Name: 와 전염성 해면상 뇌증 종 장벽 평가 체외 프리온 단백질 변환 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 학습하세요 전염성 해면상 뇌증의 종 간 장벽을 평가하는 체외 프리온 단백질 변환 분석법을. 변환 효율 비율(CER)을 측정하여 생물학적 위험을 예측하고 동물 실험을 대체하는 효율적인 방법입니다.

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조직 획득에 도움을 주신 John Olsen(위스콘신 천연자원부), Tom Cooley, Daniel O'Brien 및 Steve Schmitt(미시간 천연자원부) 및 Daniel Walsh 박사(USGS 국립 야생 동물 건강 센터)에게 감사드립니다. 또한 진단 검사 서비스를 제공해 주신 위스콘신 주립 위생 연구소(Wisconsin State Laboratory of Hygiene)와 장비 사용에 대해 토니 로크(Tonie Rocke) 박사와 그녀의 직원(USGS 국립 야생동물 보건 센터)에 감사드립니다. 상표, 제품 또는 회사 이름의 사용은 설명 목적으로만 사용되며 미국 정부의 보증을 의미하지 않습니다.

USGS 국립 야생 동물 보건 센터에서 실시 동물 연구는 실험 동물 복지 가이드 라인의 NIH 사무실에 따른 제도적 동물 관리 및 사용위원회 프로토콜 # 1 EP080716에서 수행되었다. 수렵 채취 동물의 조직은 위스콘신 또는 천연 자원의 미시간 부서에서 선물했다. 1. 솔루션 준비 참고 : 아래에 나열된 솔루션은 아래 제 2의 CER 분석 기판의 준비가 필요합니다. 높은 농도의 원액에서 각 솔루션을 준비; 원액에 대한 권장 농도는 나열된 각각의 화학 물질 이름 뒤에 괄호 안에 표시됩니다. 사용까지 4 ° C에서 기판 준비 및 저장시 신선한 모든 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 100 mM의 S : 용해 버퍼를 들어, 10 mM의 트리스, pH가 7.5 (1 M 트리스이, pH가 7.5 원액 권장) 다음의 용액을 조제비난의 클로라이드 (염화나트륨, 1 M 스톡 용액), 10 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, 500 mM의 EDTA, pH가 8.0 스톡 용액), 0.5 % NP-40 (10 % 스톡 용액), 0.5 % 데 옥시 콜레이트 (DOC, 10 % 원액 ). </li><li> 변환 버퍼, 0.05 % 도데 실 황산나트륨 (SDS, 10 % 원액) 0.5 % 트리톤 X-100 1 인산염 완충 식염수 (10 % 스톡 용액) (PBS, 10, pH가 7.4 스톡 용액)의 용액을 제조 하였다. </li><li> 카오 솔루션의 경우, 염산 구아니딘 1X PBS에서 (GdnHCl, 8 M 주식) (10 배 원액)의 두 개의 3 M 솔루션을 준비합니다. 진한 염산 (HCL)을 사용하여 3.5 ± 0.05 솔루션 중 하나의 pH를 조정한다. 제 2 용액의 pH가 7.4 ± 0.05에 남아 있는지 확인하고 진한 염산이나 수산화 나트륨 (NaOH를) 필요로 조정합니다. </li></ol> 2. CER 분석 기판 쌍을 준비 <ol><li> 관심의 종에서 건강하고, 비 TSE에 감염된 뇌 조직을 얻고 10 %의 중량 당 볼륨을 준비다음 방법 중 하나를 사용하여 용해 버퍼에 균질 (/ V w) : 다운스, 비드 밀, 또는 박격포와 유 봉 균질화. 또한, 주사​​기 및 바늘로 균질화를 실시하고, 기판은 흡인 27 G 바늘 주사기를 통해 용이하게 배출 될 수있을 때까지 증가 게이지의 바늘을 사용하여 생성 된 균질 물을 구체화. <ol><li> 설치류 및 다른 작은 포유 동물로부터 제조 된 기판의 경우, 전체 뇌 (들)을 균질화; 큰 포유 동물로부터 제조 된 기판에 대해, 균질을 준비하는 OBEX (뇌간) 조직을 사용합니다. 뇌 파쇄 액의 양을 선택할 때, 단계 2.6에서 단백질을 침전 원심 분리기의 용량의 50 % 이하를 준비하지 않는다. </li><li> 취득 된 뇌 조직의 품질이 의심스러운 경우, SDS-PAGE 및 면역 블롯 (16)는 기판 (17)에 의해 제조하기 전에 PRP C 수준을 평가. </li></ol></li><li> 별도의 표시 플라스틱 원뿔 튜브에 두 개의 동일한 볼륨으로 뇌 균질 나눈다. (GdnHCl 추가뇌 균질 1 부피비로 pH를 3.5 또는 1 각 튜브에 7.4 중 하나에서 1 PBS에 3 M 솔루션). </li><li> 두 용액의 pH 값을 확인합니다. 진한 HCl을 사용하여 pH 0.05 ± 3.5로 pH를 기판의 pH를 조정한다. 다른 기판의 pH가 7.4 ± 0.05에 남아 있는지 확인하고 염산 또는 필요에 따라 NaOH로 필요에 따라 산도를 조정합니다. 산 또는 염기의 현명한 첨가하여 pH 값을 오버 슈트하지 마십시오. </li><li> 5 시간 동안 실온 (RT)에서 끝을 통해 엔드 믹서에 솔루션을 돌립니다. </li><li> 각 원추형 튜브 내의 기판 용액에 메탄올 4 권을 첨가하여 단​​백질을 침전, 와류 잘 혼합하고, 16 ~ 18 시간 동안 -20 ° C에서 배양. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 13,000 × g에서 원심 분리하여 침전물 샘플. 조심스럽게 가만히 따르다하고 상층 액을 버리고 메탄올 펠릿에서 증발 할 수 있습니다. 튜브의 내부에 달라 붙었다 메탄올을 흡수을 지원하기 위해 면봉을 사용합니다. 펠렛을 통해-DR을 허용하지 마십시오Y와 메탄올이 더 이상 표시되면, 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 변환 버퍼에 재현 탁 단백질 펠렛. 단계 2.2에서 분배 된 각각의 튜브 내로 뇌 균질 출발 물질의 양과 동일한 변환 버퍼의 양을 사용한다. 참고 : 변환 버퍼가 모두 pH를 3.5 및 7.4 처리 기판 준비에서 단백질 펠렛을 재현 탁하기 (세제의 낮은 수준과 생리적 산도를 포함) 위의 단계 1.2에 정의 된 솔루션이다 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> cuphorn 초음파 처리기에서 간단히 초음파 처리 기판 솔루션 (30 % 최대 전력 ~ 10 초), 0.5로 나누어지는 - 표시 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 1.0 ml의 볼륨. 각각의 기판의 분취 액에 품질 관리 면역 블롯 (단계 290)를 수행한다. CER 분석 (4 절)을 수행 할 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 다른 분량을 저장합니다. </li><li> 사용 전에 CER 기판 쌍 (도 2)의 품질 관리를 수행한다. 