Name: 마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 마우스 해마 치아회(dentate gyrus) 단일 세포의 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 ex utero 전기천공 및 오가노타이픽 슬라이스 배양 기법을 통해 신경발달 과정을 실시간으로 추적하고 분석하는 방법을.

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이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft에서 SB에 대한 보조금으로 지원되었습니다(BR-2215; SFB 497/A9).

참고 : 모든 동물 실험은 독일의 법에 따라 수행하고, 튀빙겐에있는 정부 기관에 의해 승인되었다. 마이크로 피펫, 솔루션 및 막 1. 준비 <ol><li> 마이크로 피펫의 준비 <ol><li> 다음 프로그램으로 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 마이크로 피펫을 당겨 : 열을 : (540), 당기 : 125, 속도 : 20 및 지연 : (140) 바늘 길이의 양을 5.5 cm에. </li><li> microgrinder를 이용하여 베벨 바늘 4mm의 적절한 크기의 팁을 얻었다. 팁의 손상을 방지하기 위해 상자 또는 15cm 페트리 접시에 바늘을 저장합니다. </li></ol></li><li> 솔루션의 준비 <ol><li> 플라스미드 DNA 솔루션 <ol><li> 제조사의 프로토콜에 따라 엔도톡신을 준비 자유 맥시 키트를 이용하여 소망하는 cDNA 구조체를 포함하는 플라스미드 DNA를 준비한다. </li><li> 플라스미드 DNA (GFP 스파이크 벡터 없음) 3 ㎍ / ㎕의 최종 농도로 용액을 조정 또는 4 ㎍ /μl의 독소에 (GFP 스파이크 벡터의 1 μg의와) 빠른 그린 (최종 농도 0.05 %)를 포함 트리스 - EDTA 버퍼를 확보. </li></ol></li><li> 라미닌 원액 <ol><li> 1 ml의 최종 용적에 멸균 수 라미닌 1mg을 녹인다. -80 ° C에서 100 ㎕를 분주하고 저장을 준비합니다. </li></ol></li><li> 폴리 -L- 라이신 원액 <ol><li> 1 mg / ml의 최종 농도로 멸균 물 50 ㎖ 중의 폴리 L 리신 50mg을 녹인다. -20 ° C에서 1 분취 량 및 저장을 준비합니다. </li></ol></li><li> 행크의 균형 소금 솔루션을 완료 (전체 HBSS) <ol><li> CaCl2를 10 ㎖의 100 mM이 황산을 10 배 HBSS 100 ㎖, 1 M HEPES 완충액 2.5 ml를 (PH 7.4), 1 M D 글루코스 30 ㎖, 100 mM의 10ml를 조합하여 완전한 HBSS를 준비하고, (4) 1 ml의 M의 NaHCO3. 4 ° C에서 1 L 및 저장에 멸균 업을 추가합니다. 참고 : 오토 클레이브는 모든 솔루션은 1 M HEPES 버퍼링 기대 한 M D-포도당, FIL 있습니다터 멸균. </li></ol></li><li> 슬라이스 문화 매체 <ol><li> 에 기초 배지 이글 35 ㎖, 완전한 HBSS 12.9 ㎖ (1.2.4), 1 M D 글루코스 1.35 ㎖, 200 mM의 L- 글루타민, 250 μL, 그리고 500 μL 첨가함으로써 슬라이스 배양 배지를 준비 페니실린 - 스트렙토 마이신 50 ㎖의 최종 부피를 얻었다. 4 ° C에서 최종 5 %의 농도와 저장소에 말 혈청을 추가합니다. </li></ol></li><li> 낮은 녹는 점 (LMP) 아가로 오스 <ol><li> 아가로 높은 전력에서 1~2 분 동안 전자 레인지에서 가열 하였다 완전한 HBSS 50 ㎖ (1.2.4)에 LMP의 2g을 첨가하여 4 % LMP 아가 용액을 준비한다. 39 °의 C - 37에서 물을 욕조에이 솔루션을 유지합니다. 