Name: 비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: 배우세요 비만 세포 분비 과립의 생합성과 세포 외 유출 메커니즘을 형광 리포터 유전자와 공초점 현미경을 활용하여 분석하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 NPY-MRFP의 cDNA의 선물 박사는 미국 Ashery 감사합니다. 우리는 박사 감사합니다. MJ 코프 론 (Kofron), L. 틀먼, M. Shaharbani 및 현미경에 귀중한 도움을 Y. Zilberstein 및 이미지 분석. 우리는 또한이 원고의 중요한 읽기 박사 조셉 오를리 감사합니다. 이 작품은 과학에 대한 이스라엘 아카데미가 설립 한 이스라엘 과학 재단의 연구비에 의해 지원되었다 (12분의 1,139 RS-E에.).

RBL 세포 배양 미디어 1. 준비 <ol><li> (이 ~ 1 % PEST한다) (이 10 % FBS한다) 소 태아 혈청 56 ㎖로 낮은 혈당 둘 베코의 수정 이글 배지 (DMEM)의 500 ml를 혼합 한 다음 페니실린 스트렙토 마이신의 5.5 ml를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 크기 및 저장소와 500 ~ 1,000 ml의 병 - 최고 진공 필터를 사용하여 미디어를 필터링합니다. </li></ol> RBL 세포의 배양 (2) <ol><li> 어느 플레이트 또는 플라스크에서 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 RBL 세포 성장. 10cm 플레이트에서 성장하고있다 RBL 세포는 10 ml의 매체로 보충 및 10 ~ 7 세포 / 플레이트의 합류 단층을 형성해야한다. </li><li> 세포 층이 합류 해 가면, 낮은 밀도로 배양을 replate. <ol><li> 진공에 연결된 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 플레이트 / 플라스크로부터 배지를 제거한다. </li><li> (37 데워진와 세포 단층을 씻어전체 단층을 (볼륨이 문화 판 / 플라스크의 크기에 따라 달라집니다 커버 ° C) 0.25 % 트립신 / EDTA; 10cm 판 2 ㎖). 이것은 세포를 분리한다. </li><li> 또한, 인산염과 세포 단층은 식염수 (PBS)를 버퍼 씻어 PBS를 제거 및 / EDTA를 데워진 (37 ° C) 트립신을 추가합니다. 이 단계는 빠른 세포를 분리. </li><li> 37 ° C (이하 10 분)에 인큐베이터에서 플레이트 / 플라스크를 놓습니다. </li><li> 가 분리 된 경우 확인하기 위해 광학 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포가 10 분 후 분리하지 않은 경우, 부드럽게 플레이트 / 플라스크에 누릅니다. </li><li> 세포를 일시 중단 배양 플레이트 / 플라스크에 배지를 추가 (매질의 부피는 적어도 트립신 용액의 부피보다 더 큰 2 배이어야한다). </li><li> 25 ° C에서 200g에서 3 분간 원심 분리하여 세포를 펠렛. </li><li> 배지에서 세포를 재현 탁. 1시 10분에 의해 세포를 희석하고 새로운 배양 접시에 씨앗. 그들은 REAC 때까지 48 ~ 72 시간 동안 세포를 품어H 약 90 % 합류점. </li><li> 최대 3 개월 (30 유로)에 대해 동일한 절차 (제 2.2.1-2.2.8)을 반복합니다. </li></ol></li></ol> 형질 미디어 3. 준비. <ol><li> K-파이프의 pH 7, 칼슘 아세테이트의 1 mM의 솔루션과의 Mg 2+ 아세테이트 100 mM의 용액 100 mM의 솔루션을 준비합니다. </li><li> DMEM 매체를 사용하는 20 mM로 K-파이프의 pH 7의 100 mM의 용액을 희석시키고, (2)의 최종 농도로 10 μM Mg를 2+ 아세테이트 100mM의 용액의 최종 농도 칼슘 아세테이트 1mM의 용액을 추가 mm이다. </li><li> 칼륨 글루타민산의 무게를 128 mm의 최종 농도 솔루션에 추가, 잘 섞어 사용할 때까지 4 ° C에 보관하십시오. -20 ° C에서 남은 해결책 (예., K-파이프, 칼슘 아세테이트, 마그네슘 2+ 아세테이트)를 유지합니다. </li></ol> RBL 세포의 형질 4. <ol><li> 플레이트를 사용 / 플라스크로부터 배지를 제거진공에 연결 멸균 파스퇴르 피펫. </li><li> 전체 단층을 포함해야한다 데워진 (37 ° C) 트립신 / EDTA와 세포 단층을 씻어. 37 ° C (이하 10 분)에 인큐베이터에서 플레이트 / 플라스크를 놓습니다. 