마우스에서의 높은 수준의 안정적인 골수 키메라를 생성하기위한 에이전트로서 골수 억제 술판

이 절차의 전반적인 목표는 수용 마우스의 골수 구획을 녹색 형광 단백질을 유비쿼터스하게 발현하는 기증자 마우스의 골수 세포로 교체하는 것입니다. 방사선이 없는 경우. 이것은 먼저 골수억제 화합물인 부살란(busalan)의 연속적인 복강내 주사로 수용 마우스를 컨디셔닝함으로써 달성됩니다.

다음으로, 골수 세포는 기증자 마우스의 대퇴골과 경골에서 분리되어 유비쿼터스하게 녹색 형광 단백질을 발현합니다. 마지막으로, 기증자 골수 세포는 꼬리 정맥 주사를 통해 조건화된 수용 마우스에 이식됩니다. 최종적으로, 이식된 마우스에서 혈액을 채취하고 유세포 분석으로 분석하여 골수 차임의 범위를 추정합니다.

전신 조사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전신 조사의 세포 독성 효과와 전문 시설 및 장비 없이도 높은 수준의 골수 차임을 설정할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 사용하면 골수 유래 세포가 중추 신경계에 축적되는 것을 파악할 수 있을 뿐만 아니라 조혈 계통 발달, 면역생물학 및 백혈병과 같은 연구 주제를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 수혜자 마우스를 컨디셔닝하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 희석된 부설판을 준비하고 IP 주입을 사용하여 수혜자 마우스에게 매일 킬로그램당 20mg을 투여합니다.

기관 지침에 따라 쥐를 안락사시킨 후 층류 후드 아래에서 쥐에게 70% 에탄올을 살포합니다. 복부의 피부를 들어 올리고 수술 용 가위로 복강에서 피부를 절개하여 다리를 따라 발을 잡고 발목쪽으로 절개합니다. 발목에서 엉덩이 쪽으로 피부를 단단히 당겨 다리 조직을 노출시킵니다.

대퇴골의 근육과 지방을 제거하여 고관절을 드러내면서 발을 부드럽게 당깁니다. 다리를 뻗으려면 대퇴골 머리 바로 위를 자른 골반 뼈에 가위를 대고 대퇴골 자체를 자르지 않도록 주의합니다. 무균 상태를 유지하려면 다리를 발로 잡고 가위와 오토클레이브 조직을 사용하여 뼈 표면을 문질러 대퇴골에 남아 있는 조직을 청소합니다.

무릎 관절을 잘라 대퇴골과 경골을 분리하고 대퇴골을 얼음 위에서 PBS 배양이 들어있는 배양 접시에 놓습니다. 다음으로, 비골이 경골에 연결되는 지점을 절개하여 비골을 제거하고 버립니다. 그런 다음 경골을 청소하십시오.

붉은 골수가 끝나는 경골을 잘라 발을 제거하고 경골을 대퇴골과 함께 배양 접시에 넣고 얼음 위에서 배양합니다. 집게를 사용하여 대퇴골을 잡고 수술용 가위로 뼈의 말단부를 조심스럽게 면도합니다. 3ml의 멸균 PBS로 수질강을 노출시키는 데 필요한 만큼 뼈를 제거합니다.

주사기를 채우고 23 게이지 바늘을 부착합니다. 조심스럽게 바늘을 골수강에 뚫고 골수를 멸균 배양 접시에 씻어냅니다. 발치 후 원하는 모든 세포를 제거할 수 있도록 바늘 끝을 사용하여 수질강을 긁어냅니다.

빨간색 골수가 더 이상 보이지 않고 뼈가 흰색으로 나타나는지 확인합니다. 집게를 사용하여 경골을 잡고 수술용 가위로 경골이 무릎에 부착된 끝을 조심스럽게 면도합니다. 수질강을 노출시키려면 주사기에 3ml의 멸균 PBS를 채우고 25게이지 바늘을 부착합니다.

조심스럽게 바늘을 골수강에 뚫고 골수를 대퇴골에서 고인 골수 접시에 씻어냅니다. 1ml의 피펫 팁으로 골수를 부드럽게 절단하여 세포를 분리합니다. 40미크론 바스켓 필터를 통해 세포 현탁액을 멸균 50ml 원심분리 튜브에 통과시킵니다.

PBS를 사용하여 접시를 헹구어 남아 있는 세포를 제거하고 필터를 통해 버퍼를 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 PBS를 첨가하여 최종 부피 30-40ml를 제공하고 450배 G와 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다.