4 ° C와 재사용의 솔루션을 저장합니다. </li></ol></li><li> 파라 포름 알데히드 솔루션 <ol><li> 흄 후드에서 1X PBS 100 ㎖에 파라 포름 알데히드 4g을 첨가하여 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 제조 하였다. 60 ° C로 가열하고 용액 용액 C가 될 때까지 1 N NaOH를 몇 방울을 가하여리어. </li></ol></li><li> 투과성으로 해결 <ol><li> 4 ℃에서 0.3 % Trition X-100을 함유하는 저장소와 1X PBS 300 ㎖의 BSA의 9g 녹인다. 장기간 보관시 10 % 아 지드 화 나트륨을 추가한다. </li></ol></li></ol></li><li> 막 삽입의 코팅 <ol><li> 12 ml의 최종 부피 라미닌 스톡 용액 (1.2.2)와 멸균 수 폴리 -L- 라이신 스톡 용액 (1.2.3)의 일 분취 한 분취 량을 희석. </li><li> 멸균의 각 웰 포함 2 ml로 6 웰 플레이트에 막 삽입을 놓습니다. 멤브레인 위에 코팅 용액 1 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 O / N을 배양한다. </li><li> 배양 후 막을 멸균 건조 1 ㎖로 3 회 삽입 씻는다. 마른 6 웰 플레이트에서 4 주 4 ° C에서 같은 날 또는 저장소의 코팅 막 삽입을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 2. DNA 주입 및 E15.5의 일렉트로와 E18.5 태아 <ol><li&gt; 5 % 이소 플루 란 포화 기화기에 접속 마취 챔버 내에 배치하여 암컷 마우스를 교배 시간 마취. 1 L / min의 속도로 이소 플루 란과 산소를​​ 순환. 2-4 분 동안 또는 마우스의 발 사이에 집어 테스트하는 의식이 될 때까지 상자에 동물을 유지합니다. </li><li> 배아 일에 자궁 경부 전위 (E) 15.5 또는 18.5에 의해 무의식 마우스를 안락사. 배아 (13)를 포함하는 자궁을 해부 차가운 완벽한 HBSS의 15 ~ 20 ml의를 포함하는 페트리 접시에 놓습니다. 참고 : 이후이 시점에서, 얼음의 배아와 조직을 유지. </li><li> 차가운 완벽한 HBSS를 포함하는 두 번째 페트리 접시에 자궁 뿔과 장소에서 각각의 배아를 분리하는 가위를 사용합니다. </li><li> 해부 현미경, 자궁 근육의 벽과 미세 집게 (# 55)와 가위를 사용하여 태반을 끊다. 조심스럽게 난황에서 배아를 놓습니다. </li><li> decapitat에 본의 가위를 사용하여단지 60 ° 각도로 앞다리 위의 전자 배아. 실험은 배아의 유전자형을 필요로하는 경우, 게놈 DNA의 분리를위한 조직 샘플 (꼬리의 작은 조각)를 수집합니다. </li><li> 깨끗하고 건조한 페트리 접시에 머리를 전송합니다. 머리가 60 ° 각도에서 참수되었다 때문에 지느러미 쪽을 배치 할 때, 머리는 한쪽으로 기울해야합니다. </li><li> 브레 그마에 반구 주변의 중앙으로 조심스럽게 바늘을 놓습니다 (그림 1A, B). 5-8 펄스를인가, 펄스 당 10 ~ 15 msec의 지속 기간 동안 압력을 30 파운드를 사용 picospritzer III의 페달을 밟아 DNA 용액 (3 또는 4 ㎍ / μL로) 약 2-3 μl를 주입한다. 펄스의 지속 시간과 수는 더 많은 시간을 필요로하는 작은 개구를 가진 바늘 개구의 직경에 의존한다. 