세포가 광학 현미경을 이용하여 분리 한 경우 확인합니다. </li><li> 세포를 일시 중단 배양 플레이트 / 플라스크 배지 (추가 미디어의 볼륨은 트립신 용액의 부피보다 적어도 2 큰이어야한다). </li><li> 혈구 계를 이용하여 세포 수를 계산. </li><li> 25 ° C에서 200 XG에서 3 분 동안 원심 분리하여 1.5 × 10 7 세포 펠렛. 상층 액을 버리고 형질 매체의 280 μl를 추가합니다. 4mm의 큐벳에 반응 혼합물을 전송합니다. </li><li> 추가 NPY-MRFP 플라스미드의 20 μg의 제어 빈 플라스미드 또는 시험 플라스미드 중 30 μg의. 반응 혼합물의 최종 부피는 300 μL이어야한다. </li><li> 즉시 10 분 동안 얼음에 배치합니다. 잔여 물과 페이지에서 큐벳을 닦아9 밀리 300 V에서 전기에 roceed. </li><li> 세포 외 유출의 측정을 위해 300 ㎕의 매체를 포함하는 24 잘 조직 배양 접시에 즉시 세포를 replate. 물론 각각에 대한 반응 믹스 (4 × 10 5 세포)의 8 μl를 추가합니다. 제어를위한 추가 우물에 4 × 10 5 비 형질 전환 세포를 추가합니다. 적어도 모든 형질에 대한 각각의 치료를 위해 우물을 중복이 수있는 충분한 우물을 준비합니다. </li><li> 시간 경과 현미경, 80 ㎕의 배지를 함유하는 8 웰 챔버 붕규산 커브 글라스 시스템에서 즉시 세포 replate. 각 실에 대한 반응 믹스 (7.5 × 10 4 세포)의 1.5 μl를 추가합니다. (커버 글라스의 중심에있는 챔버 이미지로 쉽게 커버 글라스의 가장자리에 실을 사용하지 않도록하십시오). 참고 : 중요한 것은, 모든 셀이 트리거가 발생하지 가끔 시간 경과 현미경 인해 8 잘 챔버 borosi의 초점 손실과 드리프트에 폐지된다licate 커버 ​​글라스 시스템. 따라서 각 형질에 대한 각각의 치료를 위해 최소 8 챔버를 준비합니다. </li><li> FcεRI 중재 활성화를위한 세포를 민감를 들어, 미디어 (적어도 2 시간 동안 IgE 항체와 세포를 배양)에 마우스 DNP 특정 단일 클론 IgE 항체의 1 ㎍ / ㎖를 추가합니다. </li><li> 18-24 시간 후에 세포가 플라스미드를 발현하는지 확인하기 위해 형광 현미경을 사용한다. MRFP 형광 여기 및 방출 파장은 다음과 같습니다 λEx 584, λEm 607 nm의. NPY-MRFP는 SG를에 해당 기공 구조에 나타납니다. 제 2 관심 유전자 형광 태그에 융합되는 경우 동일한 셀 양쪽 플라스미드의 공동 발현을 확인하기 위하여 형광 현미경을 사용한다. 테스트 GFP 유전자가 융합 된 경우 예를 들어, GFP 형광의 여기 및 발광 파장은 : λEx 488 λEm 507 ㎚이다. GFP 태그 단백질은 NPY-MRFP을 표현 같은 세포에 나타납니다. </li><li> 세포 외 유출 측정의 경우 t 진행O를 5 단계 및 시간 경과 현미경은 6 단계로 진행합니다. </li></ol> 5. NPY-MRFP 세포 외 유출을 측정 <ol><li> 타이로드 버퍼의 준비 : <ol><li> 54 mM의 KCl을 20 mM의의 MgCl 2, 2.74 M 염화나트륨과 DDW 8 mm의의 NaH 2 PO 4 용액을 준비합니다. 잘 혼합하고 4 ℃에서 저장한다. 이 단계는 20 배 타이로드 버퍼의 준비입니다. </li><li> 20 mM의 헤 페스 용액의 pH 7, 1.8 mM의 염화칼슘 2, 1 ㎎ / ㎖ BSA, 5.6 mM의 포도당과 DDW에서 타이로드 20 배의 1 ~ 20 희석을 준비하고 잘 섞는다. 이 단계는 1 배 타이로드 버퍼의 준비입니다. </li><li> -20 ℃에서 1X 타이로드 및 저장 버퍼 나누어지는. 반복되는 동결 융해을 피하십시오. </li></ol></li><li> 24 웰 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 타이로드 버퍼로 3 회 세척한다. 웰을 제어하는​​ 200㎕의 타이로드 완충액을 첨가함으로써 자극되지 않은 세포를 준비한다. </li><li> / 웰의 20 배의 10 μL 시약 [(예 1000 NG / ml의 DNP-BSA 또는 DNP 활성화 농축 준비-HSA은 (Ag), 200 μM 칼슘 이온 운반체 (예 : A23187), 20 μm의 칼슘 이온 운반체 및 1,000 nm의 12-O- 테트라 데카-13 아세테이트 (TPA)]의 조합. 시약은 DMSO에 저장되어있는 경우, 1 % DMSO를 함유하는 타이로드 완충액으로 20 배 농도로 희석 시약. 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 96 웰 플레이트에 잘 신중하게 각각의 상층 액을 제거 얼음에 배치하고 빛으로부터 피할 수 있습니다. (상층 액은 세포에서 방출 된 키메라 펩타이드 NPY-MRFP를 포함). </li><li> 각 웰을 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 200 ㎕의 타이로드 완충액을 첨가하고, 10 분 동안 37 ° C에서 배양한다. (이 단계는 세포에서 방출되지 NPY-MRFP의 나머지를 포함하는 세포 용 해물의 준비를위한 중요하다). 