이 단계는 CER 기판이 제공하기 것을 보장변환 연구에서 전자 최적의 결과. <ol><li> 두 개의 기판에 PRP C의 비교 금액을 확인합니다. 10 ~ 25 SDS-PAGE (16)에 의해 각각의 기판 ㎕의 17을 발현 수준에 PRP 수준을 비교. 7.4 및 3.5의 기판이 서로의 ~ 10 % 이내의 pH 단백질 수준은, 기판 쌍 CER 연구에 사용하기 적합한 지. 참고 : PRP 면역 블롯 광범위한 PRP C 저하의 증거를 보여주지해야한다. PRP 면역은 주로&gt; 20 kDa의해야합니다. 이 분자량보다 작은 밴드 분해 산물이 될 수 있습니다. 줄무늬 패턴은 기판 쌍 사이 거의 동일해야합니다. </li><li> 양 기판의 PRP C 민감한 PK되어야 같이, 100 ㎍ / ml의 최종 농도 PK 각 기판의 10-25 μl를 치료하고 열 셰이커로 1 시간 동안 37 ℃에서 1,000 rpm으로 샘플을 소화. SDS-PAGE (16, 17)을 발현 수준으로 남아있는 PRP 신호를 평가합니다.PRP 해상도와 기판은 CER 연구에서 사용하기에 적합하지 않다. </li></ol></li></ol> 3. TSE 에이전트 씨앗을 준비 <ol><li> 관심의 종 TSE에 감염된 뇌 조직을 확보하고 1X PBS pH를 7.4 균질 위의 단계 2.1에 나와있는 방법을 사용하여 (/ V는 w) 10 %를 준비합니다. 참고 : 씨앗은 또한 중추 신경계 외부의 다른 TSE에 감염된 조직에서 생산 될 수있다, 그러나, TSE에 감염된 말초 조직에서 파생 된 종자에 의한 뇌 유래 된 기판의 변환 효율은 아직 실험적으로 출간 된 문헌에서 평가되지 않았습니다. </li><li> (100)에 균질 (들) 결과로 나누어지는 - 전까지 -80 ° C에서 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 300 μL 용량의 저장은 CER 분석을 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 4. CER의 분석 주 : CER 분석은 하나의 종 ( &quot;시드&quot;에서 제공) PRP TSE 비교적 소량의 첨가를 포함부분적으로 pH를 3.5 또는 7.4 중 하나에서 변성 된 다른 종 (감염되지 않은 뇌 &quot;기판&quot;에서 제공) PRP C의 상대 초과로. 확장 흔들어 배양 기간 후, 각 반응에 PRP TSE에 의한 PRP C의 템플릿 기반의 변환은 PRP 입술 나머지 PK의 소화와 면역 검출 이후의 농도계 신호에 의해 평가된다. 이전에 pH를 3.5 대 7.4 변성 기판에 PRP 입술 레벨을 비교하는 종 장벽의 측정치를 제공한다. 상기 분석 과정의 실험 개요도 1에 제공된다. <ol><li> 천천히 감염되지 않은 CER 기판 쌍을 해동 얼음 침대 (약 1 시간 해동 시간)의 상단에 배치하여 및 TSE에 감염된 종자 솔루션 (분석은 이전에 모두 pH가 3.5과 7.4에서 변성 기판 같은 부피 필요). </li><li> 완전 해동 후에 대기음 후 통해 각 기질 용액을 추방27 G 주사기 바늘을 여러 번을 다시 균질화한다. 간단히 30 %, 최대한의 권력 ~ 10 초 동안 각 TSE에 감염된 종자 솔루션을 초음파 처리. 전환 반응을 준비하는 동안 얼음에 모든 솔루션을 보관하십시오. </li><li> TSE 에이전트 당 라벨 5 개인 낮은 바인딩, 얇은 PCR 튜브 테스트되고. </li><li> pH를 3.5로 제조하여 pH 7.4 및 (b) 기판에 CER 제조 (a) 기판의 CER 95 μL에 10 % TSE 감염된 시드 용액 5 μl를 첨가하여 이들 튜브 전환 반응을 준비한다. <ol><li> 각각의 실험 예를 들어, 이전에 모두 pH를 3.5 및 7.4에 변성 CER 기판 쌍의 평행 반응을 준비합니다. </li><li> 경험적인 결정을 통해 감염되지 않은 뇌 기판에 TSE 에이전트 씨의 비율을 최적화합니다. 일반 씨앗 : 고용 기판 비율은 100 μL의 총 반응 볼륨을 유지하고 1:99 μL, 2:98 μL 및 5:95 μl를 포함한다. 대부분의 응용 프로그램, 5:95 μL 씨 : 기판의 부피 비율이 적절한 지와 일에 무엇을 제시한다프로토콜입니다. </li></ol></li><li> 다음 TSE 화제 당 세 개의 대조 시료 시험되는 준비 : (a) 입력 PRP 입술 용 컨트롤로 95 μL 변환 버퍼에 10 % TSE 감염된 시드 용액 5 μL를 추가; (b) pH가 3.5 이상, 불특정 템플릿 변환 컨트롤 등의 (c) pH를 7.4로 제조 95 μL 기판 5 μL 변환 버퍼를 추가한다. </li><li> 간단히 잘 씨와 기판을 혼합 폐쇄 PCR 튜브에 각각의 샘플을 소용돌이. PCR 튜브의 뚜껑에 갇혀 반응 혼합물의 임의의 양을 제거하는 저속 벤치 톱 원심 분리기에서 미니 순간 펄스에 따라. </li><li> PCR 튜브에 동의 장착 된 탁상용 열 흔드는 개별적으로 표지 된 PCR 튜브에로드 샘플. 24 시간 동안 37 ° C에서 1,000 rpm으로 샘플을 흔들어. </li><li> 이하의 (w / v)이고, PK 100 ㎍ / ml의 최종 농도 2 %의 최종 농도 sarkosyl 추가 흔들. 다이제스트 샘플 열 셰이커 1 시간 동안 37 ° C에서 1,000 rpm으로. NOTE : PRP C의 PK 소화의 샘플 변환 후 보조기구 sarkosyl의 추가. 시드 화 샘플 (4.5 단계)에서 거짓 긍정적 인 신호는 거의 sarkosyl의 첨가에 의해 제거된다. </li><li> 17 immunoblotting에 다음 SDS-PAGE (16)에 의해 각 샘플에 남아있는 PRP 입술을 5 분 동안 95 ° C로 SDS-PAGE 샘플 버퍼, 열 샘플을 추가하고 해결. 주 : 시료 완충액의 첨가 및 가열은 샘플 즉시 처리 될 수 있거나 샘플을 -20 ° C에서 저장 될 수있다 또는 -80 ° C에 선행 면역 후. 여기에 제시된 모든 데이터는 NOVEX 누 페이지 젤 및 전송 시스템을 사용하여 생성되었다. CER 분석에서 개별 샘플은 샘플 버퍼 및 제조자의 지시에 따라 환원제로 처리 하였다. 이어서 샘플을 5 분 동안 95 ° C로 가열하고, 각 시료의 30 μl의 12 % 비스 - 트리스 프리 캐스트 겔에 로딩 하였다. </li><li> 척도로서 변환 효율 비 (CER)을 계산종 장벽. 농도계 (17)에 의해 PRP 해상도의 측정 수준과는 pH가 3.5 샘플의에 의해 pH가 7.4 시료의 전체 밀도를 나눕니다. 백분율을 생성하기 (100)에 의해 곱. </li><li> 주어진 TSE 에이전트 종의 평균 CER ± 표준 편차를 생성하기 위해 독립적 인 실험 반복 실험에서 데이터를 컴파일합니다. </li></ol>