각 펄스 사이의 간격은 1 초에 달한다. </li><li> 전극을 배치하기 전에, EMBR의 머리에 완전한 HBSS 몇 방울을 적용요. &#39;음&#39;말단은 주입 뇌실 태아의 머리 (도 1C, D)의 귀 아래 주입 심실의 반대측 &#39;긍정적 인&#39;전극과 동일한 측에있는 방식으로 전극을 배치. 50 V. 5 펄스를 적용 <ol><li> E 18.5에 대한 E 15.5에 대한 3mm 전극과 5mm 전극을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 뇌의 해부 (3) <ol><li> 전기 천공 후, 미세 포셉 쌍의 도움으로 헤드로부터 피부를 떼어. 스프링 가위를 사용하여 두개골의 정중선 소뇌의 중간에 작은 절개 부위를 만든다. </li><li> 절개에 봄 가위를 삽입하고 시상 봉합을 따라 길이 방향으로 절단. 두개골을 벗겨 미세 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 분리합니다. 15 ~ 20 ml의 차가운 완벽한 HBSS 용액에 뇌 전체를 전송합니다. </li><li> 한편, 4 % LMP 아가 부어껍질 멀리 금형에, 물을 욕조에 37 ~ 39 ℃로 유지했다. </li><li> 작은 국자를 주걱으로 전체 HBSS 중 뇌를 타고 고급 티슈 또는 Kimwipes를 사용하여 HBSS를 초과하는 드레인. </li><li> 아가로 오스에 부드럽게 뇌 전체를 놓고 미세 바늘의 위치를​​ 조정합니다. 아가로 오스가 응고하고 블록 (관상 섹션의 후각 전구가 포인트) 절단 될 때까지 얼음에 금형을 보관하십시오. </li></ol> 4.에 vibratome 단면 및 슬라이스 문화 <ol><li> LMP 아가로 오스 블록을 잘라 내고 &#39;강력 접착제&#39;를 이용하여 시편 단계에 붙입니다. 접착제는 전사 후 건조에 vibratome의 버퍼 트레이 표본 스테이지이고 블록이 용액에 침지를 완료 할 때까지 HBSS 차가운 얼음 채우기. 참고 : 단면 전에 70 % 에탄올로 모든 악기 및 장비 표면을 소독. </li><li> 다음과 같은 새로운 블레이드를 사용하여 250 μm의 두께에 vibratome 섹션을 준비합니다. <ol><li> 블록 위스콘신 트림다음 설정 번째; 주파수 - 60 Hz의 진폭 - 0.7 μm의 속도 16-18mm / 초. 느린 속도 (9mm / 초)에서 위의 설정으로 원하는 조직을 포함하는 부분을 잘라. 후뇌에서 절편 시작, 대뇌에서 5-7 섹션을 수집합니다. </li><li> 구부러진 주걱의 도움으로 HBSS를 완료하고 모든 섹션 (그림 1E) 수집까지 얼음 계속 차가운 얼음 5 mL를 함유 한 깨끗한 6 웰 배양 접시에 섹션을 전송합니다. </li></ol></li><li> 섹션의 배향을 용이하게하기 위해, 멤브레인 부분을 배치하기 전에 완전한 HBSS 100 ㎕와 교차 방식으로 멤브레인 적셔. </li><li> (막에 섹션을 밀어 집게를 사용하여 다음 집게로 부분의 모서리를 선택하고 주걱에 끌어와) 막에 구부러진 주걱을 사용하여 섹션을 전송합니다. 한 막에 5 절까지 놓고 (집게를 사용하여 그림 1 층을 마련). 서로 절을 중복하지 마십시오. <ol><li> 피펫을 사용하여 막 떨어져 HBSS의 초과를 가져 가라. 여기에 사용 된 특정 멤브레인들은 프레임에 부착되고, 티슈 접촉하지만 매체에 의해 커버 할 수없는 조직 배양 플레이트에 삽입된다. </li></ol></li><li> 슬라이스 배양 배지 (1.2.5) (그림 1G, H)의 1.8 ml를 포함하는 6 웰 플레이트에 막 삽입을 놓습니다. 11 DIV 14 DIV 5 % CO 2와 37 ° C에서 배양 접시를 품어. 절반 매체 (0.9 ml)을 격일로 변경합니다. 