와 전염성 해면상 뇌증 종 장벽 평가

본 절차의 전반적인 목표는 살아있는 동물에게 감염시키지 않고도 전염성 해면상뇌증(TSE)의 특정 종에 대한 종 간 장벽을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 인 비트로(in vitro) 분석에 사용할 두 가지 전환 분석 기질을 준비함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 이러한 기질을 테스트하고자 하는 TSE 인자와 함께 배양하는 것입니다.

Proteinase K로 소화시킨 후, 샘플을 SDS-PAGE 및 면역 블로팅(immunoblotting)으로 분석합니다. 마지막 단계는 유세포 분석법(cytometry)을 사용하여 각 기질 내의 Proteinase K 내성 PreOn 단백질의 양을 측정하고, 전환 효율 비율(conversion efficiency ratio, CER)의 계산을 통해 이 양들을 비교하는 것입니다. 궁극적으로 CER은 테스트된 TSE가 기질을 준비한 숙주 종에 대해 가지는 종간 장벽(species barrier)의 척도를 제공합니다.

이 분석법의 장점으로는 낮은 비용, 짧은 실험 기간, 그리고 살아있는 동물을 조직 샘플로 대체할 수 있다는 점 등이 있습니다. 이 방법은 야생동물 듀프 프리온 질병의 종간 장벽에 대한 통찰을 제공하는 데 매우 적합하지만, 관심 있는 다른 모든 종에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 기질 준비, 품질 관리 및 표준화 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.

관심 종으로부터 감염되지 않은 건강한 뇌 조직을 얻은 후, 비드 밀(bead mill) 또는 막자와 유발을 사용하여 용해 버퍼(lysis buffer) 내에서 10% w/v 균질액을 준비합니다. 그 다음, 기질이 27 gauge 주사바늘을 통해 쉽게 흡입되고 배출될 수 있을 때까지 게이지가 점차 높아지는 바늘을 사용하여 주사기와 바늘로 균질액을 추가로 정제합니다. 다음으로, 뇌 균질액을 라벨이 부착된 별도의 플라스틱 원추형 튜브 두 개에 동일한 부피로 나누어 담고, 각 튜브에 3 M 구아니딘 염산염(guanidine hydrochloride)이 포함된 pH 3.5 또는 7.4의 PBS를 뇌 균질액과 1:1 부피 비율로 첨가합니다.

이제 기질 용액의 pH 값을 확인하고, 필요한 경우 진한 염산이나 수산화나트륨을 사용하여 각 기질의 pH가 목표 pH의 ±0.05 범위 내에 유지되도록 조정하십시오. 상온에서 엔드-오버-엔드(end-over-end) 믹서로 용액을 5시간 동안 회전시키십시오. 그다음, 각 코니컬 튜브의 기질 용액에 4배 부피의 메탄올을 첨가하여 잘 섞어 단백질을 침전시키고, -20 °C에서 16~18시간 동안 배양하십시오.

배양 후, 4°C에서 13,000 G로 30분 동안 원심분리하여 샘플을 침전시킵니다. 그다음 상층액을 조심스럽게 따라내어 버리고 펠릿에서 메탄올이 증발하도록 둡니다. 튜브 내벽에 달라붙은 메탄올을 흡수시키기 위해 면봉을 사용하십시오.

펠렛이 너무 마르지 않도록 주의하십시오. 메탄올이 더 이상 보이지 않으면 다음 단계로 진행하고, 단백질 펠렛을 재현탁하기 위해 초기 뇌 균질액 양과 동일한 양의 전환 버퍼를 사용하십시오. 재현탁 후, 기질 용액을 10초 동안 짧게 초음파 처리하십시오.

컵 혼(cup horn)을 사용하여 최대 출력의 약 30%로 초음파 처리합니다. 그 다음, 두 기질 모두에서 세포성 프리온 단백질이 proteinase K에 민감해야 하므로, 용액을 라벨이 부착된 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 0.5~1 mL씩 분주합니다. 각 기질 10~25 µL를 최종 농도 100 µg/mL의 proteinase K로 처리하고, 써모 셰이커(thermo shaker)에서 37 °C, 1000 RPM으로 1시간 동안 샘플을 소화시킵니다. proteinase K로 소화시킨 기질과 소화시키지 않은 각 기질 10~25 µL를 함께 로딩합니다.

SDS-PAGE 젤에 전기영동한 후, 프리온 단백질 특이적 항체로 면역 블로킹하여 호스트 프리온 단백질, proteinase K 저항성 및 소화되지 않은 단백질 수준을 평가합니다. 이 이미지는 면역 블롯의 결과를 보여줍니다. 처음 두 레인은 소화되지 않은 기질을 포함하고 있으며, 오른쪽의 두 레인은 proteinase K로 소화된 기질을 포함하고 있습니다.

pH 7.4 및 3.5 기질의 단백질 수치가 서로 약 10% 이내의 차이를 보이며 proteinase K에 내성이 없다면, 해당 기질 쌍은 CER 연구에 사용하기에 적합한 것입니다. 다른 분주액은 CER 분석을 수행할 때까지 -80°C에 보관하십시오. TSE 제제는 적절한 생물 안전 예방 조치를 취하고 기관 지침에 따라 취급해야 합니다. 관심 종으로부터 TSE 감염 뇌 조직을 확보한 후, 기질 쌍 준비에 이전에 사용했던 균질화 방법을 사용하여 pH 7.4의 1x PBS에서 10% w/v 균질액을 준비하십시오.

