마우스에서의 높은 수준의 안정적인 골수 키메라를 생성하기위한 에이전트로서 골수 억제 술판

이 절차의 전반적인 목표는 수용자 마우스의 골수 구획을 녹색 형광 단백질을 보편적으로 발현하는 공여 마우스의 골수 세포로 교체하는 것입니다. 방사선 조사 없이, 이는 먼저 골수 억제 화합물인 busalan을 복강 내로 연속 주사하여 수용자 마우스를 컨디셔닝함으로써 달성됩니다.

다음으로, 녹색 형광 단백질을 보편적으로 발현하는 공여 마우스의 대퇴골과 경골에서 골수 세포를 분리합니다. 마지막으로, 공여 골수 세포를 꼬리 정맥 주사를 통해 전처리가 완료된 수혜 마우스에 이식합니다. 최종적으로, 이식된 마우스에서 혈액을 채취하고 유세포 분석법으로 분석하여 골수 키메리즘의 정도를 추정합니다.

전신 조사와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 전신 조사의 세포 독성 효과 없이도 높은 수준의 골수 키메리즘을 구축할 수 있으며, 특수 시설과 장비가 필요하지 않다는 점입니다. 이 방법은 골수 유래 세포가 중추 신경계로 축적되는 과정을 파악할 수 있게 할 뿐만 아니라, 조혈 계통의 발달, 면역 생물학 및 백혈병과 같은 연구 주제를 분석하는 데에도 활용될 수 있습니다. 수용 마우스를 컨디셔닝하려면 텍스트 프로토콜에 따라 희석된 busulfan을 준비하고, 수용 마우스에게 매일 kg당 20 mg을 복강 내 주사(IP injection)로 투여하십시오.

기관 가이드라인에 따라 마우스를 안락사시킨 후, 라미나 플로우 후드 내에서 마우스에 70% ethanol을 분무합니다. 복부의 피부를 들어 올리고 외과용 가위로 복강에서부터 발을 잡은 상태로 발목 방향의 다리까지 피부를 절개합니다. 발목에서 엉덩이 방향으로 피부를 강하게 잡아당겨 다리 조직을 노출시킵니다.

발을 부드럽게 당기면서 대퇴골에서 근육과 지방을 제거하여 고관절을 노출시킵니다. 다리를 펴기 위해 가위를 골반뼈에 대고 대퇴골두 바로 윗부분을 절단하되, 대퇴골 자체가 잘리지 않도록 주의하십시오. 멸균 상태를 유지하기 위해 발을 잡아 다리를 고정하고, 가위와 오토클레이브 조직물을 사용하여 대퇴골에 남은 조직을 긁어내어 뼈 표면을 깨끗이 정리하십시오.

무릎 관절을 절단하여 대퇴골과 경골을 분리하고, PBS가 담긴 배양 접시에 대퇴골을 넣은 후 얼음 위에서 배양합니다. 다음으로, 비골과 경골이 연결된 지점을 절단하여 비골을 제거하고 폐기합니다. 그 후 경골을 세척합니다.

적색 골수가 끝나는 지점의 경골을 절단하여 발을 제거하고, 경골을 대퇴골과 함께 배양 접시에 넣은 후 얼음 위에서 배양합니다. 포셉으로 대퇴골을 잡고 외과용 가위로 뼈의 원위단 끝부분을 조심스럽게 깎아냅니다. 3 mL의 멸균 PBS를 사용하여 골수강이 노출될 때까지 필요한 최소한의 뼈만 제거합니다.

주사기에 액체를 채운 후 23게이지 바늘을 장착합니다. 바늘을 골수강 내로 조심스럽게 삽입하여 골수를 멸균 배양 접시에 씻어 넣습니다. 추출 후 원하는 세포가 모두 제거될 수 있도록 바늘 끝을 이용해 골수강 내부를 긁어냅니다.

적골수가 더 이상 보이지 않고 뼈가 하얗게 보일 때까지 확인하십시오. 포셉을 사용하여 경골을 잡고, 수술용 가위로 경골이 무릎에 부착되었던 끝부분을 조심스럽게 깎아냅니다. 골수를 노출시키기 위해, 주사기에 3 mL의 멸균 PBS를 채우고 25 gauge 바늘을 장착하십시오.

바늘을 골수강에 조심스럽게 찔러 넣어 골수를 대퇴골 통합 골수 접시로 밀어냅니다. 1 mL 피펫 팁을 사용하여 골수를 부드럽게 분쇄해 세포를 해리시킵니다. 세포 현탁액을 40 µm 바스켓 필터에 통과시켜 멸균된 50 mL 원심분리 튜브에 담습니다.