주 :이 단계에서 브로 모데 옥시 우리 딘 시약을 추가 (BrdU의 10 μM 최종 농도)를 라벨링 배양 시간의 처음 20 시간 동안 미디어에 대한 세포 증식. </li></ol> 면역 형광 염색법에 이어 섹션 5. 고정 <ol><li> 잘라 깨끗하고 날카로운 메스 블레이드를 사용하여의 방향에 따라 막 트림섹션. </li><li> 4 % PFA (1.2.7) 1 ㎖를 함유하는 24 웰 플레이트에 막과 함께 전송 섹션. 15 분 각 1X PBS로 3 회 세척 한 다음 실온에서 1 시간 동안 섹션을 품어. 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 투과성으로 솔루션 섹션 O / N을 품어. </li><li> 다음 날, 투과성으로 용액에 희석 적절한 차 항체와 섹션을, 부화, O / N 또는 교반과 4 ° C에서 48 시간 동안. </li><li> 1X PBS로 15 분간 섹션 3 회 세척하고 투과성으로 용액에 희석 적절한 보조 항체와 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 이차 항체와 배양 후, 10 분 동안 DAPI 염색 한 다음 15 분 동안 1X PBS로 한 번 섹션을 씻는다. </li><li> 15 분 각각의 섹션을 1X PBS로 3 회 세척하고 슬라이드를 현미경에 전송합니다. ImmunoMount를 추가하고 부드럽게 섹션의 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 4 ° C와 자체에서 슬라이드 O / N을 건조매니큐어와 알. 참고 : 항상 4 ° C에서 슬라이드를 유지합니다. <ol><li> 공 초점 현미경 (그림 1I)에 의해 슬라이스 문화를 분석합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li>
<li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus%3A+what+we+are+learning+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li>
<li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li>
<li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li>
<li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li>
<li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+of+Bcl11b%2FCtip2+in+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li>
<li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li>
<li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19(2002).</li>
<li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li>
<li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li>
<li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmoplakin%3A+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li>
<li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants%3A+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