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이 프로토콜의 성공적인 완료를 들어, 관심 기판 제조 (단계 2.1.2) 및 전환 반응 (단계 4.4.2)에 대한 비율을 기판에 시드에 사용되는 감염되지 않은 뇌 조직에서 PRP C 수준으로 지불해야합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 뇌는 한 PRP C는 면역 (그림 4)에 의해 존재로, 상당한 기간 부검 후 CER 기판으로 사용하기 위해 추출 할 수 있습니다. 실제로 일부는 자기 분해 CER 연구에 사용 샬럿의 뇌에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이들의 뇌에서 파생 된 기판의 배양은 여전히 PRP 고해상도의 형성 결과. 우리는 부분적 CER 분석법 견고성 많은 프로테아제를 불 활성화한다 GdnHCl 1.5 M의 CER 기판 변성에서 유래한다는 추측. 비율 기판하는 종자는 면역에 의해 허용되는 PRP 고해상도 신호를 얻을 경험적으로 결정해야 할 수도 있습니다. ...

전염성 해면상 뇌증 (TSEs, 프리온 질환) 동물과 인간의 다양한 영향을 확장 배양 기간이 치명적인 신경 퇴행성 질환의 그룹입니다. TSEs의 추정 병인 제는 감염, 질병 - 관련에 PRP PRP (C)의 정상 세포 형태의 템플릿 기반의 변환에 의해 자기 전파 할 수있는 호스트 프리온 단백질 (PRP)의 미스 폴딩 이성체로 구성되는 감염된 호스트 1의 중추 신경계 조직에 축적 형태 PRP (TSE). 전염성 프리온은 일반적으로 포유 동물 종간 송신이 제한 이벤트 「TSE 종 장벽 &quot;이라는 개념이 탄생했다 종 특이 방식으로, 호스트 간에서 송신한다. 프리온 종 장벽의 생물학적 결정은 잘 이해되지 않습니다. 감염성 PRP TSE 호스트 PRP C C 사이의 아미노산 서열 유사성강력 변환 3-5 일어난다하지만, 생체 내 6,7에서 관찰 된 모든 프리온 전송 이벤트를 설명하기에 불충분 남아 있는지에 영향을 미친다. 따라서, TSE 종 장벽 특성은 주로 동물 도전 연구에 의존했다 : 서로 프리​​온에 주어진 종으로부터 나이브 동물을 노출시키고 질병 발병과 전송 효율의 지표로서 공격 속도로 얻어진 배양 시간을 측정. 이종 종에서 PRP C를 발현하는 마우스는 연구 8 이런 종류의에 사용됩니다. 트랜스 제닉 마우스의 제작 및 프리온 장기화 생물 검정뿐만 아니라 동물의 윤리적 사용과 관련된 비용은 TSE 종 장벽 실험 조사 장애물이다. TSEs에 대한 인간 종 장벽의 평가는 인간의 PRP C를 발현하도록 유전자 조작 된 생쥐에 의존한다. 이 마우스는 인간의 TSEs 또는이 t 수정에 굴복 긴 배양 기간을 필요로빠른 질병 발병 9 그가 인간의 PRP C 분자. 이 마우스에서 인간이 아닌 TSEs에 대한 배양 기간은 도전 부정적인 결과의 해석을 정상 마우스의 수명을 넘어 연장 할 수있다. 비 - 인간 영장류는 인간 종 장벽을 연구하기위한 프록시로서 사용되었지만, 그것은 인간 숙주에 진행됨에 따라 이러한 연구 정확하게 질병 요점을 되풀이되지 않을 동물 실험과 인간이 아닌 영장류의 다른 유형과 같은 문제점을 내포한다. 동물 생물 검정은 TSE에 종의 감수성을 측정하기위한 &quot;금 표준&quot;방법 남아 있지만, 장애물, 비용이 살아있는 동물 실험의 윤리 대안의 조사를 강요했다. PRP TSE에 의해 시드 단백질 분해 효소 K (PK)에 내성 상태 PRP (입술)에 호스트 PRP C의 변환을 평가에 따라 체외 분석,의 숫자는 개발 TSE 특검팀을 조사하기 위해 사용되어왔다ecies 장벽 10-12. 시험 관내 분석법의 예로는 무 세포 분석법 변환, 증폭 단백질 환상 (PMCA)를 미스 폴딩 및 변환 효율을 율 (CER) 10-14 분석을 포함한다. 이러한 분석 중 어느 것도 자연 감염 후 종 장벽에 관련된 계정 주변 요인을 고려하지 않지만, 모든 TSEs 잠재적으로 취약 호스트를 식별하는 데 유용 할 수 있습니다. 여기에서는 정상 뇌 균질 액으로부터 유도 두 변성 PRP C 기판이 벤치 탑 프리온 전환 반응에 사용되는 CER 분석 용 프로토콜, (도 1) (13)을 제시한다. pH를 7.4로 변성 기판 PRP C 만 종 장벽 (14)의 부재 하에서, 반응에 의해 시드 PRP TSE PRP 해상도로 전환시킬 수있다. 대조적으로, pH가 3.5에서 다른 기판에 PRP C 변성은 PRP 입술 다음 배양으로 변환 될 수 있도록어떤 종에서 PRP TSE로 변환을위한 제어 역할을합니다. pH가 3.5 기판의 pH가 7.4에 대해 기판의 PRP 입술에 PRP C의 변환의 비율은 종 장벽의 측정치를 제공한다. 우리는 CER 분석 다양한 TSEs에 실험실 쥐의 종 장벽 알려져을 예측 및 만성 소모성 질환 (CWD) 및 기타 TSEs 14 뿔양 등 다양한 포유 동물 종의 종 장벽을 예측하기위한 노력의 분석을 사용한 것을 발견했다 15. 유용이 방법을 찾을 수 TSE 종 장벽 또는 PRP C -to-PRP 해상도 변환의 평가를 신속하게 검사를 허용하는 도구에 관심 수사관.