세포 용 해물을 수집하고 96 웰 플레이트에 전송, 얼음에 배치하고 빛으로부터 피할 수 있습니다. </li><li> fluoresc를 사용하여 세포 상등액 및 세포 용 해물의 형광을 측정런스 플레이트 판독기, 590-이 20 nm 대역 여기 필터 및 635- 35 nm의 대역폭 방출 필터를 사용. </li><li> 출시 NPY-MRFP의 비율을 계산한다 참고 : 형광 판독기 측정 임의의 형광 단위 (AFU). AFU 값은 기계 및 감도와 형질 감염 효율에 의존한다. <ol><li> 빈 nontransfected RBL 세포의 형광도를 설정합니다. 총 형광 각 상층 액의 AFU (상층 액을 해당 해물 + AFU의 AFU)을 나누고 100을 곱합니다. </li></ol></li></ol> 세포 외 유출의 6 시간 경과 현미경 <ol><li> 8- 웰 챔버 붕규산 커브 글라스 시스템에서 형질 감염된 세포 / 챔버의 7.5 x 104을 시드. 18-24 시간 후, 챔버에서 배양 배지를 제거하고, 타이로드 완충액으로 3 회 세척 </li><li> 각 실에 타이로드 버퍼의 72 μl를 추가합니다. 10 배 농도로 타이로드 버퍼의 활성화 시약을 희석. </li> &lt;리&gt; 가열 챔버 (37 ° C) 및 CO 2 컨트롤러 (4.8 %)과 40X 또는 63X 목적으로 장착 된 공 초점 형광 현미경을 사용합니다. 현미경 시스템 켜기 : 수은 램프, 컴퓨터 및 레이저를. 가열 된 챔버 실험을 시작하기 전에 적당한 온도에 있는지 확인합니다. </li><li> 가열 된 챔버 챔버를 놓고 챔버 정확하고 안정적​​으로 설치되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 관련 형광에 따라 형광 빛을 켜고 형질 감염된 세포를 시각화. 관심의 셀이 표백 및 세포 독성을 최소화하기 위해 필드에 한 번 형광을 끕니다. 그것은이 필드가 2-3 형질 감염된 세포를 포함하는 것이 중요합니다. 형질 전환 된 세포를 잘 퍼져 있지만 서로 닿지 않도록해야합니다. </li><li> 잡음 및 과포화뿐만 아니라 독성을 최소화하기 위해 (현미경)에 따라 레이저 전력을 조정하고, 이득을 설정하고, 신호 대 잡음비를 수정 오프셋. 에 빠른 스캔하거나DER 레이저 박람회 (평균 2)의 지속 기간을 최소화한다. </li><li> 이 레이저 파워의 감소 가능 최대 핀홀 크기를 조정하고 장시간 집중 화상을 유지한다. 원하는 경우 Z 스택 이차원 공 촛점 광학 조각의 3 차원, 잡음비 최상의 신호를 제공하는 한 통풍 유닛 (AU)에 핀홀 크기를 조정하고 획득 연속 주사로 화상을 재구성하기 위해, 파라미터 세트 광학 조각 ≤0.7 μm의와 Z -axes. </li><li> 15 ~ 30 초마다 수집 및 15 분에 총 취득의 기간 사이의 시간 간격을 설정하고 이미지를 획득 시작합니다. 취득 5 분 후에 시계열을 일시. 10 배 트리거의 8 μl를 추가하고 즉시 인수를 계속합니다. </li><li> , 사진을 저장 디컨 볼 루션 소프트웨어를 사용하여 디컨 볼 루션을 수행하고 세 가지 차원 이미지와 Imaris 소프트웨어를 사용하여 동영상에 스택을 재구성. </li></ol><ol><li> Imaris 소프트웨어 공 초점 형광 현미경에 의해 수득되었다 deconvoluted 시계열 화상으로부터 데이터를 가져. 이 소프트웨어는 40 개 이상의 현미경 파일을 읽습니다. 소프트웨어는 파일을 읽을 수없는 경우; TIF 파일 및 가져 오기로 파일을 변환합니다. </li><li> 오픈 데이터 세트 프레스 편집의 끝 시점을 추가하려면 -&gt; 새 데이터 세트를 시간 포인트를 추가하고 가져옵니다. </li><li> 표면 마법사 옵션을 사용하여 MRFP 채널의 표면을 만듭니다. 기본 알고리즘을 선택합니다. NPY-MRFP의 채널을 선택합니다. 소음을 줄이기 위해 평활화 옵션을 표시한다. 작은 세부 사항은 0.05 μm의 지역 상세 수준을 감소의 손실을 방지합니다. </li><li> 강도 임계 값을 설정합니다. 새로운 회색 화면이 표시됩니다. &quot;설정&quot;으로 이동하여 &quot;중심점&quot;을 &quot;표면&quot;에서 스타일을 전환합니다. </li><li> 선택된 개체의 속성에서 통계 탭으로 이동하여 상세 탭과 특정 값 SUC을 선택형광 강도로서 H, 볼륨 등 </li><li> 데이터를 검토하고 값이 이미지와 호환되는지 확인합니다. 예를 들어, 두 개 이상의 인접하는 하나의 더 큰 과립은 과립으로서 측정 될 수있다. 평균 과립 크기를 정량화 과립의 실제 개수에 병합 된 과립의 크기를 나눈다. </li><li> 엑셀 파일에 원하는 데이터 세트를 내보내고 데이터를 분석한다. </li></ol> F