해마는 학습과 기억에 중요한 기능을 가지고있다. 치아 이랑도 신경이 개발하는 동안뿐만 아니라 성인기에 걸쳐뿐만 아니라 발생 두 뇌 영역 중 하나입니다. 산후 많은 공통 요소를 포함하는 유사한 방식으로 성인 해마 신경 진행한다. 이러한 요소의 규제 메커니즘을 정의하는 것은 다시 새로운 치료법 및 예방 조치로 이어질 것입니다 신경 퇴행성 질환을 이해하는데 매우 도움이 될 것입니다. 이 정보를 얻으려면 하나의 세포를 조작하고 Organotypic 슬라이스 문화 뒤에 전 자궁 내 전기에 의해 입증 된 바와 같이 그 나라의 환경에서 관찰 할 수있는 시스템이 필요합니다. 예 자궁 전기가 성공적으로 피질 개발 11,16 공부에 처음 적용되었다. 해마 개발 Bcl11b의 역할을 검사 우리가 알기로는 D의 첫 번째 설명 전직 자궁 전기입니다치아에 NA 조직 8 이랑. 우리는 피질 개발 (11, 1...

해마는 기억과 학습에 중요한 역할뿐만 아니라 감정적 인 행동을한다. 하나의 주 기능은 신경계의 높은 소성을 필요로 장기 메모리로 단기 메모리의 통합으로 구성. 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)는 입력 정보에 대한 기본 게이트웨이 역할을하고 성인이 1, 2를 통해 또한 지속적인 신경 두 개의 뇌 영역 중 하나입니다. 해마 구조의 개발이 늦은 배아 발생 동안, 특히 제 3-4주 산후 3 중에 발생한다. 치아의 초기 개발 과정에서 줄기 세포 풀이 성인 신경 4뿐만 아니라 산후에 필요한 설립 이랑. 생후 개발 뉴런뿐만 아니라 성인 신경시 미성숙 최종적 성숙한 신경 전구 세포에 대한 여러 단계를 통해 줄기 세포에서 다양한 단계를 통과. 신경의 발현의 다른 단계에서특정 유전자는 해마 회로 5,6에 성숙하고 새로운 뉴런의 통합을 허용 할 필요가있다. 이 유전자의 많은의 발현 패턴과 함수를 정의 허용 마우스 유전학과 면역 조직 화학 염색에 의한 표현형 분석뿐만 아니라 분자 방법을 사용. 또한 마이크로 어레이 분석뿐만 아니라 크로 마틴 면역 침강 (에 칩)에서 잠재적 인 직접 및 간접 표적 유전자 7,8에 대한 정보를 제공합니다. 그러나, 치아 이랑의 특정 개발에 해마 개발의 규제 메커니즘에 관한 많은 오픈 질문은 여전히​​ 존재한다. 하향 또는 상향 조절 (up-regulation)의 관심 및 / 또는 표적 유전자 개발 중에 그들의 운명을 따르의 유전자 중 특정 유전자가 세포의 적은 수의 조작을 허용하는 필요한 시스템을 조절하는 방법을 추가 통찰력을 얻기 위해. 자궁 일렉트로에서 shRNA를, 관심 또는 Cre 호텔 recombina의 유전자의 cDNA그 자체는 도구를 제공합니다. 전기 천공에 사용되어야 원하는 DNA 또는 RNA를 작은 발현 플라스미드의 존재를 확인한다. 이 접근법은 매우 성공적으로 인해 깊은 뇌 해마 레이어 구조의 위치로 치아 이랑의 개발을 검토 더 도전 접근법을 개발 피질 9,10 공부에서 구현되지만된다. Organotypic 슬라이스 문화 다음 예 자궁 전기는이 문제 (11, 12)을 우회하는 한 방법입니다. 대조적으로 자궁 전기가 아닌 전체 배아 만 머리 따라서 해마 치아 이랑 (dentate gyrus)을 향해 shRNA를 / DNA를 직접 할 수있는 더 유리한 방법으로 전극을 배치 할 수 있도록 사용됩니다에서. 우리 그룹은 성공적으로 치아 이랑 (dentate gyrus) 개발 (8) 중에 전사 인자 Bcl11b의 역할을 연구하기 위해 전 자궁 전기를 사용. Bcl11b는 R로 치아 이랑 (dentate gyrus) 개발의 이중 역할을면역 조직 화학에 의해 입증 된 바와 같이 선조 세포의 증식뿐 아니라 분화 egulating. 이러한 과정에서 상기 Bcl11b 관여하는 구조를 정의한, Polleux 기 11,12의 프로토콜은 프로토콜 부분에서 후술하는 바와 같이 치아 이랑 (dentate gyrus)을 연구하기 위해 조절 하였다. 첫번째 접근법에서 질문 Bcl11b 자율적 신경 세포 분화 세포를 조절할지 여부를 해결 하였다. 두 번째 방법은 Desmoplakin, Bcl11b의 직접적인 표적 유전자가, Bcl11b 표현형을 구출 할만큼 충분한 지 여부를 조사했다.