<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris SDS-PAGE 젤</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0.5mm 지르코늄 옥사이드 비드</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>다른 종류의 비드도 효과적입니다</td></tr><tr><td>항체</td><td>다양한 공급업체</td><td></td><td>관심 종에서 PrPres의 면역블롯 검출을 위한 적절한 1차 및 2차 항체 선택</td></tr><tr><td>비드 균질화기</td><td>다음 Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>온도 제어 기능이 있는 고속</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>면 팁 어플리케이터</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Cuphorn 초음파 발생기</td><td>열 시스템-초음파</td><td>W-380</td><td>열 시스템-Ultrasonics, Inc.는 이제 Qsonica, LLC입니다</td></tr>.<tr><td> 소프트웨어 프로그램</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS 이미지 수집 및 분석 소프트웨어</td><td>NIH ImageJ와 같은 다른 프로그램도 작동합니다</td></tr><tr><td>Dounce 균질화 Kimble</td><td>Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>엔드 오버 엔드 믹서</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>유해 화학 물질 : 눈 자극</td></tr><tr><td>구아니딘 염산염, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>유해 화학 물질: 급성 독성, 피부 자극, 눈 자극</td></tr><tr><td>가열 블록</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>유해 화학 물질: 강산</td></tr><tr><td>리튬 도데실 설페이트 시료 버퍼, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>유해 화학 물질 : 피부 및 호흡기 자극, 심각한 눈 손상, 가연성 고체</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>유해 화학물질: 급성 독성, 가연성 액체</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>어떤 브랜드</td><td></td><td></td>든</tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L-5125</td><td>유해 화학 물질 : 급성 독성, 피부 자극, 눈 손상</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>유해 화학 물질 : 피부 자극, 눈 손상</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 젤 시스템</td><td>Life Technologies</td><td>NuPAGE 전기 영동 시스템</td><td>다른 SDS-PAGE 시스템도 작동합니다</td></tr><tr><td>PCR 튜브 (낮은 바인딩)</td> <td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>유봉 균질화 기</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐플루오라이드 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>유해 화학 물질: 피부 및 눈 자극, 호흡기 과민성, 장기 독성</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 샘플용 환원제, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 염화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>D6750</td><td>유해 화학 물질 : 급성 독성</td></tr><tr><td>도데실 황산나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>유해 화학 물질 : 급성 독성, 피부 자극, 눈 손상, 가연성 고체</td></tr><tr><td>수산화 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>유해 화학 물질; 강염기</td></tr><tr>주<td>사기</td><td>BD Biosciences</td><td>다양한</td><td>균질화 할 기질의 부피에 적합한 주사기 크기를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>주사기 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>써모셰이커(PCR 튜브 셰이커)</td><td>항저우 All Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>유해 화학 물질: 피부, 눈, 호흡기 자극</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>유해 화학 물질: 급성 독성, 눈 자극</td></tr><tr><td>볼텍서</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

와 전염성 해면상 뇌증 종 장벽 평가<em&gt; 체외</em&gt; 프리온 단백질 변환 분석

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

전염성 해면상뇌증(TSE, 프리온 질환)의 종간 전염을 이해하기 위한 연구는 일반적으로 장시간이 걸리고 비용이 많이 드는 생체 내 동물 도전 연구에 의존한다는 점에서 어렵습니다. 프리온 종 장벽을 측정하는 데 도움이 되는 많은 체외 분석법이 개발되어 동물 사용을 줄이고 동물 생물 분석보다 더 빠른 결과를 제공합니다. 여기에서는 CER(conversion efficiency ratio) 분석이라고 하는 신속한 체외 프리온 전환 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석에서 감염되지 않은 숙주 뇌의 세포 프리온 단백질(PrPC)은 pH 7.4와 3.5 모두에서 변성되어 두 개의 기질을 생성합니다. pH 7.4 기질에 TSE 제제를 배양하면 단백질 분해 효소 K (PK) 내성 상태로 전환되는 PrPC의 양이 TSE 제제에 대한 원래 숙주의 종 장벽에 의해 조절됩니다. 대조적으로, pH 3.5 기질의 PrPC는 TSE 제제에 의해 잘못 접힙니다. 두 기질에 있는 PK 내성 프리온 단백질의 양을 비교함으로써 숙주의 종 장벽을 평가할 수 있습니다. 우리는 CER 분석이 실험실 마우스의 알려진 프리온 종 장벽을 정확하게 예측한다는 것을 보여주고, 예를 들어 살쾡이(Lynx rufus)가 흰꼬리사슴(Odocoileus virginianus) 만성 소모성 질병 병원체에 취약할 수 있음을 시사하는 몇 가지 예비 결과를 보여줍니다.