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</ol>

저자는 재정적 이해 상충이 없습니다.

우리는 세포 외 유출에 대한 리포터 유전자를 사용하여 살아있는 세포에서의 에스 지에스의 시간 경과 3 차원 화상으로의 MCS 엑소 사이토 시스 및 네 개의 값 (x, y, z, t) 치수 정량화 정량화 결합한 혁신적인 전략을 설명한다. 이 기술은 일찍 성숙을 통해 골지체에서 자신의 출구, 세포 외 유출의 능력과 탈과립를 획득하는 등 시작하는 등 모니터링 SG를 같은 MC 기능에 미치는 영향에 대한 단백질의 가족의 검사를 할 수 있습니다. 함께 SG를의 형태 학적 및 운동 특성 분석과 세포 외 유출의 측정의 조합은 테스트 단백질이 MC 기능을 중재하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 따라서이 방법을 사용하여, 대상 유전자의 유전자 조작은 MC SG를 저장하고 그들의화물을 해제하는 새로운 분자 메커니즘을 공개 할 수 있습니다. 특히, NPY는 MCF-7 세포, 세포주 유래의 FR 다른 분비 세포에서 엑소 시토 시스에 대한 리포터로서 역할을 할 수톰 인간 유선 선암 (31),하는 chromaffin 세포 <...

마스트 셀 (MC)은 가장 관절염, 천식, 호산 구성 식도염, 만성 피부염 및 관상 동맥 질환 및 3,5- 포함한 과민성 쇼크 1,2-뿐만 아니라 다른 병리 알레르기 및 염증성 반응에서 이들의 참여를 위해 공지되어있는 면역 세포 암 3,4. 또한, MC라면은 동종 이식 허용 5,6 유도 예를 들어, 박테리아와 기생충에 대한 숙주 방어와 면역 반응의 억제에 의해 모두, 선천성 및 후천성 면역에 중요한 역할을한다. MC들은 + / CD117 + 능성 전구 세포 (7) CD34에서 개발, 골수에서 유래. 커밋 골수 MC 전구 세포는 혈류에 방출 및 결합 조직과 상피 표면 (8) 내에서 주로 지역화 주변 조직으로 마이그레이션 할 수 있습니다. 성숙 및 터미널 차별화는 결국 영향 O에서 달성주변 환경의 8,9 내에서 F 사이토 카인. MC라면 누구의 만남 면역 글로불린 E (IgE) 항체 생성의 결과를 입력 알레르겐 (항원),은 (Ag)에 의해 활성화 될 수있다. 동일의 Ag에 다시 노출시 IgE 항체를 결합 셀의 가교 다음에 MC의 FcεRI 수용체, 그러한 IgE 항체의 결합, FcεRI 집계 및 세포 탈과립에 절정 신호 캐스케이드의 개시의 결과는 [10, 11에서 검토] . MC들도, 신경 펩티드 -5,12- 의해 독립적 IgE 항체의 활성 (13), 세균성 및 바이러스 성 항원 14,15 집합 적 분비 기본적인 면역 세포 및 사이토 카인이라고도 5,13,12,16 양전하 펩티드의 수를 독소 17. MC들도 상기 염증 반응을 증폭 자신 방출 매개체 많은 의해 활성화된다. MC라면은 면역을 포함 분비 과립 (SG를)로 포장된다이러한 카이 메이즈와 트립 타제, 혈관 내피 성장 인자와 여러 사이토 카인과 케모카인 8,9 등의 히스타민과 (설치류) 세로토닌 같은 혈관 활성 아민, 프로테오글리칸, 단백질 분해 효소를 포함하여 규제 매개체. 이러한 매개체는 &quot;갈 준비&quot;하고 MC들이 적절한 자극에 의해 활성화되면, 이러한 매개체는 분 18, 19 초 만에 규제 세포 외 유출 (탈과립)에 의해 세포에서 방출된다. 이러한 초기 이벤트는 아라키돈 산 대사 물질, 여러 사이토 카인 및 케모카인 블랭킷을 포함한 생물학적 효능 물질의 큰 배열의 드 노보 합성 및 방출 이어진다. 새로 합성 된 제품의 출시는 독립적으로 SG 릴리스 발생합니다. 종합적으로, 이러한 매개체는 초기와 후기 단계 염증 및 알레르기 반응을 시작합니다. 따라서, MC 활성화 및 탈과립를 차지 메커니즘을 이해하는 것은 이론 및 임상 꼬마 도깨비의 모두는ortance. 유 전적으로 기본 및 배양의 MC를 조작에 어려움이 제대로 해결 남아 MC 탈과립의 기초가되는 메커니즘을 규명하는 시도를 방해하고있다. 관심의 유전자와 함께이 문제를 극복하기 위해, 우리는 공동 형질 점막 비만 세포주, 래트 호 염기 구성 백혈병 리포터 기재 분석법을 개발 하였다 (RBL) -2H3 (본원 RBL라고 함) 또는 골수 유래의 MC (BMMCs) 30 뉴로 펩타이드 Y (NPY)는 SG의 기자로, 단량체 RFP (MRFP)에 융합. NPY는 이전에 다른 시스템에서 내생 SG 마커의 동작을 요점을 되풀이 나타났다. MRFP 형광 둔감 pH가 발현하기 때문에 또한 NPY는 MRFP-96- 웰 플레이트 및 형광 플레이트 판독기를 사용하여 산성 SG를 시각화 할뿐만 아니라 세포 외 유출의 정량적 평가를 허용한다. 우리는 NPY-MRFP가 RBL 세포와 BMMCs의 산성 SG를 전달됩니다 보여 주었다과 세포에서 분리 될 때내생 SG화물 (즉, β-소사 미나와 세로토닌) (30, 32)과 함께 규제 방식. 이 프로토콜은 자신의 표현형과 RBL 세포 32 SG 특성과 탈과립에 기능에 미치는 영향에 대한 관심의 선별 유전자를 할 수있는 고해상도 이미지 기반의 방법을 제공합니다. 즉,이 프로토콜은 실시간 MC SG를 추적 및 면적 또는 체적의 크기, 그들의 수, 조립의 동력학, 세포 골격을 따라 자신의 이동 및 다른 조건 하에서 세포막과의 궁극적 인 융합 정량화 할 수있다. 예를 들어, DNP - 특이 IgE 항체와 세포를 민감하고 다른 섭동에서 다가의 Ag (DNP 결합 혈청 알부민)와 세포를 트리거 (즉, 중량 또는 돌연변이 유전자의 발현, 또는 약리학 적 조작을 통해 관심의 유전자의 최저) 및 셀을 제어하는​​ 비교.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>시그마-알드리치</td><td>D6046-500ML</td><td>웜 37 &deg; 사용 전 C 수욕</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE 건강 관리 생명 과학</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>셀룰로오스 아세테이트 막, 모공 크기 0.22&nbsp; &뮤; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>코닝 조직 배양 처리 배양 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Life technologies</td><td>R001100</td><td>Warm in 37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>PIPES 디칼륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 아세테이트 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산 칼륨염 일수화물(글루타민산칼륨)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>4mm 전기천공법 큐벳</td><td>셀 프로젝트</td><td>EP-104</td><td></td></tr><tr><td>GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>챔버 커버 유리</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 well, 평평한 바닥</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 또는 CLS390</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트 형광 리더 - Infinite 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>칼슘 이오노포어 A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522</td><td>직사광선 노출을 피하십시오</td></tr><tr><td>12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td><td>Calbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNP monoclonal IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/DNP-HAS</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6661</td>은 <td>직사광선 노출로부터 피합니다</td></tr><tr><td>트리톤-x-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>공초점 형광 현미경:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자이스 LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>니콘 A1 반전</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft exel 또는 Prism 또는 기타 분석 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>기타 시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>염화마그네슘</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>BDH 연구소</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨&nbsp;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr><td>멸균수</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

