으로 표시된 구성적으로 활성화된 RAB 5에 의해 코팅됩니다.

이 실험에서 N-P-Y-M-R-F-P이고 자홍색으로 착색된 비서 화물은 세포에서 세포 외 공간으로 방출됩니다. RAB 5의 구조적으로 활동적인 돌연변이에 의해 융합된 과립은 녹색 방출로 나타났습니다. 이 실험에서 그들의 화물 N-P-Y-M-R-F-P는 세포에서 세포 외 공간으로 마젠타색으로 착색됩니다.

엑소사이토시스 중 N-P-Y-M-R-F-P의 방출은 N-P-Y-M-R-F-P 형광 강도의 급격한 증가와 분비 과립을 포함하는 N-P-Y-M-R-F-P의 수축 후 소실, 분비 과립의 형광 강도를 초래합니다. 칼슘 이오노포어(calcium ionophore)로 세포를 자극한 후, 분비 과립은 서로 다른 시점에서 외세포작용(exocytosis)을 겪습니다. 하나의 분비 과립이 원형질막과 융합하지 않았고 형광 강도는 일정하게 유지되었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 분비 과립으로 전달되어 자극된 세포에 의해 방출되는 형광 유전자 리포터를 사용하여 발달 및 엑소사이토시스 중 ma 세포 분비 과립을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 내인성 매개체와 함께, 비만세포, 분비과립 발달 및 외포작용의 기전은 코란(co-ran)에 의한 이 절차를 사용하여 확인하고 보고 유전자와 테스터 유전자로 세포를 검사할 수 있습니다. 비만 세포 분비 과립 발달에 대한 테스터 유전자의 역할은 대조 세포와 비교하여 관심 유전자와 함께 형질 주입된 세포의 분비 과립에 대한 형태 분석을 수행하여 평가할 수 있습니다.

또한, 조절된 엑소 세포작용에 대한 검사된 유전자의 역할은 리포터 유전자의 방출을 모니터링함으로써 확인할 수 있습니다.