CER 분석의 성공적인 사용은 전환 반응에 사용 된 기판 쌍의 품질에 크게 의존한다. 이러한 이유로, CER 기판 쌍을 제조 절차에 따라, 품질 관리는 면역 블롯 (도 2)이 수행되어야한다. 양 기판의 경우, 분석 면역에 의해 10 ~ 25 μL. PRP C는 각각의 기판에 용이하게 검출 할 수 있어야하며 PRP C 수준은 둘 사이의 대략 같아야한다. 면역 반응성은 20 kDa의 위 주로 볼 수 있지만, 작은 밴드는 또한 명백하다. 우리의 경험에 의하면, 작은 밴드의 존재는 종 의존한다. 저 분자량 제품이 발견되면, 이들의 존재는 두 기판 쌍으로 확인되어야한다. 그것은 그 CER 기판이 PK로 기판을 처리하여 (그림 2) 내생 PRP 해상도가 없음을 확인하는 것이 중요합니다. PRP 입술이 존재하는 경우, 동물 SUBST 사용속도 준비 T...

프리온 질병의 종간 전염에 대한 장벽을 측정하는 것은 까다로우며 일반적으로 동물 챌린지 또는 생화학적 분석이 포함됩니다. 여기에서는 종 장벽을 예측할 수 있는 능력을 가진 체외 프리온 단백질 전환 분석을 제시합니다.