마스트 셀 (MC)를 형성 미리 새로 합성, 알레르기 염증 및 면역 매개 물질을 방출하여 생리 학적 및 병리학 적 기능을 수행하는 면역 체계의 분비 세포이다. MC들 &#39;매개 알레르기 및 면역 반응에서 남중 여러 조직과 장기에 영향을 미친다. MC 매개체의 합성, 저장 및 방출은 매우 통제된다. 예비 형성된 매개체는 세포막과 융합 세포 외 유출에 의해 규제 대상 콘텐츠를 해제 세포질 분비 과립 (SG)에서 포장된다. 우리는 SG를 대상으로하고 내인성 SG 매개체와 함께 조절 된 방식으로 방출된다 리포터 유전자를 사용하여 원하는 유전자의 공동 발현에 기초하여 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 MC SG를 분석하고 트리거 세포 외 유출에 생합성에서 자신의 타임 라인을 모니터링 높은 해상도 네 차원 공 초점을 수 있습니다. 따라서, 간 유전자의 스크리닝이 프​​로토콜을 이용하여자신의 표현형 및 기능에 미치는 영향에 대한 추정치는 MC SG를의 생합성 및 세포 외 유출을 제어하는​​ 분자 메커니즘을 해독과 관련된 규제를 식별 허용한다. 이에 따라, 건강과 질병에서의 MC 기능을 설명 세포 메커니즘으로 더 통찰력이 제공되어야한다.

때문에 MC들의 낮은 형질 전환 효율의 유전자 조작은 내생 SG를 매개체에 의해 측정 된 평균 분비의 판독에 영향을 떠나지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, 독점적 목적 유전자를 발현 세포 집단을 모니터링하는 리포터 유전자 NPY-MRFP 완전히 공동 발현과 같은 세포에 동시 형질 플라스미드, NPY-MRFP 모니터링 결과를 설정하여. 따라서, 종래의 방법에 비해이 분석의 장점은 선택적으로 유 전적으로 조작 된 세포 (도 1)를 모니터링 할 수있는 능력이다. 사실, 우리는 수용성 NSF [N-에틸 말레이 민감한 융합] 부착 단백질 수용체 (SNARE) 단백질과 랩 GTP 아제 가족의 44 회원을 포함하여 기공을 인신 매매를 조절하는 유전자를 선별 한이 분석을 사용하여. 우리는 SGsize, 수,화물 조성과 세포 외 유출 (23)을 조절하는 유전자를 확인했다. W전자는 (30)...