결과물인 균질액을 0.5 mL 미세 원심분리 튜브에 100~300 µL 부피로 분주하고, CER 분석을 수행할 때까지 -80 °C에서 보관합니다. 시작하려면 pH 3.5 및 7.4의 비감염 CER 기질, 쌍 및 TSE 감염 시드 용액을 동일한 양으로 취해 얼음 위에 약 1시간 동안 두어 천천히 해동합니다. 해동 후 용액을 얼음 위에 유지한 상태에서, 각 기질 용액을 27G 주사기 바늘로 흡입하고 배출하여 다시 균질화합니다.

그 다음, 각 TSE 감염 용액을 최대 출력의 약 30%에서 10초 동안 짧게 초음파 처리합니다. 이어서, 라벨이 부착된 저흡착 박벽 PCR 튜브에 CER 기질 95 µL를 피펫팅하여 전환 반응을 준비합니다. pH 7.4에서 준비된 CER 기질을 두 개의 튜브에 중복으로 넣고, pH 3.5에서 준비된 CER 기질 95 µL를 추가로 두 개의 튜브에 중복으로 넣습니다.

그런 다음 pH 7.4 및 3.5 기질이 담긴 각 튜브 하나에 10%TSE 감염 씨앗 용액 5 µL를 첨가합니다. 이와 병행하여, 비특이적 비템플릿 전환을 대조하기 위해 pH 7.4 및 3.5 기질의 다른 튜브에 각각 전환 버퍼 5 µL를 첨가합니다. 또한, 입력 단백질분해효소 K 내성 프리온 단백질에 대한 대조군을 준비합니다.

테스트할 각 TSE 인자마다, 대조군으로서 10% TSE 감염 시드 용액 5 µL를 변환 버퍼 95 µL에 추가합니다. 닫힌 PCR 튜브에 담긴 각 샘플을 짧게 볼텍싱하여 토우와 기질을 혼합합니다. 이어서 저속 벤치탑 미니 원심분리기로 짧게 원심분리하여 PCR 튜브 뚜껑에 맺힌 반응 혼합물을 제거합니다.

PCR 튜브를 장착할 수 있는 벤치탑 서모 셰이커(thermo shaker)에 튜브를 넣고, 다음 날까지 37 °C에서 1000 RPM으로 24시간 동안 시료를 흔들어 줍니다. 그 후, Sarco Cell을 최종 농도 2% w/v로, Proteinase K를 최종 농도 100 µg/mL로 첨가합니다. 서모 셰이커에서 37 °C, 1000 RPM으로 1시간 동안 시료를 분해합니다. SDS-PAGE 샘플 버퍼를 첨가하고, 시료를 95 °C에서 10분 동안 가열한 후, 각 시료에 남아 있는 Proteinase K 저항성 PrPOn 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 이전과 동일하게 면역 블로팅(immuno blotting)을 수행합니다. 마지막으로, 종간 장벽의 척도로서 전환 효율 비율을 계산합니다.

서면 프로토콜의 지침에 따라 pH 7.4 또는 3.5로 준비된 마우스 CER 어세이 기질을 RML 마우스 적응형 scrapy, 집양 classical scrapy, 흰꼬리사슴 만성 소모성 질병 또는 263K 햄스터 적응형 scrapy 균주와 함께 배양하였습니다. CER 어세이에서 'none'으로 표시된 대조군 샘플에는 동일한 양의 감염원이 포함되었으며, 어떤 마우스 기질 샘플도 단클론 항체 SAF 83을 이용한 면역 블롯으로 proteinase K 내성 프리온 단백질의 존재 여부를 분석하지 않았습니다.

각 샘플의 가공되지 않은 tric 값은 각 레인의 단백질 분해 효소 처리 결과 아래에 표시되어 있습니다. K 저항성 프리온 단백질 수준은 pH 7.4에서 변성되어 다양한 TSE 인자와 접촉한 마우스 기질 전체에서 다양하게 나타났습니다. pH 3.5에서 변성되어 TSE 인자와 접촉한 모든 기질에서 pronase K 저항성 프리온 단백질이 발견되었으며, 이 막대 그래프는 최소 3회의 독립적인 분석 실행을 바탕으로 각 감염성 인자에 대해 pH 7.4와 3.5 마우스 기질 간의 평균 비율과 표준 편차를 보여줍니다.

소문자는 분산 분석(analysis of variance)을 통해 p 값이 0.05 미만으로 결정된 통계적으로 동질한 하위 집단을 나타냅니다. Tookie Kramer 최소 유의 차이법을 사용하였습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 48시간 이내에 완료할 수 있습니다. CER 분석은 TSE 종 간 장벽의 존재 여부에 대한 초기 평가로 사용할 수 있으며, 이를 통해 살아있는 동물을 대상으로 하는 추가 연구의 필요성 여부를 결정할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면 기질을 준비하고, 전환 반응을 설정하며, 종간 장벽을 평가하기 위한 전환 효율 비율을 계산하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.