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

본 절차의 전반적인 목표는 살아있는 동물에게 감염시키지 않고도 전염성 해면상뇌증(TSE)의 특정 종에 대한 종 간 장벽을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 인 비트로(in vitro) 분석에 사용할 두 가지 전환 분석 기질을 준비함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 이러한 기질을 테스트하고자 하는 TSE 인자와 함께 배양하는 것입니다.Proteinase K로 소화시킨 후, 샘플을 SDS-PAGE 및 면역 블로팅(immunoblotting)으로 분석합니다. 마지막 단계는 유세포 분석법(cytometry)을 사용하여 각 기질 내의 Proteinase K 내성 PreOn 단백질의 양을 측정하고, 전환 효율 비율(conversion efficiency ratio, CER)의 계산을 통해 이 양들을 비교하는 것입니다. 궁극적으로 CER은 테스트된 TSE가 기질을 준비한 숙주 종에 대해 가지는 종간 장벽(species barrier)의 척도를 제공합니다.이 분석법의 장점으로는 낮은 비용, 짧은 실험 기간, 그리고 살아있는 동물을 조직 샘플로 대체할 수 있다는 점 등이 있습니다. 이 방법은 야생동물 듀프 프리온 질병의 종간 장벽에 대한 통찰을 제공하는 데 매우 적합하지만, 관심 있는 다른 모든 종에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 기질 준비, 품질 관리 및 표준화 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.관심 종으로부터 감염되지 않은 건강한 뇌 조직을 얻은 후, 비드 밀(bead mill) 또는 막자와 유발을 사용하여 용해 버퍼(lysis buffer) 내에서 10% w/v 균질액을 준비합니다. 그 다음, 기질이 27 gauge 주사바늘을 통해 쉽게 흡입되고 배출될 수 있을 때까지 게이지가 점차 높아지는 바늘을 사용하여 주사기와 바늘로 균질액을 추가로 정제합니다. 다음으로, 뇌 균질액을 라벨이 부착된 별도의 플라스틱 원추형 튜브 두 개에 동일한 부피로 나누어 담고, 각 튜브에 3 M 구아니딘 염산염(guanidine hydrochloride)이 포함된 pH 3.5 또는 7.4의 PBS를 뇌 균질액과 1:1 부피 비율로 첨가합니다.이제 기질 용액의 pH 값을 확인하고, 필요한 경우 진한 염산이나 수산화나트륨을 사용하여 각 기질의 pH가 목표 pH의 ±0.05 범위 내에 유지되도록 조정하십시오. 상온에서 엔드-오버-엔드(end-over-end) 믹서로 용액을 5시간 동안 회전시키십시오. 그다음, 각 코니컬 튜브의 기질 용액에 4배 부피의 메탄올을 첨가하여 잘 섞어 단백질을 침전시키고, -20 °C에서 16~18시간 동안 배양하십시오.배양 후, 4°C에서 13,000 G로 30분 동안 원심분리하여 샘플을 침전시킵니다. 그다음 상층액을 조심스럽게 따라내어 버리고 펠릿에서 메탄올이 증발하도록 둡니다. 튜브 내벽에 달라붙은 메탄올을 흡수시키기 위해 면봉을 사용하십시오.펠렛이 너무 마르지 않도록 주의하십시오. 메탄올이 더 이상 보이지 않으면 다음 단계로 진행하고, 단백질 펠렛을 재현탁하기 위해 초기 뇌 균질액 양과 동일한 양의 전환 버퍼를 사용하십시오. 재현탁 후, 기질 용액을 10초 동안 짧게 초음파 처리하십시오.컵 혼(cup horn)을 사용하여 최대 출력의 약 30%로 초음파 처리합니다. 그 다음, 두 기질 모두에서 세포성 프리온 단백질이 proteinase K에 민감해야 하므로, 용액을 라벨이 부착된 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 0.5~1 mL씩 분주합니다. 각 기질 10~25 µL를 최종 농도 100 µg/mL의 proteinase K로 처리하고, 써모 셰이커(thermo shaker)에서 37 °C, 1000 RPM으로 1시간 동안 샘플을 소화시킵니다. proteinase K로 소화시킨 기질과 소화시키지 않은 각 기질 10~25 µL를 함께 로딩합니다.SDS-PAGE 젤에 전기영동한 후, 프리온 단백질 특이적 항체로 면역 블로킹하여 호스트 프리온 단백질, proteinase K 저항성 및 소화되지 않은 단백질 수준을 평가합니다. 이 이미지는 면역 블롯의 결과를 보여줍니다. 처음 두 레인은 소화되지 않은 기질을 포함하고 있으며, 오른쪽의 두 레인은 proteinase K로 소화된 기질을 포함하고 있습니다.pH 7.4 및 3.5 기질의 단백질 수치가 서로 약 10% 이내의 차이를 보이며 proteinase K에 내성이 없다면, 해당 기질 쌍은 CER 연구에 사용하기에 적합한 것입니다. 다른 분주액은 CER 분석을 수행할 때까지 -80°C에 보관하십시오. TSE 제제는 적절한 생물 안전 예방 조치를 취하고 기관 지침에 따라 취급해야 합니다. 