본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 비만 세포의 분비 과립 발달 및 세포질 방출을 조절하는 메커니즘을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 비만 세포에 엑소사이토시스(exocytosis) 리포터 유전자와 관심 유전자를 함께 형질전환합니다. 그다음 단계로, 세포를 자극하고 엑소사이토시스 과정 동안 리포터 유전자의 형광 신호를 모니터링하여 테스트한 유전자가 엑소사이토시스에 미치는 영향을 평가합니다.다음으로, 분비 과립에 위치하는 리포터 유전자의 공초점 이미징을 통해 테스트한 유전자가 비만 세포의 분비 과립 생성 및 발달에 미치는 영향을 평가합니다. 마지막 단계는 분비 과립의 형태 분석을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 리포터 유전자를 이용한 비만 세포 분비 과립의 형광 표지를 통해 비만 세포의 변화, 분비 과립의 발달 및 이들의 세포 외 배출을 확인합니다.내인성 매개체인 beta haase 또는 histamine의 방출을 측정하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 관심 유전자의 와일드 타입 돌연변이체 또는 S-H-R-N-A를 엑소사이토시스(exocytosis) 리포터와 함께 공동 발현시킨다는 점에 있습니다. 이러한 공동 발현을 통해 유전적으로 조작된 세포로부터의 분비만을 선택적으로 모니터링할 수 있으며, 이를 통해 비만 세포의 낮은 형질전환 효율로 인해 내인성 매개체의 방출을 측정할 때 발생하는 높은 신호 대 잡음비 문제, 즉 결과 해석을 어렵게 만드는 문제를 극복할 수 있습니다. 이 방법은 칼슘 선택, 과립의 패키징 및 엑소사이토시스 능력을 포함하여 분비 과립 생성 과정을 제어하는 분자적 메커니즘을 규명하는 것과 같이, 비만 세포의 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 또한 kinase, phosphatase 및 기타 단백질군이 이 과정에 관여하는지를 평가함으로써, 대량의 세포 조절 외세포 방출(regulated exocytosis) 과정을 제어하는 분자적 메커니즘을 규명하는 데 도움이 됩니다. 시작을 위해, transfection을 수행할 수 있도록 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 쥐 기초성 백혈병(basophilic leukemia) 세포와 배지를 준비하십시오. 먼저, 진공 장치에 연결된 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 플레이트에서 배양액을 제거합니다.미리 데워둔 trypsin으로 세포 단층을 헹구어, 전체 단층이 덮이도록 DTA를 처리합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 10분 이내로 배양합니다. 그 후 광학 현미경을 사용하여 세포가 떨어졌는지 확인합니다.세포가 분리되면, 트립신 용액 부피의 최소 2배 이상의 부피가 되도록 배지를 배양 플레이트에 추가하여 세포를 현탁합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 센 후, 200 G, 25 °C에서 3분 동안 원심분리하여 1,500만 개의 세포를 펠렛으로 만듭니다. 상층액(SNAT)을 제거하고 280 µL의 transfection 배지를 추가합니다.그런 다음 반응 혼합물을 4 mm 큐벳으로 옮깁니다. N-P-Y-M-R-F-P라는 약칭으로도 알려진 neuropeptide Y-M-R-F-P를 포함하는 플라스미드 20 µg과 대조군용 빈 플라스미드 또는 테스트 플라스미드 30 µg을 각각 첨가합니다. 반응 혼합물의 최종 부피는 300 µL가 되어야 합니다.10분 동안 얼음에 놓아둔 후, 베타(vet)에 남은 물기를 닦아냅니다. 그다음 300 V 전압에서 9 ms 동안 전기천공법을 진행합니다. 엑소시토시스(exocytosis) 측정을 위해서는 300 µL의 배지가 들어있는 24웰 조직 배양 접시에 세포를 즉시 재현탁합니다.각 웰에 반응 혼합물 8 µL를 추가합니다. 그런 다음 대조군을 위해 추가 웰에 형질전환되지 않은 세포를 추가합니다. 각 처리군당 중복 웰이 있도록 충분한 웰을 준비하십시오. 타임랩스 현미경 관찰을 위한 모든 형질전환의 경우, 80 µL의 배지가 포함된 8-웰 챔버 BO 실리케이트 커버글라스 시스템에 세포를 즉시 재부착시키십시오.각 챔버에 반응 혼합물 1.5 µL를 첨가하여 FC epsilon R one 매개 활성화에 대해 세포를 감작시킵니다. 배지에 1 µg/mL의 마우스 DNP 특이적 단클론 IgE를 첨가합니다. IgE와 함께 세포를 최소 2시간 동안 배양합니다.18~24시간 후에 형광 현미경을 사용하여 세포가 플라스미드를 발현하는지 확인합니다. MRFP의 들뜸 파장은 584 nanometers이고 방출 파장은 607 nanometers입니다. N-P-Y-M-R-F-P는 분비 과립에 해당하는 소포 구조에서 나타나야 합니다.N-P-Y-M-R-F-P 엑소사이토시스를 측정하려면, 24-웰 플레이트에서 배양액을 제거하고 tyro 버퍼로 3회 세척하십시오. 대조군 웰에 200 µL의 tyro 버퍼를 추가하여 자극되지 않은 세포를 준비하십시오.그런 다음 활성 시약과 희석된 tyro buffer를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 각 웰의 S 상층액을 96-웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 플레이트를 얼음에 두고 빛으로부터 차단합니다.S 상청액에는 세포에서 방출된 키메라 펩타이드 N-P-Y-M-R-F-P가 포함되어 있습니다. 다음으로, 각 웰에 0.5% Triton X 100이 포함된 tyro 버퍼 200 µL를 넣고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 이 단계는 세포에서 방출되지 않고 남아 있는 N-P-Y-M-R-F-P가 포함된 세포 용해물을 준비하는 데 중요합니다.세포 용해물을 수집하여 96-웰 플레이트에 옮긴 후 얼음에 배치합니다. 