<table><tbody><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments Company (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fine Glass Pipettes</td><td>Warner Instruments</td><td>G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige, Japan</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>마취 브래킷 유닛</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Halovet Vaporizer</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac System</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>마취 챔버</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>디스크 전극이 있는 핀셋</td><td>BEX Company</td><td>LF650P3</td><td>3mm 전극 디스크 전극이 있는 E15.5</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td>용 5mm 전극 <td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650V 진동 블레이드 마이크로톰, 230V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>라이카</td><td>Leica DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr><tr><td>6웰 디쉬</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>6웰 디쉬</td><td>CELLSTAR</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인서트</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>시그마</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마</td><td></td><td></td>#L2020</tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technology</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Life Technology</td><td>41010-26</td><td></td></tr></tbody></table>년

마우스 해마 조직의 예 자궁 electroporation에와 organotypic 슬라이스 문화

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics는 발달 과정에서 특정 유전자의 역할을 결정하는 강력한 도구를 제공합니다. 면역조직화학 및 분자 방법에 의한 결과 표현형을 분석하면 잠재적인 표적 유전자 및 신호 경로에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 특정 조절 메커니즘을 추가로 규명하기 위해서는 특정 유전자의 과발현, 절제 또는 재도입을 통해 특정 조직의 소수의 세포만 조작하고 발달 과정에서 그들의 운명을 따를 수 있는 시스템이 필요합니다. 이를 달성하기 위해 해마 구조, 특히 치상회(dentate gyrus)의 자궁 외 전기천공(ex utero electroporation)과 유기형 절편 배양(organotypic slice culture)이 이러한 도구를 제공합니다. 이 시스템을 사용하여 모자이크 결실을 생성하면 관심 유전자가 전구 세포 증식 또는 신경 분화와 같은 세포 자율 발달 과정을 조절하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 또한, 삭제된 유전자 또는 그 표적 유전자를 다시 도입하여 표현형의 구제를 용이하게 합니다. 자궁 전기천공법(in utero electroporation)과 대조적으로, 자궁외 접근법은 치상회(dentate gyrus)와 같은 뇌의 더 깊은 층을 성공적으로 표적으로 삼는 속도를 향상시킵니다. 전반적으로, 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation)과 유기형 절편 배양(organotypic slice culture)은 내인성 조건을 반영하는 반(半)네이티브 환경에서 조절 메커니즘을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

전사 인자의 Bcl11b 삭마 전구 세포 증식 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 감소 된 크기와 셀 번호의 결과 신경 세포 분화의 손상을 야기한다. 또한 돌연변이 신경 세포는 학습과 기억 손상 (8)의 원인이되는 해마 회로에 통합하는 데 실패. 전 자궁의 전기가 사용되었다 이러한 과정에서 Bcl11b의 규제 메커니즘 (들)에 대한 질문에 대답합니다. 문제를 해결하는 데는 Bcl11b 세포 자율적으로 E15.5에 Bcl11b 플록스 / 플록스 해마로, Bcl11b의 모자이크 삭제를 GFP- Cre 호텔 재조합 효소의 구조 나 혼자 GFP (11)의 전 자궁 전기에 의해 생성 된 신경 세포 분화를 조절 Organotypic 슬라이스 문화까지 다음 여부 전기로부터 18 일 (그림 2A, B,이 그림 8에서 수정 된)...