관심 종으로부터 TSE 감염 뇌 조직을 확보한 후, 기질 쌍 준비에 이전에 사용했던 균질화 방법을 사용하여 pH 7.4의 1x PBS에서 10% w/v 균질액을 준비하십시오.결과물인 균질액을 0.5 mL 미세 원심분리 튜브에 100~300 µL 부피로 분주하고, CER 분석을 수행할 때까지 -80 °C에서 보관합니다. 시작하려면 pH 3.5 및 7.4의 비감염 CER 기질, 쌍 및 TSE 감염 시드 용액을 동일한 양으로 취해 얼음 위에 약 1시간 동안 두어 천천히 해동합니다. 해동 후 용액을 얼음 위에 유지한 상태에서, 각 기질 용액을 27G 주사기 바늘로 흡입하고 배출하여 다시 균질화합니다.그 다음, 각 TSE 감염 용액을 최대 출력의 약 30%에서 10초 동안 짧게 초음파 처리합니다. 이어서, 라벨이 부착된 저흡착 박벽 PCR 튜브에 CER 기질 95 µL를 피펫팅하여 전환 반응을 준비합니다. pH 7.4에서 준비된 CER 기질을 두 개의 튜브에 중복으로 넣고, pH 3.5에서 준비된 CER 기질 95 µL를 추가로 두 개의 튜브에 중복으로 넣습니다.그런 다음 pH 7.4 및 3.5 기질이 담긴 각 튜브 하나에 10%TSE 감염 씨앗 용액 5 µL를 첨가합니다. 이와 병행하여, 비특이적 비템플릿 전환을 대조하기 위해 pH 7.4 및 3.5 기질의 다른 튜브에 각각 전환 버퍼 5 µL를 첨가합니다. 또한, 입력 단백질분해효소 K 내성 프리온 단백질에 대한 대조군을 준비합니다.테스트할 각 TSE 인자마다, 대조군으로서 10% TSE 감염 시드 용액 5 µL를 변환 버퍼 95 µL에 추가합니다. 닫힌 PCR 튜브에 담긴 각 샘플을 짧게 볼텍싱하여 토우와 기질을 혼합합니다. 이어서 저속 벤치탑 미니 원심분리기로 짧게 원심분리하여 PCR 튜브 뚜껑에 맺힌 반응 혼합물을 제거합니다.PCR 튜브를 장착할 수 있는 벤치탑 서모 셰이커(thermo shaker)에 튜브를 넣고, 다음 날까지 37 °C에서 1000 RPM으로 24시간 동안 시료를 흔들어 줍니다. 그 후, Sarco Cell을 최종 농도 2% w/v로, Proteinase K를 최종 농도 100 µg/mL로 첨가합니다. 서모 셰이커에서 37 °C, 1000 RPM으로 1시간 동안 시료를 분해합니다. SDS-PAGE 샘플 버퍼를 첨가하고, 시료를 95 °C에서 10분 동안 가열한 후, 각 시료에 남아 있는 Proteinase K 저항성 PrPOn 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 이전과 동일하게 면역 블로팅(immuno blotting)을 수행합니다. 마지막으로, 종간 장벽의 척도로서 전환 효율 비율을 계산합니다.서면 프로토콜의 지침에 따라 pH 7.4 또는 3.5로 준비된 마우스 CER 어세이 기질을 RML 마우스 적응형 scrapy, 집양 classical scrapy, 흰꼬리사슴 만성 소모성 질병 또는 263K 햄스터 적응형 scrapy 균주와 함께 배양하였습니다. CER 어세이에서 'none'으로 표시된 대조군 샘플에는 동일한 양의 감염원이 포함되었으며, 어떤 마우스 기질 샘플도 단클론 항체 SAF 83을 이용한 면역 블롯으로 proteinase K 내성 프리온 단백질의 존재 여부를 분석하지 않았습니다.각 샘플의 가공되지 않은 tric 값은 각 레인의 단백질 분해 효소 처리 결과 아래에 표시되어 있습니다. K 저항성 프리온 단백질 수준은 pH 7.4에서 변성되어 다양한 TSE 인자와 접촉한 마우스 기질 전체에서 다양하게 나타났습니다. pH 3.5에서 변성되어 TSE 인자와 접촉한 모든 기질에서 pronase K 저항성 프리온 단백질이 발견되었으며, 이 막대 그래프는 최소 3회의 독립적인 분석 실행을 바탕으로 각 감염성 인자에 대해 pH 7.4와 3.5 마우스 기질 간의 평균 비율과 표준 편차를 보여줍니다.소문자는 분산 분석(analysis of variance)을 통해 p 값이 0.05 미만으로 결정된 통계적으로 동질한 하위 집단을 나타냅니다. Tookie Kramer 최소 유의 차이법을 사용하였습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 48시간 이내에 완료할 수 있습니다. CER 분석은 TSE 종 간 장벽의 존재 여부에 대한 초기 평가로 사용할 수 있으며, 이를 통해 살아있는 동물을 대상으로 하는 추가 연구의 필요성 여부를 결정할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면 기질을 준비하고, 전환 반응을 설정하며, 종간 장벽을 평가하기 위한 전환 효율 비율을 계산하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기 우리는 즉시 정화하여 intraperitoneal 접종 다음과 찬란 다음 주사 사이트에서 자신의 이해와 움직임을 모니터링하고 이러한 이벤트를 중재 전지 특성화 감염 두뇌 자료에서 집계 프리온 봉 라벨 면역 세포 프리온 이해와 인신 매매를 감시를위한 소설 분석을 설명합니다.