PBS를 사용하여 디시를 헹궈 남은 세포를 모두 회수하고, 필터를 통해 버퍼를 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브에 PBS를 추가하여 최종 부피를 30~40 mL로 맞춘 후, 450 ×g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 제거하고 버립니다.

펠릿을 3 mL의 적혈구 용혈 버퍼(erythrocyte lysing buffer)로 재현탁하고 얼음 위에서 8.5분 동안 배양합니다. 이어서, 용혈 버퍼를 중단시키기 위해 멸균된 PBS 약 30 mL를 첨가한 후 원심분리하여 상층액을 제거합니다. 멸균된 PBS 1 mL를 사용하여 펠릿을 재현탁하고 얼음 위에 보관합니다.

PBS로 세포 균질액을 소량 희석한 후, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 세포 현탁액을 mL당 8 × 10⁶ cells가 되도록 희석하고, 주입 전까지 얼음 위에서 배양합니다. 골수 이식을 수행하기 위해, 희석된 세포 현탁액 300 µL를 0.5 mL 주사기에 넣습니다.

주입할 각 마우스에 대해 공기 방울을 반드시 제거하십시오. 컨디셔닝된 수용 마우스가 들어 있는 마우스 케이지를 가열 패드 위에 올려 꼬리 외측 정맥이 확장되도록 합니다. 수용 마우스를 적절한 크기의 보정 기구에 넣고 70% ethanol에 적신 외과용 거즈로 꼬리를 닦아냅니다. 꼬리를 단단히 잡고 바늘의 사면(bevel)이 위를 향하게 하여 꼬리 외측 정맥 중 하나에 부드럽게 삽입한 후 세포 현탁액을 주입하십시오.

출혈이 멈출 때까지 주사 부위에 수술용 거즈를 대고 있습니다. 골수 이식 후 약 2~3주가 지나 마우스를 새로운 깨끗한 케이지로 옮기기 전에, 마우스를 보정 튜브에 넣고 뒷다리의 털을 깎아 외측 복제정맥을 노출시킵니다. 다음으로 다리에 바세린을 얇게 바르고, 25 gauge 바늘을 사용하여 헤파린 코팅 모세관으로 복제정맥을 천자합니다.

약 50 µL의 혈액을 채취한 후, 외과용 거즈를 사용하여 지혈합니다. 지혈이 완료되면 마우스를 다시 케이지로 돌려보냅니다. 채취한 혈액을 1 mL의 fax buffer가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 첨가합니다.

튜브를 뒤집어 섞은 후 얼음 위에 보관하고, 혈액 샘플을 900 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하여 버린 후, 500 µL의 적혈구 용혈 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁하고 얼음 위에서 8.5분 동안 배양합니다. 이어서, 1 mL의 fax 버퍼를 첨가하여 용혈 버퍼를 중화시키고 900 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 두 번째 용해 및 원심분리를 수행한 후, 펠렛이 흰색으로 변했는지 확인하십시오. 만약 펠렛이 붉은색이라면 용해 단계를 세 번째로 반복하십시오. 펠렛을 fax 완충액에 현탁하고 유세포 분석법을 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 정량화하십시오.

이 그래프는 100 mg/kg의 busulfan으로 전처치 후 동종 골수 이식에 성공한 마우스와 80 mg/kg의 busulfan으로 전처치 후 동종 이식에 실패한 마우스의 말초혈액에서 매주 정량화한 키메리즘 수준을 보여줍니다. 일반적으로 골수 이식 후 3~4주면 80% 이상의 키메리즘 수준이 확립되며, 여기에 제시된 데이터는 골수 이식 3주 후 성공 및 실패 사례를 보여주는 말초혈액의 대표적인 결과 데이터입니다. 이 유세포 분석 데이터는 골수 내에서 높은 수준의 키메리즘이 최소 1년 동안 유지되며, vehicle만으로 전처치하는 것은 골수 키메리즘을 유도하기에 충분하지 않음을 보여줍니다.

60에서 100 mg/kg의 busulfan 용량을 사용하여 달성한 골수 제거 수준에는 유의미한 차이가 없으나, GFP 양성 세포는 용량 의존적인 방식으로 중추신경계 내에 축적됩니다. 이 그림은 야생형 마우스의 척수 요추 부위와 신경퇴행성 질환인 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 마우스 모델에서 더 광범위하게 나타나는 GFP 양성 골수 유래 세포의 축적을 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때, 이식 거부 반응의 가능성을 최소화하기 위해 동일한 성별의 동종 수여 및 공여 마우스를 사용하는 것이 중요합니다.

골수 유래 세포가 중추신경계로 진입하는 메커니즘을 연구하기 위해 유세포 분석 및 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 활용할 수 있습니다.