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

이 절차의 전반적인 목표는 치상회(dentate gyrus)의 단일 세포를 표지 및 변형하고 이들의 발달 과정을 추적하는 것입니다. 이는 먼저 배아기 15.5일 또는 18.5일에 뇌의 한쪽 반구에 DNA를 주입함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 주입된 DNA를 발달 중인 치상회 영역으로 전기천공하는 것입니다.다음으로 진동 절단기(vibrator)를 사용하여 뇌 절편을 준비하고, 이 뇌 슬라이스를 최대 14일 동안 배양합니다. 마지막 단계는 적절한 항체를 사용하여 뇌 슬라이스를 면역형광 염색하는 것입니다. 최종적으로, 공초점 면역형광 현미경을 사용하여 발달 중인 치상회(dentate gyrus)의 변형된 과립 세포의 변화를 관찰합니다.이 방법은 서로 다른 뇌 영역에서 특정 신경 세포의 발달 과정 중 특정 유전자의 역할과 같이 신경생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 연구의 경우, 뇌회 발달 과정에서의 BC 11 B 전사 인자를 다룹니다. 안락사시킨 마우스의 자궁을 절개하여 배아를 적출함으로써 실험 절차를 시작하십시오.이를 얼음 위에 놓인 15 to 20 milliliters의 차가운 complete HBSS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 그다음 가위를 사용하여 각 배아를 자궁각에서 분리합니다. 이어서 차가운 complete HBSS가 담긴 두 번째 페트리 접시에 넣고 해부 현미경 하에서 자궁 근육벽을 절단합니다.난황낭과 태반으로부터 배아를 조심스럽게 분리합니다. 그 후, 본드 가위를 사용하여 앞다리 바로 윗부분을 60도 각도로 절단하여 배아의 머리를 제거합니다.실험에 배아의 유전자형 분석이 필요한 경우, 게놈 DNA 분리를 위해 조직 샘플을 수집하십시오. 그런 다음 머리를 깨끗하고 건조한 페트리 접시에 옮깁니다. 머리가 60도 각도로 절단되었기 때문에, 등 쪽이 위로 향하게 놓았을 때 한쪽으로 기울어져야 합니다.이제 바늘을 bgma 근처의 반구 중앙에 조심스럽게 배치하십시오. 피코 스프리처(pico spritzer)의 페달을 밟아 약 2~3 µL의 DNA 용액을 주입합니다. 펄스당 30 pounds의 압력을 10~15 milliseconds 동안 가하여 주입하십시오.펄스 사이에 1초의 간격을 두고 5~8회의 펄스를 가합니다. 전극을 배치하기 전, 배아 머리 부분에 complete HBSS를 몇 방울 도포합니다. 그 다음, 음극은 주입된 뇌실과 같은 쪽에, 양극은 배아 머리의 귀 아래쪽인 주입된 뇌실의 반대편에 전극을 배치합니다. 이어서 50V의 펄스를 5회 가합니다.전기천공 후, 배아의 머리를 15~20 mL의 차가운 완전 HBSS 용액이 담긴 디쉬에 넣습니다. 배아 머리에서 피부를 벗겨냅니다.그 다음 두개골 정중선의 소뇌 중앙부에 작은 절개를 만듭니다. 절개 부위에 스프링 가위를 삽입하고 시상 봉합선을 따라 세로로 절개합니다. 두개골을 벗겨내어 뇌를 분리합니다.그동안 4% LMP agar rose를 peel away 몰드에 붓고 상온에서 굳힌 후 떼어냅니다. 작은 스쿱 스패튤라를 사용하여 HBSS가 완전히 채워진 용기에서 뇌를 꺼내고, 미세 조직지나 chem wipe로 과도한 HBSS를 제거합니다. 전체 뇌를 agar rose에 조심스럽게 넣고 미세 바늘을 사용하여 위치를 조정합니다.한천 로즈가 응고되고 블록이 섹션될 때까지 몰드를 얼음 위에 보관하십시오. 이제 LMP 한천 블록을 다듬고 순간접착제를 사용하여 시료 스테이지에 접착하십시오. 접착제가 마르면 시료 스테이지를 진동기의 버퍼 트레이로 옮기십시오.블록이 용액에 잠길 때까지 얼음처럼 차가운 완전 HBSS를 채웁니다. 절편 제작을 위해 진동 절단기의 설정을 적절하게 맞춥니다. 후뇌부터 시작하여 원하는 조직이 포함된 절편을 느린 속도로 절단하고, 대뇌에서 5~7개의 절편을 수집합니다.그다음 절편들을 5 mL의 차가운 완전 HBSS가 들어 있는 깨끗한 6-웰 배양 접시로 옮기고, 모든 절편이 수집될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 이어서 1.8 mL의 슬라이스 배양 배지가 들어 있는 6-웰 플레이트에 멤브레인 인서트를 배치합니다. 절편의 방향 설정을 용이하게 하기 위해, 절편을 멤브레인 위에 올리기 전 100 µL의 완전 HBSS를 사용하여 멤브레인을 십자 모양으로 적셔줍니다.그 다음, 절편들을 멤브레인으로 옮깁니다. 한 장의 멤브레인에 최대 5개의 절편을 올리되, 절편들이 서로 겹치지 않도록 합니다. 피펫을 사용하여 멤브레인 위의 과잉 HBSS를 제거합니다.