빛이 없는 상태에서, 590 nm(대역폭 20 nm)의 들뜸 필터와 635 nm(대역폭 35 nm)의 방출 필터가 장착된 형광 플레이트 리더를 사용하여 세포 상청액과 세포 용해물의 형광을 측정합니다. 형질전환된 세포 1.5 µL를 8-챔버 BO 실리케이트 커버글라스 시스템에 분주합니다.세포를 37°C 인큐베이터에서 18~24시간 동안 배양합니다. 챔버에서 배양액을 제거하고 Tyrode 완충액으로 3회 세척합니다. 그 후 각 챔버에 Tyrode 완충액 72 µL를 첨가합니다.가열 챔버 이산화탄소 제어 장치와 40 x 또는 63 x 대물렌즈가 장착된 공초점 형광 현미경을 사용하십시오. 수은 램프, 컴퓨터 및 레이저를 포함한 현미경 시스템의 전원을 켭니다. 가열 챔버가 적절한 온도로 설정되어 있는지 확인하십시오.실험을 시작하기 전, 8-웰 챔버 보어 실리케이트 커버 글라스 시스템을 가열 챔버에 넣고 챔버가 올바르게 설치되어 안정적인지 확인하십시오. 관련 절차에 따라 형광등을 켜고 형질전환된 세포를 시각화한 후, 관심 세포가 시야에 들어오면 형광등을 끕니다. 광퇴색과 세포독성을 최소화하기 위해, 해당 시야에는 약 2~3개의 형질전환된 세포가 포함되어 서로 닿지 않고 충분히 퍼져 있어야 합니다.이 사례에서는 세포에 리포터 유전자인 N-P-Y-M-R-F-P와 GFP가 표지된 구성적 활성형 RAB5 돌연변이를 공동 형질전환합니다. 노이즈와 과포화 및 독성을 최소화하도록 레이저 출력을 조정하고, 신호 대 잡음비를 수정하기 위해 게인(gain)과 오프셋(offset)을 설정합니다. 레이저 노출 시간을 최소화하기 위해 빠르게 스캔합니다.다음으로, 이미지를 3차원으로 재구성하기 위해 Z-stack 파라미터를 설정합니다. 최적의 신호 대 잡음비를 얻기 위해 핀홀 크기를 1 AU(area unit)로 조정하고, Z축을 따라 0.7 µm 이하의 광학 슬라이스 간격으로 2차원 공초점 광학 슬라이스를 연속적으로 스캔하여 획득합니다. 이제 각 획득 사이의 시간 간격을 30초로, 전체 획득 지속 시간을 15분으로 설정하고, 5분간의 대기 시간 후 이미지 획득을 시작합니다.타임 시리즈를 일시 중지하고, 10 x 트리거 8 µL를 추가한 후 즉시 획득을 재개하십시오. 마지막으로 이미지를 저장합니다. 디콘볼루션 소프트웨어를 사용하여 디콘볼루션을 수행하고, 스택을 3차원 이미지와 동영상으로 재구성하여 이미지 분석을 수행하십시오.공초점 형광 현미경으로 획득한 디컨볼루션(deconvolution) 시계열 이미지를 MRS와 같은 과학 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다. 이 소프트웨어는 40가지 이상의 현미경 파일 형식을 읽을 수 있습니다. 열려 있는 데이터 세트 끝에 시점을 추가하려면, 'edit'에서 'add time points'를 선택하고 새로운 데이터 세트를 가져오십시오.최적의 이미지 뷰를 얻기 위해 대비와 색조를 조정합니다. 다운로드된 파일들은 MRFP 채널의 표면을 생성합니다. 표면 마법사(surface wizard) 옵션을 사용하십시오.기본 알고리즘을 선택하고 채널 N-P-Y-M-R-F-P에서 노이즈를 줄이기 위해 스무딩(smoothing) 옵션을 표시하십시오. 작은 세부 사항의 손실을 방지하려면 영역 세부 수준(area detail level)을 0.05에서 0.1 µm 사이로 줄이십시오. 다음으로, 강도 임계값(intensity threshold)을 설정하십시오.새로운 회색 표면이 표시됩니다. 그런 다음 설정으로 이동하여 스타일을 중심점에서 표면으로 전환하십시오. 선택한 객체의 속성에서 통계 탭으로 이동하십시오.그다음 상세(detailed) 탭을 선택하고 형광, 강도 또는 부피와 같은 특정 값을 선택하십시오. 데이터를 검토하여 해당 값들이 이미지와 일치하는지 확인하십시오. 예를 들어, 평균 과립 크기를 정량화할 때 인접한 두 개 이상의 과립이 하나의 더 큰 과립으로 측정될 수 있습니다.merch 과립의 크기를 실제 과립 수로 나눕니다. 마지막 단계로, 원하는 데이터 세트를 excel 파일로 내보내고 데이터를 분석합니다. 여기에는 구성적 활성 상태의 RAB5 발현에 의해 형성된 비만 세포 거대 분비 과립의 대표적인 타임랩스 이미지와 외세포 배출의 역학 및 단일 분비 과립의 해상도가 나타나 있습니다.자극 후, 비만 세포의 세포외배출 과정 동안 분비 과립이 세포막 쪽으로 이동하여 융합됩니다. 과립은 녹색으로 표시된 상시 활성 상태의 RAB5로 둘러싸여 있습니다.본 실험에서 마젠타색으로 표시된 분비 화물인 N-P-Y-M-R-F-P는 이후 세포에서 세포외 공간으로 방출됩니다. 초록색으로 표시된 constitutive active mutant RAB5에 의해 융합된 과립들이 세포 내에서 세포외 공간으로 화물인 N-P-Y-M-R-F-P(본 실험에서 마젠타색으로 표시됨)를 방출합니다.exocytosis 동안 N-P-Y-M-R-F-P의 방출은 N-P-Y-M-R-F-P 형광 강도의 급격한 증가와 N-P-Y-M-R-F-P를 함유한 분비 과립의 수축 및 이에 따른 소실을 초래하며, 분비 과립의 형광 강도가 나타납니다. 칼슘 이오노포어로 세포를 자극한 후, 분비 과립은 서로 다른 시점에서 exocytosis를 겪습니다. 반면, 하나의 분비 과립은 세포막과 융합되지 않았으며 그 형광 강도는 일정하게 유지되었습니다.이 영상을 시청한 후, 분비 과립으로 전달되었다가 자극된 세포에 의해 방출되는 형광 유전자 리포터를 사용하여 비만 세포 분비 과립의 발달 및 엑소사이토시스(exocytosis)를 모니터링하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 통해 리포터 유전자와 테스터 유전자를 함께 도입하여 세포를 검사함으로써, 내인성 매개체와 더불어 비만 세포 분비 과립의 발달 및 엑소사이토시스의 기저 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 대조군 세포와 비교하여 관심 유전자를 공동 형질전환한 세포의 분비 과립에 대해 형태측정학적 분석을 수행함으로써, 비만 세포 분비 과립 발달에 미치는 테스터 유전자의 역할을 평가할 수 있습니다.또한, 리포터 유전자의 방출을 모니터링함으로써 조절된 엑소사이토시스(exocytosis)에서 테스트 대상 유전자의 역할을 확인할 수 있습니다.