Intraperitoneal 감염 후 면역 세포의 인신 매매 형광등 프리온 로즈 시간을 모니터링

단백질 misfolding의 순환 증폭 (PMCA)는 prion 변환과 변형 및 종 장벽의 연구에서 시험 관내 분석이다. 또한 prion 검출 분석으로 사용할 수 있습니다.

Prions의 단백질 Misfolding의 순환 증폭

단백질 분해 효소로 배양하여 정상적인 프리온을 소화하고 저항성 응집체는 그대로 둡니다.

웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 이용한 마우스 뇌 조직에서 잘못 접힌 프리온 단백질 응집체 검출

청소부는 질병이없는 지역에 자신의 배설물에 전염성 전염성 해면상 뇌증의 프리온을 이동시키다 수있는 가능성이있다. 우리 마우스 적응 스크래피 프리온은 미국의 까마귀의 소화 기관 (까마귀 brachyrhynchos), 죽은 동물의 일반적인 소비자 비록 통과 후 감염성 유지 여부를 확인하는 데 사용 세부 방법.

조류 종의 소화 기관을 통과 한 후 감염성 프리온을 확인하기위한 절차

단백질 응집체의 프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

여기, 우리는 간단, 신속 하 고 효율적인 프리온 증폭 기술, 실시간 떨게 유발 변환 (RT-QuIC) 메서드를 설명 하는 프로토콜을 제시.

실시간 떨게 유발 CWD Prions 지저분한 자료의 검색을 위한 변환 분석 결과

면역조직화학 프로토콜을 사용하여 비정상 프리온 단백질을 면역표지하려면 특정 샘플 및 항-PrP 항체 준비 방법론이 필요합니다. 본 프로토콜은 적절한 PrP 면역표지를 보장하고 비특이적 배경 염색을 최소화하기 위한 에피토프 마스킹의 주요 단계를 설명합니다. 또한, 이 접근법은 프리온 감염 조직으로 면역조직화학 연구를 수행할 때 생물학적 안전성 조치를 고려합니다.

면역조직화학에 의한 비정상적인 프리온 단백질 검출

실험실 환경에서 일반적으로 사용되는 영역을 프리온 오염 및 효과적인 오염 제거를 평가하는 방법은 부족합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 실험실의 개별 요구 사항을 충족하도록 쉽게 수정할 수 있는 실험실 프리온 안전 스와이프 테스트를 구현하기 위한 핵심 기본 사항을 제공합니다.

Prion 안전 연구소 스와이프 테스트

우리는 PTSD 환자의 특징 neuroendocrine 기능의 영구적 인 변경 및 지연, 장기, 과장된 공포 반응을 보여 후 외상 후 스트레스 장애 (PTSD)의 쥐 모델을 설명합니다. 동물 모델과 여기에 설명 된 방법은 기계론의이지만 주변 흰색 혈액 세포의 생체과 함께, 환자로 측정 할 수없는 뇌 핵에 생체, 수를 상호 연관 유용합니다.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

학습하세요 전염성 해면상 뇌증의 종 간 장벽을 평가하는 체외 프리온 단백질 변환 분석법을. 변환 효율 비율(CER)을 측정하여 생물학적 위험을 예측하고 동물 실험을 대체하는 효율적인 방법입니다.

와 전염성 해면상 뇌증 종 장벽 평가

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