펠릿을 3ml의 적혈구 용해 완충액으로 재현탁시키고 8.5분 동안 얼음 위에서 배양합니다. 그 후, 약 30ml의 멸균 PBS를 첨가하여 용해 완충액 원심분리기를 담금질하고 상층을 폐기합니다. 1ml의 멸균 PBS를 사용하여 펠릿을 다시 넣고 얼음에 보관하십시오.

PBS를 사용하면 소량의 세포 균질액을 희석하고 혈구 분석기를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포 현탁액을 8배, 10배, 밀리리터당 6개의 세포로 희석하고 주입할 때까지 얼음 위에서 배양합니다. 골수 이식을 수행하려면 0.5ml 주사기에 300마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 추가합니다.

주입할 각 마우스에 대해 기포를 제거해야 합니다. 조절된 수용 마우스가 있는 마우스 케이지를 가열 패드에 놓고 측면 꼬리 정맥이 확장되도록 합니다. 수혜자 마우스를 적절한 크기의 구속 장치에 넣고 70% 에탄올을 적신 수술용 거즈로 꼬리를 닦고 꼬리를 단단히 잡고 경사를 위로 한 상태에서 바늘을 측면 꼬리 정맥 중 하나에 부드럽게 삽입하고 세포 현탁액을 주입합니다.

출혈이 멈출 때까지 주사 부위에 수술용 거즈를 잡습니다. 골수 이식 후 약 2-3주 후에 마우스를 새롭고 깨끗한 케이지에 넣기 전에 마우스를 구속 튜브에 넣고 뒤쪽 다리의 털을 면도하여 측면 복재 정맥을 노출시킵니다. 다음으로, 다리에 바셀린을 얇게 바르고 25게이지 바늘을 사용하여 헤파린으로 코팅된 모세관 튜브로 복재 정맥을 뚫습니다.

약 50마이크로리터의 혈액을 채취한 다음 수술용 거즈를 사용하여 출혈을 멈춥니다. 출혈이 멈추면 마우스를 케이지로 다시 돌려보냅니다. 1ml의 팩스 버퍼가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브에 혈액을 추가합니다.

튜브를 반전으로 혼합하고 얼음 위에 보관하고 혈액 샘플을 900배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 버린 후 500마이크로리터의 적혈구 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 재현탁하고 얼음에서 8.5분 동안 배양합니다. 그런 다음 1ml의 팩스 버퍼를 추가하여 용해 버퍼를 담금질하고 900배 G에서 5분 동안 원심분리합니다.

두 번째로 용해하고 회전한 후 텍스트 프로토콜에 따라 펠릿이 이제 흰색인지 확인하십시오. 빨간색이면 용해 단계를 세 번째로 반복합니다. 펠릿을 팩스 버퍼에 현탁시키고 유세포 분석을 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 정량화합니다.

이 그래프는 syngeneic 골수 이식에 성공한 부살란 kg당 100mg을 투여한 마우스와 동종 골수 이식에 실패한 부살란 1kg당 80mg을 투여한 마우스의 말초 혈액에서 매주 정량화된 키메라 수치를 보여줍니다. 골수 이식 후 3-4주가 지나면 일반적으로 80% 이상의 수치가 확립되며, 다음은 골수 이식 후 3주 후에 골수 이식의 성공과 실패를 보여주는 말초 혈액의 대표적인 사실입니다. 이 유세포 분석 데이터는 골수에서 최소 1년 동안 높은 수준의 차임이 확립되어 있으며 비히클을 통한 컨디셔닝이 골수 차임을 유도하기에 충분하지 않다는 것을 보여줍니다.

골수 수치에는 큰 차이가 없지만, 킬로그램 당 60-100 밀리그램의 부설판 GFP 양성 세포를 사용하여 얻은 골수 차임은 복용량 의존적 방식으로 중추 신경계 내에 축적됩니다. 이 숫자는 야생형 마우스에서 척수의 요추 영역 내에서 GFP 양성 골수 유래 세포 축적을 설명하며, 신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에서는 위축성 측삭 경화증이 더 크다. 이 절차를 시행할 때 이식 거부 가능성을 최소화하기 위해 동성인 syngeneic 수혜자와 기증자 마우스를 사용하는 것이 중요합니다.

유세포 분석 및 면역조직화학과 같은 다른 방법을 사용하여 골수 유래 세포가 중추 신경계로 들어가는 메커니즘을 연구할 수 있습니다.