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 비만 세포의 탈과립 활성을 결정하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 비만 세포에서 방출되는 효소는 기질을 가수분해하고 착색된 생성물을 생성합니다. 비만 세포의 탈과립 활성은 세포 내 총 효소 함량으로 정규화된 세포 외부의 효소 방출 비율로 측정되었습니다.

표적 화학물질의 영향을 연구하기 위한 비만 세포 탈과립 분석

이 비디오는 성체 마우스의 복막강에서 성숙한 결합 조직형 비만 세포를 분리하기 위한 복막 세척 방법을 보여줍니다. 복막강에서 1차 면역 세포의 혼합물을 분리한 후, 적절한 배양 조건에서 비만 세포의 선택적 증식을 수행합니다.

쥐 복막강에서 일차 비만 세포를 분리하는 기술

이 비디오는 칼슘 이온단을 포함하는 활성화 시약에 의해 유도되어 형광 리포터 단백질 NPY-mRFP를 포함하는 분비 과립의 방출을 시작하는 비만 세포 엑소사이토시스를 보여줍니다. 그 후, 형광 플레이트 리더를 사용하여 방출된 NPY-mRFP를 측정하여 엑세포작용(exocytosis)을 정량적으로 평가합니다.

뉴로펩타이드(Neuropeptide) Y 단량체 적색 형광 단백질 방출을 통한 비만 세포 엑소사이토시스(Exocytosis) 측정

이 동영상은 비만 세포에서 외포작용(exocytosis)을 시각화하는 기술을 보여줍니다. 세포는 형광 리포터인 FITC-dextran으로 배양되며, 이는 산성 pH가 형광을 소멸시키는 분비 과립(SG) 내부의 세포에 의해 흡수됩니다. 과립 엑소사이토시스(granule exocytosis)가 자극되면 배지의 더 높은 pH는 융합된 SG 내부의 리포터 형광을 유도하며, 이는 형광 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

비만 세포에서 분비 과립의 외세포작용(Exocytosis)을 시각화하기 위한 체외 기술(An In vitro technique to visualize exocytosis of secretory granules in mast cells)

비만 세포의 탈과립, 알레르기 중재자의 릴리스는, 알레르기, 천식, 및 기생충 방어에 중요합니다. 여기에 우리가 탈과립에 대한 약물 및 독성 물질의 영향을 평가하기위한 방법 1을 보여, 방법론은 최근 항균제 트리클로산 2의 강력한 억제 효과를 나타낸다 활용.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

삼투성 스트레스에는이 과정을 발표 하는 신경 전달 물질의 양과 exocytosis 영향을 줍니다. 전송 전자 현미경 검사 법 함께 전기 화학 방법 결합 수 있습니다 사용 하는 방법을 exocytosis 활동, 소포 quantal 크기, 출시 하는 신경 전달 물질의 양과에 extracellular 삼투성 압력의 효과 연구 설명 동안 exocytosis.

분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

미세 패턴 세포에 리소소피 외세포증의 라이브 이미징이 이 과정의 공간 적정화를 허용한다. 마이크로 패턴을 이용한 형태 학 정상화는 세포 프로세스의 공간 분포에 대한 일반적인 규칙을 발견하는 뛰어난 도구입니다.

마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화

CD19 별 키메라 항원 수용체 (자동차)를 표현하는 T 세포는 우리의 첫번째 인 인간 유전자 치료 시험에서 B-세포 malignancies의 investigational 치료로 주입됩니다. 우리는을 사용하여 T 세포의 유전자 변형을...

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

배우세요 비만 세포 분비 과립의 생합성과 세포 외 유출 메커니즘을 형광 리포터 유전자와 공초점 현미경을 활용하여 분석하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

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