배양 접시를 37°C, 5% CO2 조건에서 in vitro로 11일 또는 14일 동안 배양하고, 이틀마다 배지의 절반을 교체합니다. 이 단계에서, 배양 시작 후 처음 20시간 동안 증식하는 세포를 표지하기 위해 bromo deoxyuridine과 같은 시약을 배지에 첨가합니다. 이 단계에서는 깨끗하고 날카로운 메스 날을 사용하여 절편의 방향에 맞춰 막을 다듬습니다.막과 함께 절편을 4% PFA 1 mL가 담긴 24-웰 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 1 XPBS로 15분씩 3회 세척합니다. 그 후, 투과성 용액과 함께 4°C에서 완만하게 교반하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 투과성 용액으로 희석한 적절한 1차 항체와 함께 4°C에서 완만하게 교반하며 하룻밤 또는 48시간 동안 배양합니다.그 후, 섹션을 1X PBS로 15분 동안 세 번 세척하고, 희석된 투과성 용액 및 적절한 2차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 섹션을 1X PBS로 15분 동안 한 번 세척한 다음, 마지막으로 DAPI 염색을 10분 동안 수행합니다. 섹션을 1X PBS로 15분씩 세 번 세척하고 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 면역 봉입제를 추가하고 부드럽게 덮습니다.절편 위에 커버슬립을 덮습니다. 슬라이드를 4 °C에서 하룻밤 동안 건조시킨 후, 네일 폴리시로 밀봉하고 공초점 현미경으로 분석합니다. 여기에서는 한쪽 반구에 GFP를 발현하는 DNA를 주입한 후, 전기천공법 시행 18.5일째에 면역 염색을 진행한 모습이 나타나 있습니다.이 이미지는 DPI 염색 결과를 보여주며, GFP 염색 결과와 병합된 이미지가 여기에 나타나 있습니다. 이 그림은 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation) 후 기관 배양 슬라이스(organotypic slice culture)를 통해 BCL11B의 모자이크 결실을 보여줍니다. 절편은 GFP와 NeuroD를 인식하는 항체를 사용하여 면역 염색되었으며, 삽입도는 GFP와 BCL11B를 나타냅니다. 고배율 염색 결과, Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 세포에서 BCL11B 발현이 소실되었음을 확인할 수 있습니다.GFP, neuro D 및 GFP neuro D 양성 세포에 대한 통계 분석 결과입니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 배아 4개를 대상으로 2시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 이 실험 절차를 수행하는 동안 조직을 주의 깊게 다루고 오염을 방지하는 것이 중요합니다.

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 주변 신경 가지의 재배와 시간 경과 영상을위한 중간 회임 마우스 배아의 organotypic 조각을 준비하는 방법을 제시한다.

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배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

우리는 마우스 전뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양에서 유전자 로 코딩된 FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 동적 이미징을 위해이 센서를 사용하는 방법을 보여줍니다.

FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

이 프로토콜은 배아 마우스 뇌에서 1 차적인 해마 뉴런을 배양하기위한 방법을 설명합니다. 배양된 뉴런의 세포외 표면에 있는 주요 조직적합성 복합 클래스 I의 발현은 유동 세포 측정 분석에 의해 평가된다.

유동 세포에 의한 주요 조직 적합성 복합 클래스 1의 표현 평가

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

배우세요 마우스 해마 치아회(dentate gyrus) 단일 세포의 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 ex utero 전기천공 및 오가노타이픽 슬라이스 배양 기법을 통해 신경발달 과정을 실시간으로 추적하고 분석하는 방법을.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

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